本申请是申请日为2005年11月18日、发明名称为“治疗眼病的方 法和组合物”、申请号为200580046731.9的中国专利申请的分案申请。
资助
本发明受美国政府支持，享有国立卫生研究院NIH-K25HG000060 和NIH-R01EY015771的资助。美国政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2004年11月18日的美国临时申请No. 60/629,363、申请日为2005年2月2日的美国临时申请No.60/649,479 以及申请日为2005年4月18日的美国临时申请No.60/672,346的权益。 所引用的这些临时申请各自的教导在此全部引入作为参考。
技术领域
本发明涉及疾病的治疗，具体涉及治疗眼病的方法和组合物。
背景技术
在发达国家中，年龄相关的黄斑变性(AMD)是年龄相关性失明的 主要原因。其发病率随着寿命延长和老年人口增多而增高(D.S. Friedman et al.，Arch Ophthalmol 122，564(2004))。这是一种慢性疾病， 特征在于视网膜中央区域(黄斑)的进行性损坏，引起中央视野视力损 失(J.Tuo，C.M.Bojanowski，C.C.Chan，Prog Retin Eye Res 23，229 (2004))。AMD的一个关键特征是形成被称为玻璃疣(drusen)的细胞 外沉积，其集中在视网膜后面介于视网膜色素上皮细胞(RPE)与脉络 膜之间的黄斑中及其周围。迄今，尚未有这种疾病的治疗被证明广泛有 效，尤其是对于其晚期形式。若干风险因素与AMD相关，包括年龄、 吸烟和家族史(AREDS Research Group，Ophthamology 107，2224 (2000))。已进行了候选基因关联性研究和基因组范围连锁扫描来鉴定 AMD的遗传风险因子。基于与其它视网膜疾病的关联性或其已知功能， 提出了许多候选基因。尽管有些这些基因中的一些稀有变体与疾病表型 相关，但未观察到可解释大比例总体发病率的遗传差异(J.Tuo，C.M. Bojanowski，C.C.Chan，Prog Retin Eye Res 23，229(2004))。迫切需要 关于AMD遗传决定子的更多信息。
发明内容
本发明涉及鉴定与AMD易感性相关的人基因中的变异，其可用于 鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体，并可用于诊断或辅助诊断 AMD。其还涉及鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法，诊断 或辅助诊断AMD的方法，用于这些方法中的多核苷酸(如，探针、引 物)，包含探针或引物的诊断试剂盒，治疗有AMD风险或患有AMD的 个体的方法，以及用于治疗有AMD风险或患有AMD的个体的组合物。
在一种实施方案中，本发明提供用于检测或辅助检测与人发生 AMD相关的CFH基因的多核苷酸，以及在一些具体实施方案中，用于 检测或辅助检测与人AMD相关的CFH基因的变异。在另一种实施方 案中，本发明提供用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法 和组合物。在另一种实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗患 AMD或有发生AMD风险的个体。本公开还提供用于检测来自个体的 样品中变体CFH基因的诊断试剂盒。这样的试剂盒可用于鉴定或辅助 鉴定有患AMD风险的个体，以及用于诊断或辅助诊断个体中的AMD。
在一种实施方案中，本发明提供用于检测变体CFH基因的分离多 核苷酸；该分离多核苷酸包含特异性检测与人发生AMD相关的CFH 基因中的变异。分离多核苷酸可用于在来自个体的样本中检测与人 AMD相关的变体CFH基因。本发明的多核苷酸进一步可用于等位基因 -特异性分析(如，本领域已知的等位基因-特异性杂交，引物延伸， 或连接分析)，从而检测与发生AMD相关的CFH基因变异。等位基因 -特异性探针和引物可与一种基因的一种或多种等位基因特异性杂交 而不与同一基因的其它等位基因杂交。例如，本发明的等位基因-特异 性多核苷酸探针可与变体CFH基因杂交但不与野生型CFH基因杂交。 在某些实施方案中，所述分离多核苷酸是在严谨条件下与人发生AMD 相关的CFH基因中变异相杂交的探针。在一些具体实施方案中，本发 明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基因的全部或部分、 或其等位基因变体的核酸分子相杂交，其中所述核酸分子包含与人发生 AMD相关的变异。在另一些实施方案中，本发明的分离多核苷酸探针 在严谨条件下与包含CFH基因的至少10个连续核苷酸、或其等位基因 变体的核酸分子相杂交，其中所述核酸分子包含与人发生AMD相关的 变异。在另一些实施方案中，所述分离多核苷酸是在严谨条件下与人发 生AMD相关的CFH基因变异的邻近、上游或下游相杂交的引物。在 某些实施方案中，本发明的分离多核苷酸引物为至少10个核苷酸长度 并杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的一侧或另一侧。所述 多核苷酸可含有变化形式，比如一个或多个核苷酸替换、增加或缺失， 只要它们以相同的特异性程度与其靶标变体CFH基因相杂交。如本文 所用，当与核酸连用时，术语“分离”是指已鉴定且与其天然来源中通 常相伴的至少一种污染核酸分离开的核酸序列。相反，非分离核酸是以 天然存在状态发现的核酸比如DNA和RNA。
本文所述多核苷酸(如，多核苷酸探针或多核苷酸引物)可以是DNA 或RNA。所述多核苷酸可以是单链或双链的。本发明的多核苷酸探针 和引物可以是约5个核苷酸-约3000个核苷酸。在一些实施方案中， 本发明的多核苷酸探针和引物为约8个核苷酸-约500个核苷酸。在另 一些实施方案中，本发明的多核苷酸探针和引物为约10个核苷酸-约 250个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸探针和引物为约 20个核苷酸(如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29或30个核苷酸)。在另一些实施方案中，所述多核苷酸探针 和引物为约50-约100个核苷酸(如，45、50、55、60、65、75、85 或100个核苷酸)。所述多核苷酸可包含一个或多个非天然或经修饰的 核苷酸。非天然或经修饰的核苷酸包括但不限于放射性标记、荧光标记 或化学标记的核苷酸。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸引物杂交至与人发生AMD 相关的CFH基因变异的上游或下游。在一种实施方案中，所述多核苷 酸杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的附近。例如，杂交可 以以这样的方式发生：少于10个核苷酸将变异和邻近该变异的杂交引 物末端之间分离开。在另一种实施方案中，杂交以这样的方式发生：1-3 个核苷酸将变异和邻近该变异的杂交引物末端之间分离开。在某些其它 实施方案中，所述多核苷酸引物杂交至紧邻变异处。在另一种实施方案 中，本发明的多核苷酸引物杂交时距与人发生AMD相关的CFH基因 变异一定距离(如，至少10个核苷酸)。例如，杂交可以以这样的方式 发生：邻近变异的杂交引物末端距CFH基因中变异为10、25、50、100、 250、1000、5000或高达10,000个核苷酸。本文所述的发明还涉及成对 多核苷酸引物，其特异性检测与人发生AMD相关的CFH基因中变异， 其中第一多核苷酸引物杂交至该变异的一侧而第二多核苷酸引物杂交 至该变异的另一侧。杂交至包含与人发生AMD相关的CFH基因中变 异的DNA区域的一对多核苷酸引物可以以这样的方式杂交至该区域： 邻近变异的杂交引物末端距离约20-约10,000个核苷酸。作为替代， 杂交至包含与人发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的成对多 核苷酸引物可以以这样的方式杂交至该区域：邻近变异的杂交引物末端 距离约100-约7,500个核苷酸，或距离约200-约5,000个核苷酸。
在另一种实施方案中，本文所述的发明提供用于区分两种CFH等 位基因(例如，野生型等位基因和与人发生AMD相关的等位基因)的 三种或更多种多核苷酸引物。第一引物杂交至两种等位基因共同的核苷 酸序列，比如与发生AMD相关的CFH基因变异的上游或下游的非等 位核苷酸序列。第二引物特异性杂交至第一等位基因独特的序列(如， 与人发生AMD相关的CFH基因变异)。第三引物特异性杂交至第二等 位基因独特的序列(如，野生型CFH基因)。三种引物的这种组合引起 DNA区域的扩增，这取决于样品中存在何种CFH等位基因。例如，如 果CFH基因具有与发生AMD相关的CFH基因变异则扩增一个DNA 区域，如果样品中存在野生型CFH基因则扩增另一个区域。作为替代， 该组合的两种引物可杂交至CFH基因的两种等位基因共有的核苷酸序 列，比如处于与人发生AMD相关的CFH基因变异的上游和下游的非 等位核苷酸序列，以及第三引物特异性杂交至CFH基因的两种等位基 因之一(比如野生型等位基因或与人发生AMD相关的等位基因)。
通过本文所述的方法和组合物可检测使个体易患AMD的许多CFH 基因变异。在一个具体实施方案中，该变异在CFH蛋白质第402位处 编码组氨酸以外的氨基酸。在一个具体实施方案中，该变异在CFH蛋 白质第402位处编码酪氨酸。在另一种实施方案中，该变异在CFH蛋 白质第62位处编码缬氨酸以外的氨基酸。在一个具体实施方案中，该 变异在CFH蛋白质第62位处编码异亮氨酸。在另一些实施方案中，本 文所述的方法和组合物可用于检测使个体易患AMD的CFH基因变异， 比如表4、5和7中所列的那些。例如，其它变异基因，比如所述变异 位于编码区的那些(例如编码以下的变异：在CFH蛋白第58位处编码 丝氨酸以外的氨基酸，比如丙氨酸；在CFH蛋白第127位处编码精氨 酸以外的氨基酸，比如组氨酸；在CFH蛋白第400位处编码谷氨酰胺 以外的氨基酸，比如赖氨酸；在CFH蛋白质第609位处编码缬氨酸以 外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第890位处编码丝氨酸以外 的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第936位处编码谷氨酸以外的 氨基酸，比如天冬氨酸；在CFH蛋白第1007位处编码缬氨酸以外的氨 基酸，比如亮氨酸；在CFH蛋白第1050位处编码天冬酰胺以外的氨基 酸，比如酪氨酸；在CFH蛋白第1166位处编码脯氨酸以外的氨基酸， 比如谷氨酰胺；在CFH蛋白第1210位处编码精氨酸以外的氨基酸，比 如半胱氨酸。参见表4、5和7)可使用本文所述方法和组合物进行检测。 作为替代，变异在非编码区中的变异基因，比如表4、5和7中所列的 那些，可使用本文所述的方法和组合物进行检测。如本文所用，术语“变 体CFH基因”是指包括与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA。 如本文所用，术语“野生型CFH DNA”和“野生型CFH基因”表示 不包括与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA。
本发明还涉及在从个体获得的样品中检测与人发生AMD相关的变 体CFH基因的方法。这样的方法可包括：(a)将样品与多核苷酸探针 相组合，所述探针在严谨条件下与与人AMD相关的CFH基因变异杂 交，但不与野生型CFH基因(野生型CFH DNA如上所述)杂交；和 (b)确定是否发生杂交。发生杂交则指示样品中存在与年龄相关黄斑 变性有关的变体CFH基因。用于本文所述方法中的样品可包含来自以 下的细胞：眼、耳、鼻、牙、舌、表皮、上皮、血液、泪、唾液、粘液、 尿道、尿液、肌肉、软骨、皮肤或从中可获得足够DNA或RNA的任何 其它组织或体液。可通过多种收集细胞的方式比如口腔拭子来收集样 品。必要时处理样品以提供可用于本文所述方法中进行分析的DNA或 RNA。例如，可以处理样品使得来自该样品的DNA可用于扩增或与另 一种多核苷酸杂交。所处理的样品可以是粗制裂解物，其中可用的DNA 或RNA未从其它细胞物质中纯化，或可以纯化所处理样品以分离可用 的DNA或RNA。可使用提供DNA或RNA用于本文所述方法进行分 析的本领域已知的任何方式处理样品。处理样品的方法包括但不限于， 裂解和/或纯化细胞和细胞裂解物的机械、化学或分子学方式。处理方 法例如可包括色谱法比如离子交换(如阳离子和阴离子)、体积排阻、 凝胶过滤、亲合以及疏水相互作用色谱，或超滤、电泳、以及使用对所 述多肽的特定表位有特异性的抗体进行的免疫亲合纯化。
在另一些实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人 发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法，其包括：(a)将 样品(称为测试样品)与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下 与与人发生AMD相关的CFH基因变异杂交，从而产生组合；(b)在 严谨杂交条件下维持步骤(a)中所产生的组合；和(c)将该组合中发 生的杂交与对照中的杂交进行比较。在所述组合中但不在对照中发生杂 交指示样品中存在与AMD相关的变体CFH基因。在另一实施方案中， 在将所述组合中发生的杂交与对照中杂交进行比较时确定杂交程度。对 照与测试样品相同并进行与测试样品同样的处理，只是其多核苷酸探针 不与与人发生AMD相关的CFH基因变异相结合。作为替代，所述多 核苷酸探针仅结合野生型CFH基因。对照可以依次或与上述组合同时 进行测试。作为替代，对照的结果可以在上述组合之前或之后的参考测 试中确立。用于对照的样品通常与测试样品为相同类型，并进行与测试 样品同样的处理，只是其所组合的多核苷酸不与CFH基因中与人发生 AMD相关的变异杂交。
在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人 发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法，其包括：(a)将 样品的第一部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与CFH 基因中与人发生AMD相关的变异杂交；(b)将样品的第二部分与多核 苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与野生型CFH基因杂交；和 (c)确定是否发生杂交。在第一部分中但不在第二部分中发生杂交指 示样品中存在与AMD相关的变体CFH基因。
在另一实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发 生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法，其包括：(a)将样 品与一对多核苷酸引物相组合，其中第一多核苷酸引物杂交至编码CFH 蛋白第402位氨基酸的DNA的一侧，第二多核苷酸引物杂交至编码 CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的另一侧；(b)扩增样品中的DNA， 由此产生扩增的DNA；(c)测序扩增的DNA；和(d)检测DNA中是 否存在在CFH蛋白第402位处编码组氨酸以外氨基酸的变异。所述变 异的存在指示在样品中检测到与人发生AMD相关的变体CFH基因。
在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人 发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法，其包括：(a)将 样品与一对多核苷酸引物相组合，其中第一多核苷酸引物杂交至编码 CFH蛋白第62位氨基酸的DNA的一侧，第二多核苷酸引物杂交至编 码CFH蛋白第62位氨基酸的DNA的另一侧；(b)扩增样品中的DNA， 由此产生扩增的DNA；(c)测序扩增的DNA；和(d)检测DNA中是 否存在在CFH蛋白第62位处编码组氨酸以外氨基酸的变异。所述变异 的存在指示在样品中检测到与人发生AMD相关的变体CFH基因。
本领域用于扩增核酸的任何已知方法均可用于本文所述方法。例 如，样品中的DNA可使用下列方法扩增：聚合酶链式反应(PCR)、 RT-PCR、定量PCR、实时PCR、快速扩增多态性DNA分析、快速扩 增cDNA末端(RACE)或滚环扩增。
在另一些实施方案中，本发明提供鉴定或辅助鉴定有患AMD风险 的个体的方法。在一种具体实施方案中，这样的方法包括分析从所述个 体获得的样品中是否存在与人发生AMD有关的变体CFH基因。变体 CFH基因的存在指示该个体有患AMD的风险。
在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方 法包括：(a)组合来自个体的样品与多核苷酸探针，该探针在严谨条件 下与CFH基因中与人发生AMD相关的变异杂交，但不与野生型CFH 基因杂交；以及(b)确定是否发生杂交。若发生杂交则表明个体有患 AMD的风险。
在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方 法包括：(a)从个体获得DNA；(b)测序包含编码CFH蛋白第402位 氨基酸的核苷酸的DNA区域；和(c)确定该DNA中是否存在这种变 异，该变异在CFH蛋白第402位编码组氨酸以外的氨基酸。所述变异 的存在指示个体有患AMD的风险。
在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方 法包括：(a)从个体获得DNA；(b)测序包含编码CFH蛋白第62位 氨基酸的核苷酸的DNA区域；和(c)确定该DNA中是否存在这种变 异，该变异在CFH蛋白第62位编码缬氨酸以外的氨基酸。所述变异的 存在指示个体有患AMD的风险。
在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人 发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多肽的方法。这样的方法包括： (a)将样品与抗体相组合，该抗体结合与人发生年龄相关黄斑变性有 关的变体CFH多肽；和(b)确定是否发生结合。若发生结合则指示样 品中存在与发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多肽。
在另一种实施方案中，本发明提供用于检测来自个体的样品中的变 体CFH基因的诊断试剂盒。诊断试剂盒例如可包含：(a)其中放置多 核苷酸探针的至少一个容器装置，该多核苷酸探针在严谨条件下与CFH 基因中与人发生AMD相关的变异杂交；和(b)使用诊断试剂盒用于 检测样品中变体CFH基因的标签和/或指导。
在另一种实施方案中，用于检测来自个体的样品中变体CFH基因 的诊断试剂盒例如可包含：(a)其中放置多核苷酸引物的至少一个容器 装置，该多核苷酸引物在严谨条件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性 有关的CFH基因变异的一侧附近；和(b)使用诊断试剂盒用于检测样 品中变体CFH基因的标签和/或指导。任选地，该诊断试剂盒还包含第 二多核苷酸引物，其在严谨条件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性有 关的CFH基因变异的另一侧。
本发明还涉及用于治疗患AMD的对象的组合物。在一个具体实施 方案中，用于治疗患AMD的对象的组合物包含有效量的分离或重组制 备的CFH多肽或其片段、以及药学可接受的载体。在一个具体实施方 案中，该CFH多肽或其片段抑制C3的活化。在另一个实施方案中， 本发明提供治疗患AMD的对象的方法，其包括向该对象施用有效量的 分离或重组制备的CFH多肽或其片段、以及药学可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗患AMD的对象的方法，其 包括向该对象施用有效量的分离或重组制备的编码CFH多肽或其片段 的核酸分子、以及药学可接受的载体。如本文所用，术语“有效量”是 指分离或重组制备的CFH核酸或多肽或包含CFH核酸或多肽的组合物 的量，其量足以治疗对象或治疗所述疾病本身。例如，有效量足以延迟、 减缓或预防AMD或相关症状的发作或进展。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗患AMD的对象的方法，其 包括向该对象施用有效量的分离或重组制备的编码CFH多肽或其片段 的核酸分子、以及药学可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有年龄相关黄斑变性 或有此风险的对象的组合物，其包含：(a)包含反义序列的核酸分子， 所述反义序列与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因或 mRNA杂交；和(b)药学可接受的载体。在某些实施方案中，反义序 列与变体CFH基因的杂交降低了从该变体CFH基因转录的RNA的量。 在某些实施方案中，反义序列与变体CFH mRNA的杂交降低了从该变 体CFH mRNA翻译的蛋白质的量，和/或改变了变体CFH mRNA的剪 接。包含与变体CFH基因或mRNA杂交的反义序列的核酸分子可包含 一个或更多个修饰核苷酸或核苷，其增强体内稳定性、跨细胞膜的转运、 或与变体CFH基因或mRNA的杂交。在另一些实施方案中，本发明提 供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，其包括向所 述对象施用有效量的核酸分子、以及药学可接受的载体，所述核酸分子 包含与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因或mRNA相杂交 的反义序列。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或 有此风险的对象的组合物，其包含：(a)包含siRNA或miRNA序列或 者其前体的核酸分子，其与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH 基因或mRNA杂交；和(b)药学可接受的载体。在某些实施方案中， 包含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子与变体CFH基因的 杂交降低了从变体CFH基因转录的RNA的量。在另一些实施方案中， 包含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子与变体CFH mRNA 的杂交降低了从变体CFH mRNA翻译的蛋白质的量和/或改变了变体 CFH mRNA的剪接。包含与变体CFH基因或mRNA杂交的反义序列 的核酸分子可包含一个或更多个修饰核苷酸或核苷，其增强体内稳定 性、跨细胞膜的转运、或与变体CFH基因或mRNA的杂交。在另一些 实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对 象的方法，包括向所述对象施用有效量的含siRNA或miRNA序列或者 其前体的核酸分子、以及药学上可接受的载体，所述核酸分子与人发生 年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因或mRNA杂交。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有 此风险的对象的组合物，其包含：(a)与变体CFH多肽结合的适配体， 所述变体CFH多肽与人发生年龄相关黄斑变性有关；和(b)药学可接 受的载体，其中适配体与变体CFH多肽的结合降低了变体CFH多肽的 活性。在另一些实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性 或有此风险的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的适配体、以 及药学上可接受的载体，所述适配体与人发生年龄相关黄斑变性有关的 变体CFH多肽相结合。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有 此风险的对象的组合物，其包含：(a)与变体CFH多肽结合的适配体， 所述变体CFH多肽与人发生年龄相关黄斑变性有关；和(b)药学可接 受的载体。在某些实施方案中，该小分子与变体CFH多肽的结合降低 了变体CFH多肽的活性。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗 患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，包括向所述对象施用有 效量的小分子、以及药学可接受的载体，所述小分子与人发生年龄相关 黄斑变性有关的变体CFH多肽相结合。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或 有此风险的对象的组合物，其包含：(a)与变体CFH多肽结合的抗体， 所述变体CFH多肽与人发生年龄相关黄斑变性有关；和(b)药学可接 受的载体。该抗体与变体CFH多肽的结合降低了变体CFH多肽的活性。 在另一个实施方案中，本发明还提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有 此风险的对象的方法，包括向所述对象施用有效量的抗体、以及药学可 接受的载体，所述抗体与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多 肽相结合。
本文所述用于治疗患AMD的对象的方法和组合物可用于预防性治 疗已诊断或预测有患AMD风险的个体。例如，所述组合物以足以延迟、 减缓或预防AMD或其相关症状发作的量和剂量施用。作为替代，本文 所述方法和组合物可用于治疗患AMD的个体。例如，所述组合物以足 以完全或部分地延迟和减缓病情进展的量和剂量施用，或者以足以逆转 该病情的量和剂量来施用。
如本文对CFH所描述，人CFH-样基因(如CFHL1、CFHL3和 CFHL4)的变异也可用于鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体。 CFHL1、CFHL3和CFHL4中的变异还可用于诊断或辅助诊断AMD， 鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体，诊断或辅助诊断AMD的方法， 用于这些方法的多核苷酸(如探针，引物)，包含探针或引物的诊断试 剂盒，治疗患AMD或有此风险的个体的方法，以及用于治疗患AMD 或有此风险的个体的组合物。表8-10中可见与发生AMD相关的 CFHL1、CFHL3和CFHL4中变异的实例。这些变异可在CFHL基因 (即CFHL1、CFHL3和CFHL4)的编码区或非编码区，其可用于本 文所述的方法和组合物。
在一种实施方案中，本发明提供用于检测或辅助检测与人发生 AMD相关的CFHL基因(即CFHL1、CFHL3和CFHL4)的多核苷 酸，在具体实施方案中，检测或辅助检测与人AMD相关的CFHL基因 的变异。本文还提供用于检测来自个体的样品中变体CFHL基因的诊断 试剂盒。这些试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体，以 及用于诊断或辅助诊断个体中的AMD。
在另一种实施方案中，本发明提供用于检测来自个体的样品中变体 CFHL基因比如CFHL1、CFHL3或CFHL4的分离多核苷酸，包括特 异性检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFHL基因变异的核酸分 子。
在另一种实施方案中，本发明提供多核苷酸引物，其在严谨条件下 杂交至人发生年龄相关黄斑变性的CFHL基因变异的邻近。在某些实施 方案中，本发明提供一对多核苷酸引物，其特异性检测与人发生年龄相 关黄斑变性有关的CFHL基因变异，其中第一多核苷酸引物杂交至变异 的一侧而第二多核苷酸引物杂交至该变异的另一侧。该对多核苷酸引物 可以如下方式杂交至CFHL基因区域：接近该变异的杂交引物末端距离 约100-约10,000个核苷酸。
本发明还涉及在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑 变性有关的变体CFHL基因的方法。这样的方法可包括：(a)将样品与 多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与人发生AMD相关的 CFHL基因变异相杂交但不与野生型CFHL基因杂交；和(b)确定是 否发生杂交。若发生杂交则指示样品中存在与年龄相关黄斑变性有关的 变体CFHL基因。如本文所用，术语“野生型CFHL基因”表示与发 生AMD不相关的CFHL基因，比如CFHL1、CFHL3或CFHL4。
在另一些实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人 发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFHL基因的方法，其包括(a)将 样品(称为测试样品)与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下 与人发生AMD相关的CFHL基因变异杂交，从而产生组合；(b)在严 谨杂交条件下维持步骤(a)中所产生的组合；和(c)将该组合中发生 的杂交与对照中的杂交相比较。若对照中无杂交而该组合中发生杂交则 指示样品中存在与AMD相关的变体CFHL基因。在另一实施方案中， 在将所述组合中发生的杂交与对照中杂交进行比较时确定杂交程度。对 照与测试样品相同并进行与测试样品同样的处理，只是其多核苷酸探针 不与CFHL基因中与人发生AMD相关的变异结合。作为替代，该多核 苷酸探针仅结合野生型CFHL基因。
在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人 发生AMD有关的变体CFHL基因的方法，其包括：(a)将样品的第一 部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与CFHL基因中与 人发生AMD相关的变异杂交；(b)将样品的第二部分样品与多核苷酸 探针相杂交，所述探针在严谨条件下与野生型CFHL基因杂交；和(c) 确定是否发生杂交。若第一部分发生杂交而第二部分未杂交则指示样品 中存在与AMD相关的变体CFHL基因。
在另一些实施方案中，本发明提供鉴定或辅助鉴定有发生AMD风 险的个体的方法。在一种具体实施方案中，这样的方法包括分析从该个 体获得的DNA中是否存在与人发生AMD相关的变体CFHL基因。存 在变体CFHL基因指示该个体有发生AMD的风险。
在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的 方法包括：(a)将从个体获得的样品与多核苷酸探针相组合，所述探针 在严谨条件下与CFHL基因中与人AMD相关的变异杂交；和(b)确 定是否发生杂交。发生杂交指示该个体有发生AMD的风险。
在另一种实施方案中，本发明提供用于检测来自个体的样本中变体 CFHL基因的诊断试剂盒。诊断试剂盒例如可包含：(a)其中放置多核 苷酸探针的至少一个容器装置，该探针在严谨条件下与CFHL基因中与 人发生AMD相关的变异杂交；和(b)使用诊断试剂盒用于检测样品 中变体CFHL基因的标签和/或指导。
在另一种实施方案中，用于检测来自个体的样品中变体CFHL基因 的诊断试剂盒例如可包含：(a)其中放置多核苷酸引物的至少一个容器 装置，该引物在严谨条件下杂交至邻近与人发生年龄相关黄斑变性有关 的CFHL基因变异的一侧；和(b)使用所述诊断试剂盒用于检测样品 中变体CFHL基因的标签和/或指导。任选地，该诊断试剂盒还包含第 二多核苷酸引物，其在严谨条件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性有 关的CFHL基因变异的另一侧。
根据说明书、随后的附图和权利要求书，本发明的实施方案和实施、 其它实施方案以及它们的特性和特征将是显而易见的，所有的权利要求 在此通过参考而并入本发明内容部分中。
附图说明
图1A-1B表示与AMD相关基因的基因组范围关联性研究的统计数 据。图1A表示基因组范围关联性扫描的p-值。
以染色体顺序(chromosomal order)对每个SNP的-log10(p)进行作图。 图上SNP之间的间距是均匀的且不反映SNP在染色体上的距离。水平 虚线表示经Bonferroni校正后对p＝0.05的截断值。垂直线表示染色体 边界。图1B表示病例与对照之间基因型频率的变异。
图2A-2D表示与AMD相关SNP的数据。图2A表示跨CFH区域 的连锁不平衡(LD)，作为成对的D′值作图。图2B表示在数据中具有 两种相关SNP的强LD中的区域。垂直条代表数据组中可获得SNP的 大概位置。阴影区域是在HapMap数据中发现的单倍型块。图2C表示 跨该区域的HapMap CEU数据中的单倍型块。较暗的阴影表示较高的 D′值。较亮的阴影表示具有低LOD评分的高D′。黑线表示单倍型块的 边界。图2D表示来自跨所述6-SNP区域的单倍型的最大简约性进化树 (maximum parsimony cladogram)。各线的数字表示6个SNP中的哪 个沿着该分枝变化。SNP 4是rs380390而SNP 6是rs1329428，其是最 先鉴定的与AMD相关的两个SNP。
图3A-3C表示CFH蛋白在人视网膜中的免疫荧光定位。图3A表 示用抗-人CFH抗体染色的人视网膜切片。图3B表示用与CFH蛋白一 起预孵育的抗-人CFH抗体染色的人视网膜切片作为阴性对照。细胞核 通过DAPI染色识别。图3A中圈定区域的放大图示于图3C中。从各 图像中采集荧光和DIC通道并在各图板(panel)中分别表现为左和右 照片(picture)。图3A和图3B中的荧光照片是来自CFH标记和DAPI 染色细胞核的合成图像。图3C中的DIC照片是CFH标记和DIC通道 的合成图像。DIC图像中的黑点对应RPE和脉络膜中的黑色素颗粒。 抗-CFH抗体主要染色脉络膜(图3A)，在管腔壁和邻近RPE的区域尤 为强烈(附图3C)，使用纯化的人CFH蛋白可竞争除去免疫反应性(如 图3B)。来自RPE的荧光信号源自脂融合(lipofusion)的自发荧光， 其不能被人因子H蛋白竞争性除去。GC：神经节细胞层，INL：内核层， ONL：外核层，RPE：视网膜色素上皮。比例尺：图3A和3B为40μm， 图3C为20μm。
图4A-4E表示已活化补体C5b-9的免疫组化。举例说明了来自三名 患者的组织。图4A和4B分别表示来自患者1和2的死后眼底图像。 组织学例示的位点用星号指示。图4C表示来自患者1的组织，其遍及 玻璃膜(Bruch′s membrane)且在毛细管间支柱(pillar)(细黑箭头) 中对C5b-9是免疫阳性。上面的视网膜色素上皮是肥大的，相关的视网 膜证明市场光感受器损失(market photoreceptor loss)。补体沉积也存 在于脉络膜动脉的弹性膜内(双头黑箭头)，以及脉络膜静脉壁内(白 箭头)。图4D表明在患者2中在玻璃膜、毛细血管间支柱(箭头)和玻 璃疣(星号)中的C5b-9沉积。脉络膜静脉内面也是免疫阳性的(白箭 头)。图4E表示来自患者3的组织，其是具有早期AMD组织学证据的 86岁老者。遍及玻璃膜、在玻璃疣(星号)中和在脉络膜静脉内壁(白 箭头)中注意到已活化补体的沉积。比例尺：图4C和4D中为20μm， 图4E中为15μm。
图5表示人补体因子H的多肽序列(GenBank登记号CAA68704)。
具体实施方式
为了提供对本发明的全面理解，现将描述某些例示性的实施方案， 包括用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体以及用于诊断或辅助 诊断AMD的组合物和方法。但是，本领域普通技术人员应理解到，本 文所述的组合物和方法可以被改变和修饰以适于待解决应用并且本文 所述的组合物和方法可用于其它适当的应用，这些另外的增加和修饰没 有偏离其范围。
1、总览
发现CFH基因变异与AMD相关可用于早期诊断和治疗易患AMD 的个体。确定个体内CFH基因的遗传组成可用于在早期阶段或者甚至 在个体表现出任何AMD症状之前治疗AMD。此外，基因型CFH的诊 断测试可使得个体改变它们的行为从而最大程度减小患AMD的环境风 险(如吸烟)。因此，本发明涉及鉴定与易患AMD相关的变体CFH基 因，其可用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体以及可用于诊断 或辅助诊断AMD。其还涉及用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的 个体的方法、诊断或辅助诊断AMD的方法、用于这些方法的多核苷酸 (如探针、引物)、包含探针或引物的诊断试剂盒、治疗患AMD或有 此风险的个体的方法以及用于治疗患AMD或有此风险的个体的组合 物。
根据本发明，CFH基因的共有变异已显示与AMD高度相关。本发 明涉及用于检测这些使人易患AMD的变异的方法和组合物。CFH基因 可以是该基因的cDNA或基因组形式，其可包括上游和下游调控序列。 CFH多肽可由全长编码序列或该编码序列的任意部分编码，只要保留 所述全长或片段的期望活性或功能(如，酶促活性、配体结合、信号转 导等)即可。CFH核苷酸序列的实例包括人核苷酸序列(SEQ ID NO：1 或2)、小鼠核苷酸序列(SEQ ID NO：3)以及大鼠核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。本发明的多核苷酸探针和引物可与CFH基因的任意连续部分 杂交，比如SEQ ID NO：1-4中所示的CFH基因。CFH多肽序列的实 例包括人多肽序列(SEQ ID NO：5或6和图5)、小鼠多肽序列(SEQ ID NO：7)和大鼠多肽序列(SEQ ID NO：8)。CFH基因还可包括位于5′ 和3′末端两端邻近编码区并距每端约1-2kb的序列，使得该基因对应全 长mRNA的长度。位于编码区5′端且存在于mRNA上的序列称为5′ 非翻译序列。位于编码区3′端或下游且存在于mRNA上的序列称为3′ 非翻译序列。
CFH基因是补体激活调节因子(RCA)基因簇的成员且编码具有 二十个短共有重复(SCR)结构域的蛋白质，每个所述结构域有60个 氨基酸。该蛋白质被分泌到血流中，在补体激活调控中起关键作用 (Rodriguez de Cordoba et al.，Mol Immunol.41：355-67(2004))。补体 系统防止感染并攻击疾病和发育异常的细胞，通常不攻击健康细胞。参 与免疫监督和疾病应答的细胞被募集以增强活化补体成分的裂解作用。 当C3转化酶被激活时，其导致产生C3a和C3b，然后产生终末C5b-9 复合物。细胞上和循环中的CFH通过抑制C3活化成C3a和C3b、以 及通过灭活存在的C3b来调节补体活性。早前已经报道CFH基因变异 与溶血尿毒综合征(HUS)以及慢性低补体血性肾病相关。还已经表征 了选择性转录剪接变体，其编码不同的亚型。
2、CFH多核苷酸探针和引物
在某些实施方案中，提供了分离和/或重组的多核苷酸，其特异性检 测与发生AMD相关的CFH基因变异。本发明的多核苷酸探针以特异 性方式杂交至这种CFH基因中的变异(称为感兴趣变异)及其旁侧序 列，并由此通常具有与所述变异及旁侧区序列完全或部分互补的序列。 本发明的多核苷酸探针可杂交至靶DNA的一段，使得变异匹配探针的 中心位置，或者变异匹配探针的末端位置。在一种实施方案中，本发明 的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含变体CFH基因、或其等位基 因变体一部分的核酸分子杂交，该基因与人发生AMD相关。在另一种 实施方案中，本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基 因或其等位基因变体的至少10个连续核苷酸的核酸分子杂交，其中所 述核酸分子包含与人发生AMD相关的变异。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸探针是等位基因特异性探 针。用于分析多态性的等位基因特异性探针的设计和应用例如描述于 Saiki et al.，Nature 324：163-166(1986)；Dattagupta，EP 235726；以及 Saiki WO 89/11548。等位特异性探针可设计成与来自某一个体的一段靶 DNA杂交但不与来自另一个体的对应区段相杂交，这是因为在所述两 个个体的对应区段中存在不同的多态性形式或变异。杂交条件应足够严 谨，从而在等位基因之间有显著不同的杂交强度。在某些实施方案中， 探针仅与一种等位基因杂交。
使个体易患AMD的CFH基因中的许多变异可通过本文所述方法和 多核苷酸检测。例如，可检测与AMD相关的编码区、外显子、外显子 -内含子边界、信号肽、5’-非未翻译区、启动子区、增强子序列、3’-非 翻译区或内含子的任何核苷酸多态性。这些多态性包括但不限于以下变 化：改变由CFH基因所编码蛋白质的氨基酸序列，产生选择性剪接产 物，创建截短型产物，引入过早终止密码子，引入隐藏(cryptic)外显 子，或大或小地改变表达程度，改变CFH表达的组织特异性，在由CFH 所编码蛋白质的三维结构中引入变化，在由CFH所表达蛋白质的结合 亲和力或特异性方面引入变化，或改变由CFH所编码蛋白质的功能。 在一个具体实施方案中，CFH基因变异在CFH蛋白质第402位编码组 氨酸以外的氨基酸(如酪氨酸)。在另一个具体实施方案中，CFH基因 变异在CFH蛋白质第62位编码缬氨酸以外的氨基酸(如异亮氨酸)。 在表4和5中记载了使个体易患AMD的CFH基因变异的其它实例。 例如，其它变体基因，比如变异在编码区中的那些(如编码下列的变异： 在CFH蛋白第58位编码丝氨酸以外的氨基酸，比如丙氨酸；在CFH 蛋白第127位编码精氨酸以外的氨基酸，比如组氨酸；在CFH蛋白第 400位编码谷氨酰胺以外的氨基酸，比如赖氨酸；在CFH蛋白第609 位编码缬氨酸以外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第890位编 码丝氨酸以外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第936位编码谷 氨酸以外的氨基酸，比如天冬氨酸；在CFH蛋白第1007位编码缬氨酸 以外的氨基酸，比如亮氨酸；在CFH蛋白第1050位编码天冬酰胺以外 的氨基酸，比如酪氨酸；在CFH蛋白第1166位编码脯氨酸以外的氨基 酸，比如谷氨酰胺；在CFH蛋白第1210位编码精氨酸以外的氨基酸， 比如半胱氨酸。参见表4和5)可使用本文对其它变异描述的方法和组 合物进行检测。或者，变异在非编码区的变体基因，比如表4和5中所 示的那些，可使用本文所述方法和组合物检测。所述多核苷酸可进一步 理解为包括作为本文所述多核苷酸之变体的多核苷酸，条件是该变体多 核苷酸保留它们特异性检测与发生AMD相关的CFH基因变异的能力。 变体多核苷酸例如可包括差异为一个或多个核苷酸取代、增加或缺失的 序列。
在某些实施方案中，所述分离多核苷酸是探针，其在严谨条件下与 人发生AMD相关的CFH基因变异杂交。如本文所用，术语“杂交” 用于指互补核酸的配对。术语“探针”是指可杂交至另一感兴趣核酸的 多核苷酸。多核苷酸可天然存在，如在纯化的限制性消化物中，或可以 经合成、重组或核酸扩增(如PCR扩增)制备。
本领域公知如何使用核酸分子进行杂交试验。本领域技术人员熟知 本发明所需的杂交条件并易于理解促进DNA杂交的适当严谨性条件可 以变化。这样的杂交条件可参见标准教科书，比如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)；和 Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons(1992)。特别适用于本发明方法的是在严谨条件下可与变体CFH 基因或变体CFH基因的区域杂交的多核苷酸。在严谨条件下，与变体 CFH基因杂交的多核苷酸不与野生型CFH基因杂交。
本领域技术人员易于理解，核酸杂交受很多条件影响，比如：盐浓 度、温度、有机溶剂、碱基组成、互补链的长度、和杂交核酸之间核苷 酸碱基错配数。严谨温度条件一般包括超过30℃的温度，或可超过37 ℃或45℃。严谨性随温度而增加。例如，超过45℃的温度是高度严谨 的条件。严谨的盐条件通常是低于1000mM，或可低于500mM或200 mM。例如，可在约45℃、6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下进行杂交， 随后于50℃用2.0xSSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃、 约2.0xSSC的低严谨性至50℃、约0.2xSSC的高严谨性。此外，洗涤 步骤的温度可由室温约22℃的低严谨条件升高至约65℃的高严谨条件。 温度和盐均可改变，或者温度或盐浓度中一种可维持恒定而另一种变量 发生变化。特别适用于本发明方法的是能在严谨条件下与变体CFH基 因或变体CFH基因之区域杂交的多核苷酸。但应理解到，本发明中的 适当严谨性条件可以改变以促进DNA杂交。在某些实施方案中，本发 明的多核苷酸在高严谨性条件下与变体CFH基因或变体CFH基因之区 域杂交。在严谨条件下，与CFH基因变异杂交的多核苷酸不与野生型 CFH基因杂交。在一种实施方案中，本发明提供在低严谨条件下杂交 的核酸，该条件是室温下6.0xSSC、室温随后用2.0xSSC在室温洗涤。 但是，参数的组合较任何单一参数更为重要。例如参见Wetmur and Davidson，1968。探针序列还可在某些条件下与双链DNA特异性杂交从 而形成三链或更高级的DNA复合物。这些探针的制备和适宜的杂交条 件为本领域所公知。获得编码本文所公开生物合成构建体的一种方法是 通过组装在常规自动化寡核苷酸合成仪中制备的合成寡核苷酸。
本发明的多核苷酸探针或引物可被标记，从而可在多种检测系统中 进行检测，包括但不限于，酶(如ELISA，以及基于酶的组化分析)、 荧光、放射性、化学和发光系统。本发明的多核苷酸探针或引物还可包 括猝灭剂部分，当其置于标记(如荧光标记)附近时，使得标记物没有 或几乎没有信号。可通过直接或间接方式进行标记检测(如通过生物素 /亲合素或生物素/链亲合素连接)。本发明不意图受限于任何具体的检测 系统或标记。
在另一种实施方案中，本发明的分离多核苷酸是一种引物，其在严 谨条件下杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的邻近、上游或 下游。所述分离多核苷酸在严谨条件下可与一种核酸分子杂交，该核酸 分子包含全部或部分的与人发生AMD相关的CFH基因变异。作为替 代，该分离多核苷酸在严谨条件下可与包含与人发生AMD相关的CFH 基因变异的至少50个连续核苷酸的核酸分子杂交。例如，本发明的多 核苷酸引物可杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的CFH基因区域的 邻近、上游或下游。作为替代，本发明的多核苷酸引物可杂交至编码 CFH蛋白第62位氨基酸的CFH基因区域的邻近、上游或下游。
如本文所用，术语“引物”是指一种多核苷酸，当其处于合成与核 酸链互补的引物延伸产物的条件(例如，存在核苷酸、诱导剂比如DNA 聚合酶、以及适宜的温度、pH、和电解质浓度)下时能作为核酸合成 的起始点。作为替代，当处于两种非连接核酸发生连接(例如，存在邻 近的核酸、诱导剂比如DNA连接酶、以及适宜的温度、pH、和电解质 浓度)的条件下时，引物可连接至邻近的核酸。本发明的多核苷酸引物 可天然存在，如在纯化的限制性消化物中，或可通过合成制备。为了扩 增的最大效率，引物优选是单链的，但也可以是双链的。如果是双链的， 在使用前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡聚脱氧核糖核甘 酸。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度，引物来源和所用方法。 在某些实施方案中，本发明的多核苷酸引物至少为10个核苷酸长并杂 交至与在人发生AMD相关的CFH基因变异的一侧或另一侧。所述多 核苷酸可包含改变，比如一个或多个核苷酸的替换、增加或缺失，条件 是它们以相同的特异性程度与目标变体CFH基因杂交。
在一种实施方案中，本发明提供特异性检测与发生AMD相关的 CFH基因变异的一对引物。在此情况下，第一引物杂交至该变异的上 游，第二引物杂交至该变异的下游。应该理解，引物之一杂交至包含与 发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的一条链，而第二引物杂 交至包含与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的互补链。如 本文所述，术语“DNA区域”是指DNA的亚染色体长度。
在另一种实施方案中，本发明提供杂交至靶DNA上位点的等位基 因-特异性引物，其与与人发生AMD相关的CFH基因变异相重叠。本 发明的等位基因特异性引物仅引发与该引物完美互补的等位基因形式 发生扩增。该引物例如可与在远端位点杂交的第二引物联合使用。由此 可从两种引物开始扩增，得到可检测的产物，其指示是否存在与人发生 AMD相关的变体CFH基因。
3、检测分析
在某些实施方案中，本发明涉及用于检测与发生年龄相关黄斑变性 有关的CFH基因变异的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸可在严谨杂 交条件下杂交至包含与发生年龄相关黄斑变性有关的CFH基因变异的 DNA区域。
本发明的多核苷酸可用于检测与发生AMD相关的CFH基因变异的 任何分析中。这些方法例如可包括DNA测序、杂交、连接、或引物延 伸方法。此外，这些方法的任何联合可用于本发明。
在一种实施方案中，通过DNA测序检测和/或确定是否存在与发生 AMD相关的CFH基因变异。DNA序列测定可通过标准方法完成，比 如双脱氧链终止技术和凝胶电泳，或通过其它方法比如焦磷酸测序 (Biotage AB，Uppsala，Sweden)。例如，通过双脱氧链终止法的DNA 测序可使用未标记的引物和标记的(如荧光或放射性)终止子进行。作 为替代，可使用标记的引物和未标记的终止子进行测序。样品中DNA 的核酸序列可与野生型DNA的核酸序列相比较，以鉴定是否存在与发 生AMD相关的CFH基因变异。
在另一种实施方案中，通过杂交检测和/或确定与发生AMD相关的 CFH基因变异。在一种实施方案中，多核苷酸探针与与AMD相关的 CFH基因变异及旁侧核苷酸杂交，但不与野生型CFH基因杂交。该多 核苷酸探针可包含荧光、放射性或化学标记的核苷酸以便于检测杂交。 可通过本领域已知的标准方法比如Northern印迹、Southern印迹、荧 光原位杂交(FISH)或通过与固定于固相载体上的多核苷酸(比如DNA 阵列或微阵列)杂交来实施并检测杂交。如本文所用，术语“DNA阵 列”和“微阵列”是指可杂交阵列元件的有序排列。阵列元件可安排成 优选至少一种或多种不同的阵列元件固定于衬底表面。各阵列元件的杂 交信号可独立区分。在一个优选实施方案中，所述阵列元件包含多核苷 酸，尽管本发明还可与cDNA或其它类型的核酸阵列元件一起使用。
在一个具体实施方案中，使用多核苷酸探针用于通过FISH杂交基 因组DNA。FISH例如可用于中期相细胞中以检测基因组DNA的缺失。 使基因组DNA变性以分离开DNA双螺旋结构中的互补链。然后将本发 明的多核苷酸探针加入到变性基因组DNA中。若存在与发生AMD相 关的CFH基因变异，则该探针与基因组DNA杂交。然后可通过荧光显 微镜检测探针信号(如荧光)以确定是否存在信号。不存在信号则指示 不存在与发生AMD相关的CFH基因变异。在另一具体实施方案中， 将标记的多核苷酸探针施用于DNA阵列上的固定化多核苷酸。例如可 通过测量洗涤后保留在DNA阵列上的标记探针的强度来检测杂交。本 发明的多核苷酸还可用于商业分析，比如Taqman分析(Applied Biosystems，Foster City，CA)。
在另一种实施方案中，通过使用DNA聚合酶的引物延伸来检测和/ 或确定是否存在与发生AMD相关的CFH基因变异。在一种实施方案 中，本发明的多核苷酸引物在紧邻变异处杂交。可使用采用标记双脱氧 核苷酸终止子的单碱基测序反应来检测变异。若存在变异则导致标记终 止子的掺入，而不存在变异则不导致掺入所述终止子。在另一种实施方 案中，本发明的多核苷酸引物杂交至与发生AMD相关的CFH基因变 异。该引物或其部分将不与野生型CFH基因杂交。若存在变异则导致 引物延伸，而不存在变异则不导致引物延伸。所述引物和/或核苷酸可 进一步包括荧光、放射性或化学探针。可通过测量延伸产物的强度以检 测由引物延伸所标记的引物，比如通过凝胶电泳、质谱，或检测荧光、 放射性或化学标记的任何其它方法。
在另一种实施方案中，通过连接来检测和/或确定与发生AMD相关 的CFH基因变异。在一种实施方案中，本发明的多核苷酸引物杂交至 与发生AMD相关的CFH基因变异。该引物或其部分将不与野生型CFH 基因杂交。还提供在紧邻第一引物处与CFH基因区域杂交的第二多核 苷酸。这两种多核苷酸引物之一种或二种可以被荧光、放射性、或化学 标记。若存在与发生AMD相关的CFH基因变异，在DNA连接酶存在 下将发生两种多核苷酸引物的连接作用。连接作用可通过凝胶电泳、质 谱检测，或通过测量荧光、放射性或化学标记的强度来检测。
在另一种实施方案中，通过单碱基延伸(SBE)来检测和/或确定与 发生AMD相关的CFH基因变异的存在。例如，可使用荧光标记的引 物，其与在添加碱基的标记和引物的标记之间的荧光共振能量转移 (FRET)相偶联。典型地，该方法，比如Chen et al.，(PNAS 94：10756-61 (1997)，在此引入作为参考)所述的方法，使用在5′末端标记有5-羧基 荧光素(FAM)的基因座特异性多核苷酸引物。该标记引物被设计成3’ 端紧邻感兴趣多态性位点。标记引物与基因座杂交，使用荧光标记的双 脱氧核糖核苷酸(ddNTPs)以染料终止子测序方式进行标记引物的单 碱基延伸，只是不存在脱氧核糖核苷酸。作为对标记引物波长处激发的 响应而使添加ddNTP的荧光增强被用于推断所添加核苷酸的身份。
与发生AMD相关的CFH基因变异的检测方法可包括扩增含该变异 的DNA区域。可使用任何扩增方法。在一种具体实施方案中，含该变 异的DNA区域通过使用聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR最早由 Mullis描述(参见如U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202和4,965,188， 在此引入作为参考)，其描述了在基因组DNA混合物中无需克隆或纯化 而增加DNA区域的浓度的方法。其它PCR方法也可用于核酸扩增，包 括但不限于RT-PCR、定量PCR、实时PCR、快速扩增多态性DNA分 析、快速扩增cDNA末端(RACE)或滚环扩增。例如，本发明的多核 苷酸引物可与DNA混合物(或可用本发明多核苷酸引物扩增的任何多 核苷酸序列)相合并，其中该DNA包含CFH基因。该混合物还包括热 循环反应所必需的扩增试剂(如，脱氧核糖核苷三磷酸，缓冲剂，等)。 根据标准PCR方法，混合物经历一系列变性、引物退火和聚合酶延伸 步骤以扩增包含CFH基因变异的DNA区域。所扩增DNA区域的长度 由引物之间的相对位置决定，因此，该长度是可以控制的参数。例如， 该引物的杂交可以如下方式发生，使得邻近变异的引物末端间隔有1- 10,000个碱基对(如，10个碱基对(bp)、50bp、200bp、500bp、1,000 bp、2,500bp、5,000bp或10,000bp)。
使用本领域技术人员已知的标准仪器扩增和检测所扩增的DNA。例 如，已开发了许多仪器用于进行核酸扩增，尤其是PCR，例如Johnson et al，美国专利号5,038,852(计算机控制的热循环仪)；Wittwer et al， Nucleic Acids Research，17：4353-4357(1989)(毛细管PCR)；Hallsby， 美国专利号5,187,084(基于空气的温度控制)；Garner et al， Biotechniques，14：112-115(1993)(在864-孔板中的高通量PCR)； Wilding et al，International application No.PCT/US93/04039(在微-加 工结构中的PCR)；Schnipelsky et al，欧洲专利申请号90301061.9(公 开号0381501 A2)(抛弃型单次使用的PCR装置)，等等。在某些实施 方案中，本文所述发明利用实时PCR或本领域已知的其它方法比如 Taqman分析。
在某些实施方案中，与人发生AMD相关的变体CFH基因可用单链 构象多态性分析来检测，其通过单链PCR产物的电泳迁移率改变而确 定碱基差异，如Orita et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989) 中所述。扩增的PCR产物可如上述产生、并加热或经其它方式变性， 从而形成单链扩增产物。单链核酸可再折叠或形成二级结构，这部分取 决于碱基序列。单链扩增产物的不同电泳迁移率可以与靶序列的等位基 因之间的碱基序列差异相关联。
在一种实施方案中，结合本文所述的一种方法(比如DNA测序) 来分析扩增的DNA。作为替代，分析该扩增的DNA时还可通过与标记 探针杂交、杂交至DNA阵列或微阵列，通过掺入生物素化引物并随后 用亲合素-酶偶联体检测，或通过将32p-标记的脱氧核苷三磷酸比如 dCTP或dATP掺入所扩增片段。在一个具体实施方案中，通过电泳或 色谱法确定所扩增DNA的长度来分析扩增的DNA。例如，扩增的DNA 通过凝胶电泳分析。本领域公知凝胶电泳的方法。例如参见Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons： 1992。扩增的DNA例如可通过荧光或放射性方式或使用其它嵌入DNA 的染料或标记物进行观察。还可将该DNA转移至固相载体比如硝酸纤 维素膜并在凝胶电泳之后进行Southern印迹。在一种实施方案中，使 DNA暴露于溴化乙锭并在紫外光下显示。
4、编码CFH多肽的治疗性核酸
在某些实施方案中，本发明提供编码本文所述CFH多肽包括其功 能性变体的分离和/或重组核酸。例如SEQ ID NO：1或2是编码CFH 的核酸序列且SEQ ID NO：5或6以及图5编码CFH多肽。所述核酸可 以是单链的或是双链的。这样的核酸可以是DNA或RNA分子。这些核 酸例如可用于制备CFH多肽的方法或直接用作治疗剂(如在基因治疗 方法中)。
可以理解，所述的编码CFH多肽的核酸还包括作为SEQ ID NO：1 或2变体的核酸。变体核苷酸序列包括差异一个或多个核苷酸替换、添 加或缺失的序列，比如等位基因变体；并由此将包括不同于SEQ ID NO： 1或2所示编码序列的核苷酸序列不同的编码序列。可以测试与SEQ ID NO：1或2所示编码序列的核苷酸序列不同的编码序列抑制C3活化为 C3a和C3b的能力以及灭活已有C3的能力。
在某些实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO：1或2有至少80％、 85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％一致性的分离或重组的 核酸序列。本领域普通技术人员将意识到，与SEQ ID NO：1或2互补 的核酸序列以及SEQ ID NO：1或2的变体也在本发明范围内。在其它 实施方案中，本发明的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核 苷酸序列融合的，或在DNA文库中。
在另一些实施方案中，本发明的核酸还包括在严谨条件下与SEQ ID NO：1或2所示核苷酸序列、SEQ ID NO：1或2的互补序列、或其片段 杂交的核酸。如前所述，本领域普通技术人员将容易理解到促进DNA 杂交的适当严谨条件可以变化。例如，可以在6.0×氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)约45℃杂交，随后2.0×SSC 50℃洗涤。例如，洗涤步骤的盐 浓度可以在从约2.0×SSC 50℃的低严谨性至约0.2×SSC 50℃的高严 谨性之间选择。此外，洗涤步骤中的温度可由室温约22℃的低严谨条件 升高到约65℃的高严谨条件。温度和盐均可变化，或者温度或盐浓度之 一保持恒定而另一变量则发生改变。在一种实施方案中，本发明提供在 6×SSC室温随后2×SSC室温洗涤的低严谨条件下杂交的核酸。
因遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO：1或2所示核酸的分离 核酸也在本发明范围内。例如，很多氨基酸对应不止一个三联体。指定 相同氨基酸的密码子或同义密码子(例如，CAU和CAC是组氨酸的同 义密码子)可导致“沉默”变异，其不影响蛋白质的氨基酸序列。但是， 可以预期不引起目标蛋白质的氨基酸序列改变的DNA序列多态性将存 在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员将理解，由于天然等位基因变异， 编码特定蛋白质的核酸的一个或更多个核苷酸(高达约3-5％的核苷酸) 中的这些变异可存在于给定物种的个体中间。任何和所有的这些核苷酸 变异以及所得的氨基酸多态性均在本发明范围内。
可使用标准重组方法制备本发明的核酸和多肽。例如，本发明的重 组核酸可以在表达构建体中与一个或多个调控核苷酸序列可操作性连 接。调控核苷酸序列一般将适于用于表达的宿主细胞。本领域已知用于 许多宿主细胞的许多类型的适当表达载体和适宜的调控序列。通常，所 述一种或多种调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导或信号 序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以 及增强子或激活子序列。本领域公知的组成型或诱导型启动子包括在本 发明内。这些启动子可以是天然存在的启动子或组合超过一种启动子的 杂合启动子。表达构建体可在附加体上存在于细胞中，比如质粒，或者 表达构建可插入染色体中。表达载体还可包含选择标记基因从而允许选 择转化的宿主细胞。选择标记基因是本领域公知的并可随所使用的宿主 而改变。
在本发明的某些实施方案中，感兴趣核酸被提供于表达载体中，该 载体包含编码CFH多肽的核苷酸序列并与至少一种调控序列可操作性 连接。调控序列是本领域已知的并选用于指导CFH多肽的表达。因此， 术语调控序列包括启动子、增强子、终止序列、优选的核糖体结合位点 序列、优选的mRNA前导序列、优选的蛋白质加工序列、优选的用于 蛋白质分泌的信号序列、以及其它表达控制元件。调控序列的实例描述 于Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology， Academic Press，San Diego，CA(1990)中。例如，在这些载体中可使用 当与之可操作性连接时即控制DNA表达的许多表达控制序列中的任意 一种以表达编码CFH多肽的DNA序列。这种有用的表达控制序列，例 如包括SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或细胞巨化病毒 立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、 其表达由T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、λ噬菌体的主要操纵基因 和启动子区、fd衣壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶 的启动子、酸性磷酸酶的启动子如Pho5、酵母α-接合因子的启动子、 杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒的 基因表达的其它序列、及其多种组合。应该理解表达载体的设计可以取 决于这样的因素，比如：待转化宿主细胞的选择和/或期望表达蛋白的 类型。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由该载 体编码的任何其它蛋白质比如抗生素标记的表达。
本发明的重组核酸可以通过将所克隆的基因或其部分连接到适于 在原核细胞或真核细胞(酵母、禽、昆虫或哺乳动物)或二者中表达的 载体中。例如，生产重组CFH多肽的表达载体治理和其它载体。例如 合适的载体包括下列类型的质粒：用于在原核细胞比如大肠杆菌中表达 的pBR322-来源的质粒、pEMBL-来源的质粒、pEX-来源的质粒、pBTac- 来源的质粒、和pUC-来源的质粒。
这些哺乳动物表达载体包含辅助载体在细菌中增殖的原核序列、以 及一个或多个在真核细胞内表达的真核转录单元。pcDNAI/amp、 pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、 pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg来源的载体是适于转染 真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些经来自细菌质 粒比如pBR322的序列修饰，以辅助在原核和真核细胞中复制和抗药性 选择。作为替代，病毒衍生物比如牛乳头瘤病毒(BPV-I)或Epstein-Barr 病毒(pHEBo、pREP-源的或p205)可用于在真核细胞内瞬时表达蛋 白质。其它病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例参见下面关于基因 治疗给药体系的说明中。本领域公知用于制备质粒和转化宿主生物的多 种方法。对于适于原核和真核细胞的其它表达系统以及一般性重组方法 参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)。有时，可能希望通过使用杆状病毒表达系统表达重 组多肽。这些杆状病毒表达系统的实例包括pVL-源的载体(比如 pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-源的载体(比如pAcUW1) 和pBlueBac-源的载体(比如包含β-gal的pBlueBac III)。
在一种实施方案中，将设计载体用于在CHO细胞中生产目标CFH 多肽，比如Pcmv-Script载体(Stratagene，La Jolla，Calif.)、pcDNA4 载体(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和pCI-neo载体(Promega，Madison， Wise)。在其它实施方案中，将设计所述载体用于在原核宿主细胞(如， 大肠杆菌和枯草杆菌)、真核宿主细胞如酵母细胞、昆虫细胞、骨髓瘤 细胞、成纤维细胞3T3细胞、猴肾或COS细胞、貂-肺上皮细胞、人包 皮成纤维细胞、人胶质母细胞瘤、和畸胎癌细胞中生产目标CFH多肽。 作为替代，所述基因可在无细胞系统比如兔网织红细胞裂解物系统中表 达。
显然，目标基因构建体可用于在培养物中扩增的细胞中表达目标 CFH多肽以生产蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白，用于纯化。
本发明还涉及用重组基因转染的宿主细胞，该重组基因包括一个或 多个目标CFH多肽的编码序列(如SEQ ID NO：1或2)。该宿主细胞 可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明的CFH多肽可在细菌细胞 比如大肠杆菌、昆虫细胞(如使用杆状病毒表达系统)、酵母、或哺乳 动物细胞内表达。本领域技术人员已知其它适宜的宿主细胞。
因此，本发明还涉及生产目标CFH多肽的方法。例如，用编码CFH 多肽的表达载体转染的宿主细胞可在适当条件下培养以进行CFH多肽 表达。CFH多肽可以分泌并从包含该CFH多肽的细胞和培养基混合物 中分离。作为替代，多肽可保留在胞质内或膜组分中，并收获、裂解细 胞，分离所述蛋白。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产物。 本领域公知适宜的细胞培养基。使用本领域已知的蛋白质纯化技术可从 细胞培养基、宿主细胞或二者中分离多肽，包括离子交换色谱、凝胶过 滤色谱、超滤、电泳和用对该多肽特定表位具有特异性之抗体的免疫亲 和纯化。在一个具体实施方案中，CFH多肽是包含辅助纯化CFH多肽 的结构域的融合蛋白。
在另一种实施方案中，编码纯化前导序列的融合基因，比如在重组 CFH多肽期望部分之N端的多聚(His)/肠激酶切割位点序列，可以允许 通过亲和色谱法使用Ni2+金属树脂纯化所表达的融合蛋白。随后可通过 使用肠激酶处理除去纯化前导序列以提供纯化的多肽(如，参见Hochuli et al.，(1987)J.Chromatography 411：177；和Janknecht et al.，PNAS USA 88：8972)。
制备融合基因的技术是公知的。基本上，根据常规技术连接编码不 同多肽序列的多种DNA片段，采用平末端或粘末端连接、限制酶消化 从而提供适当末端，适当时填平粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不期 望的连接，和酶促连接。在另一种实施方案中，可通过常规技术包括自 动DNA合成仪合成融合基因。作为替代，基因片段的PCR扩增可使用 锚定引物，其在两个相继基因片段之间产生互补突出端，随后可退火而 产生嵌合基因序列(例如参见Current Protocols in Molecular Biology， eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons：1992)。
5、其它的治疗方式
反义多核苷酸
在某些实施方案中，本发明提供包含反义序列的多核苷酸，所述反 义序列通过反义机制抑制变体CFH基因的表达。反义技术已广泛用于 调控基因表达(Buskirk et al.，Chem Biol 11，1157-63(2004)；and Weiss et al.，Cell Mol Life Sci 55，334-58(1999))。如本文所用，“反义”技术 表示施用或原位产生在细胞条件下与编码一或多种靶蛋白的感兴趣靶 核酸(mRNA和/或基因组DNA)特异性杂交(如结合)的分子或其衍 生物，从而抑制该蛋白表达，例如通过抑制转录和/或翻译，比如经立 体阻碍、改变剪接或诱导转录本的切割或其它酶促灭活。所述结合可以 是常规的碱基对互补或，或者例如当结合于DNA双链时通过双螺旋大 沟的特异性相互作用。通常，“反义”技术是指本领域常规使用的技术 范畴，包括依赖与核酸序列特异性结合的任何疗法。
包含本发明反义序列的多核苷酸例如可以作为表达质粒的组分来 递送，当该质粒在细胞中转录时，产生与靶核酸的至少独特部分互补的 核酸序列。作为替代，包含反义序列的多核苷酸可在靶细胞外产生，当 将其引入靶细胞时，通过与靶核酸杂交而抑制表达。可修饰本发明的多 核苷酸从而使其耐受内源性核酸酶，如核酸外切酶和/或核酸内切酶， 并由此在体内稳定。用于本发明多核苷酸中的核酸分子的实例是DNA 的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(还参见美国专利号 5,176,996；5,264,564；和5,256,775)。已综述了构建适用于反义技术的多 核苷酸的一般方法，例如见van der krol et al.(1988)Biotechniques 6：958-976；和Stein et al.(1988)Cancer Res 48：2659-2668。
反义方法包括设计与编码变体CFH基因的靶核酸互补的多核苷酸 (DNA或RNA)。反义多核苷酸可与mRNA转录本相结合并阻止感兴 趣蛋白质的翻译。尽管优选绝对互补，但并不要求如此。在双链反义多 核苷酸的情况下，由此可测试双链DNA的单链，或者可分析三链体的 形成。杂交能力将取决于互补程度和反义序列的长度。通常，杂交核酸 越长，其可以包含与靶核酸越多的碱基错配并仍然形成稳定的双链体 (或根据情况时的三链体)。本领域技术人员可通过使用测定杂交复合 物熔链温度的常规方法来确定可容忍的错配程度。
与mRNA靶的5′末端比如5′非翻译序列直到且包括AUG起动密码 子互补的反义多核苷酸，应最为有效地抑制该mRNA的翻译。但是， 最近表明与mRNA的3′非翻译序列互补的序列也同样有效地抑制 mRNA翻译(Wagner，R.1994.Nature 372：333)。由此，与变体CFH 基因的5′或3′非翻译、非编码区互补的反义多核苷酸可用于反义方法中 抑制变体CFH mRNA的翻译。与mRNA的5′非翻译区域互补的反义多 核苷酸应包括AUG起动密码子的互补物。与mRNA编码区互补的反义 多核苷酸是较低效的翻译抑制剂但也可用于本发明。无论是否设计成杂 交至mRNA的5′、3′或编码区，反义核苷酸至少应为六个核苷酸长度， 优选低于约100且更优选低于约50、25、17或10个核苷酸长度。
不管所选择的靶序列，优选首先进行体外研究以定量该反义多核苷 酸抑制变体CFH基因表达的能力。优选在这些研究中使用对照以区分 反义基因抑制和反义多核苷酸的非特异性生物作用。还优选在这些研究 中比较靶RNA或蛋白质的水平与内对照RNA或蛋白质的水平。此外， 可以设想使用所述反义多核苷酸所得的结果与使用对照反义多核苷酸 所得结果进行比较。优选对照反义多核苷酸与测试反义多核苷酸具有大 致相同的长度并且对照反义多核苷酸与感兴趣反义序列的差异不超过 阻止与靶序列特异性杂交所必要的那些。
本发明的多核苷酸，包括反义多核苷酸，可以是DNA或RNA或其 嵌合混合物或衍生物或修饰形式，是单链的或双链的。本发明的多核苷 酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰例如以提高该分子的稳 定性、杂交等。本发明的多核苷酸可包括其它附加基团比如肽(如，为 靶向宿主细胞受体)或辅助跨细胞膜(例如参见，Letsinger et al.，1989， Proc Natl Acad Sci USA 86：6553-6556；Lemaitre et al.，1987，Proc Natl Acad Sci USA 84：648-652；PCT公开号WO88/09810，公开于1988年12 月15日)或血脑屏障(例如参见PCT公开号WO89/10134，公开于1988 年4月25日)转运的试剂，杂交-触发的切割剂(例如参见，Krol et al.， 1988，BioTechniques 6：958-976)或嵌入试剂(例如参见，Zon，Pharm. Res.5：539-549(1988))。为此，本发明的多核苷酸可以缀合至另一个分 子，比如肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、杂交触发的切割剂等。
本发明的多核苷酸，包括反义多核苷酸，可包含至少一种修饰碱 基部分，其选自包括但不限于以下的组：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5- 氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟 基三乙基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿 嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基Q核苷(galactosylqueosine)，肌苷， N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基次黄嘌呤，2，2-二甲基鸟嘌 呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6- 腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2- 硫代尿嘧啶，β-D-半乳糖基Q核苷，5-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿 嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧代乙酸(v)， wybutoxosine，假尿嘧啶，Q核苷(queosine)，2-硫代胞嘧啶，5-甲基 -2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶 -5-氧代乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧代乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3- 氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2，6-二氨基嘌呤。
本发明的多核苷酸还可以包含至少一种修饰的糖部分，其选自包 括但不限于以下的组：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
本发明的多核苷酸还可含有中性肽样骨架。这些分子被称为肽核 酸(PNA)-寡聚物并例如描述于Perry-O′Keefe et al.(1996)Proc.Natl. Acad.Sci USA 93：14670和Eglom et al.(1993)Nature 365：566中。PNA 寡聚物的一个优势是它们与互补DNA结合的能力基本不依赖介质的离 子强度，这是由于该DNA的中性骨架。在另一实施方案中，本发明的 多核苷酸含有至少一种修饰的磷酸酯骨架，其选自硫代磷酸酯、二硫代 磷酸酯、二硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、 烷基磷酸三酯、和formacetal或其类似物。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸，包括反义多核苷酸，是 异头寡核苷酸。异头寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂合体，与 常规单位相反，其链相互平行(Gautier et al.，1987，Nucl.Acids Res. 15：6625-6641)。所述寡核苷酸是2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，1987， Nucl.Acids Res.15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue et al.， 1987，FEBS Lett.215：327-330)。
本发明的多核苷酸，包括反义多核苷酸，可通过本领域已知的标 准方法合成，如通过使用自动DNA合成仪(比如购自Biosearch，Applied Biosystems等)。例如，硫代磷酸寡核苷酸可通过Stein et al.Nucl.Acids Res.16：3209(1988)的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可通过使用受控 孔径玻璃聚合物载体而制备(Sarin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：7448-7451(1988))，等等。
尽管可以使用与mRNA编码区互补的反义序列，最优选的是与转 录的非翻译区以及包含起始甲硫氨酸的区域互补的那些。
可将反义多核苷酸递送至体内表达靶基因的细胞。已开发了许多 方法用于将核酸递送至细胞，如，可将它们直接注射入组织位点，或可 系统性施用被设计成靶向期望细胞的修饰核酸(如，与特异性结合靶细 胞表面所表达受体或抗原的肽或抗体相连接的反义多核苷酸)。
但是，在某些情况下可能难以实现足以减弱变体CFH基因或 mRNA活性的反义多核苷酸的细胞内浓度。因此，另一种方法利用重组 DNA构建体，其中将反义多核苷酸置于强pol III或pol II启动子的控 制下。使用这种构建体转染患者体内的靶细胞将导致转录足够量的反义 多核苷酸，其将与变体CFH基因或mRNA形成互补碱基对并由此减弱 CFH蛋白的活性。例如，可将载体引入体内，使得其被细胞吸收并指 挥靶向变体CFH基因或mRNA的反义多核苷酸的转录。这种载体可以 保持游离型或成为染色体整合型，只要其可经转录产生期望的反义多核 苷酸。这种载体可通过本领域的标准重组DNA技术方法构建。载体可 以是质粒、病毒或本领域已知的其它载体，用于在哺乳动物细胞中复制 和表达。启动子可以可操作性连接至编码反义多核苷酸的序列。编码反 义多核苷酸的序列的表达可以通过本领域已知的在哺乳动物细胞优选 人细胞中起作用的任何启动子。这些启动子可以是诱导型或是组成型。 这些启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon， Nature 290：304-310(1981))、在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复中包含的 启动子(Yamamoto et al.，Cell 22：787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动 子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：1441-1445(1981))、金 属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al，Nature 296：3942(1982))等。 任意类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体可用于制备可直接导入组织 位点的重组DNA构建体。作为替代，可使用选择性感染期望组织的病 毒载体，此时可通过另外途径(如全身)来施用。
RNAi构建体-siRNA和miRNA
RNA干扰(RNAi)是描述双链(ds)RNA-依赖型基因特异性转录 后沉默的现象。在哺乳动物细胞实验操作中利用这一现象的初步尝试却 被作为对长dsRNA分子起反应而激活的强烈且非特异性抗病毒防御机 制所干扰。Gil et al.Apoptosis 2000，5：107-114。通过证明合成的21核 苷酸RNA双链可介导哺乳动物细胞内基因特异性RNAi而不引发一般 性抗病毒防御机制从而显著发展该领域。Elbashir et al.Nature 2001， 411：494-498；Caplen et al.Proc Natl Acad Sci 2001，98：9742-9747。结果， 小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)已经成为分析基因功能的 强有力工具。化学合成小RNA是获得有前景结果的一种途径。许多研 究小组也寻求开发可在细胞内产生这种siRNA的DNA基载体。近来， 若干小组已实现了这一目标并公布了相似的策略，通常涉及短发夹 (sh)RNA的转录，该(sh)RNA在细胞内被有效加工形成siRNA。Paddison et al.PNAS 2002，99：1443-1448；Paddison et al.Genes & Dev 2002， 16：948-958；Sui et al.PNAS 2002，8：5515-5520；和Brummelkamp et al. Science 2002，296：550-553。这些报告描述了可特异性靶向许多内源性和 外源性表达基因的siRNA的产生方法。
因此，本发明提供包含RNAi序列的多核苷酸，其通过RNAi或 miRNA机制起作用而减弱变体CFH基因的表达。例如，本发明的多核 苷酸可包含减弱或抑制变体CFH基因表达的miRNA或siRNA序列。 在一种实施方案中，miRNA或siRNA序列约为19个核苷酸至约75个 核苷酸长，或优选地，约25个碱基对至约35个碱基对长。在某些实施 方案中，该多核苷酸为可被核糖核酸酶(如Drosha和Dicer)加工的发 夹环或茎环。
RNAi构建体包含在细胞生理条件下与变体CFH基因的mRNA 转录本的至少一部分的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该双链RNA仅 需要与能够介导RNAi的天然RNA足够相似。靶序列与RNAi构建体 序列之间可容忍的核苷酸错配数目在5个碱基对中不超过1个，或在10 个碱基对中不超过1个，或在20个碱基对中不超过1个，或在50个碱 基对中不超过1个。更重要的是，该RNAi构建体可特异性靶向变体 CFH基因。siRNA双链体中央的错配是最关键的并可基本上消除靶 RNA的切割。相反，在与靶RNA互补的siRNA链3′末端的核苷酸对 于靶识别的特异性没有明显的贡献。
可通过本领域已知的序列比较和比对算法优化序列一致性(参见 Gribskov and Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press， 1991，及其引用的参考)，并且例如通过用于在BESTFIT软件程序中的 Smith-Waterman算法使用缺省参数(如University of Wisconsin Genetic Computing Group)计算核苷酸序列间的百分差异。优选抑制 性RNA和靶基因的部分之间超过90％序列一致性或甚至100％序列一 致性。作为替代，所述RNA的双链区在功能上可定义为能与靶基因转 录物的一部分相杂交的核苷酸序列(如400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；随后洗涤)。
可通过本文所述制备多核苷酸的任意方法来生产包含RNAi序列 的多核苷酸。例如，包含RNAi序列的多核苷酸可通过化学合成法或通 过重组核酸技术制备。所处理细胞的内源性RNA聚合酶可介导体内转 录，或者克隆的RNA聚合酶可用于体外转录。本发明的多核苷酸，包 括野生型或反义多核苷酸，或通过RNAi机制调节靶基因活性的那些， 可以包括对磷酸-糖骨架或核苷的修饰，例如从而降低对细胞核酸酶的 敏感性、提高生物利用度、改善制剂特性和/或改变其它药物代谢动力 学性质。例如，可修饰天然RNA的磷酸二酯连接以包括至少一个氮或 硫杂原子。可针对性修饰RNA结构以允许特异性遗传抑制同时避免对 dsRNA的一般性应答。同样，可修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。 本发明的多核苷酸可通过酶促或部分/全部有机合成而制备，通过体外 酶促或有机合成可导入任何经修饰的核糖核苷酸。
化学修饰RNA分子的方法可以适用于修饰RNAi构建体(例如参 见，Heidenreich et al.(1997)Nucleic Acids Res，25：776-780；Wilson et al. (1994)J MoI Recog 7：89-98；Chen et al.(1995)Nucleic Acids Res 23：2661-2668；Hirschbein et al.(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7：55-61)。仅为了举例说明，RNAi构建体的骨架可以用硫代磷酸酯、 氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合的甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核酸、 包含5-丙炔基-嘧啶的寡聚物或糖修饰物(如2′-取代的核糖核酸苷，α- 构型)修饰。
双链结构可通过单个自身互补的RNA链或两个互补的RNA链形 成。RNA双链可在细胞内或细胞外开始形成。所述RNA可以以允许每 细胞至少递送一个拷贝的量引入。越高剂量(如，每细胞至少5、10、 100、500或1000个拷贝)双链材料可获得越有效的抑制，但较低剂量 也可以有效用于特定应用。抑制是序列特异性的，因为对应RNA双链 区的核苷酸序列因遗传抑制而被靶向。
在某些实施方案中，所述RNAi构建体是“siRNA”。这些核酸约 为19-35个核苷酸长，更优选21-23个核苷酸长，例如在长度上与核酸 酶“dicing”切割较长双链RNA所产生的片段相当。该siRNA被理解 为募集核酸酶复合物并通过与特异性序列配对而将该复合物引导至靶 mRNA。结果，靶mRNA被所述蛋白质复合物中的核酸酶降解或者翻 译被抑制。在一个具体实施方案中，所述21-23个核苷酸的siRNA分子 包含3′羟基。
在另一些实施方案中，所述RNAi构建体是“miRNA”。微RNA (miRNA)是小的非编码RNA，通过与同源mRNA相互作用而指导基 因表达的转录后调节。miRNA通过与蛋白质编码基因的靶mRNA的互 补位点相结合而控制基因表达。miRNA类似于siRNA。通过较大双链 前体分子的核酸裂解切割而加工miRNA。这些前体分子通常是约70个 核苷酸长的发夹结构，在发夹中具有碱基配对的25或更多个核苷酸。 RNA酶III-样酶Drosha和Dicer(其也可用于加工siRNA)切割miRNA 前体而产生miRNA。所加工的miRNA是单链的并结合在称为RISC或 miRNP的蛋白质复合物内。这种RNA-蛋白质复合物靶向互补mRNA。 miRNA抑制靶mRNA的翻译或指导其切割。(Brennecke et al.，Genome Biology 4：228(2003)；Kim et al.，Mol.Cells 19：1-15(2005)。
在某些实施方案中，miRNA和siRNA构建体可通过加工较长的 双链RNA而产生，例如在酶Dicer或Drosha的存在下。Dicer和Drosha 是特异性切割dsRNA的RNA酶III-样核酸酶。Dicer具有独特结构， 其包括解旋酶结构域和双RNA酶III基序。Dicer还包含与 RDE1/QDE2/ARGONAUTE家族同源的区域，该家族在遗传学上与低 等真核生物中的RNAi相关。实际上，在许多情况下，在原本非允许细 胞(non-receptive)中，比如培养的真核细胞或者培养的哺乳动物细胞 (非卵母细胞)或完整有机体中，Dicer的激活或过表达足以允许RNA 干扰。利用Dicer以及其它RNAi酶的方法和组合物描述于美国专利申 请公开No.2004/0086884中。
在一种实施方案中，使用果蝇(Drosophila)体外系统。在这一 实施方案中，含RNAi序列或RNAi前体的多核苷酸与来自果蝇胚胎的 可溶提取物相组合，从而得到一种组合。将该组合保持在将dsRNA加 工成约21至约23个核苷酸的RNA分子的条件下。
可使用本领域技术人员已知的许多技术纯化miRNA和siRNA分 子。例如，凝胶电泳可用于纯化这些分子。作为替代，非变性方法，比 如非变性柱色谱法，可用于纯化siRNA和miRNA分子。此外，色谱法 (如体积排阻色谱)、甘油梯度离心、使用抗体的亲和纯化可用于纯化 siRNA和miRNA。
在某些实施方案中，效应子结构域的siRNA序列的至少一条链具 有长约1至约6个核苷酸或2至4个核苷酸的3′突出端。在另一些实施 方案中，3′突出端长1-3个核苷酸。在某些实施方案中，一条链具有 3′突出端，而另一条链或者为平端或者也具有突出端。各链的突出端长 度可以相同或不同。为了进一步增强siRNA序列的稳定性，可以稳定 化3′突出端以防止降解。在一种实施方案中，通过加入嘌呤核苷酸比如 腺嘌呤或鸟苷核苷酸而稳定化RNA。作为替代，使用修饰类似物替换 嘧啶核苷酸被容忍且不影响RNAi的效力，例如使用2′-脱氧胸苷替换 尿嘧啶核苷3′突出端。缺少2′羟基显著增强突出端在组织培养基中对核 酸酶的抗性并在体内可以是有益的。
在某些实施方案中，包含RNAi序列或RNAi前体的本发明多核 苷酸为发夹结构(称为发夹RNA)。该发夹RNA可外源合成或可通过 RNA聚合酶III启动子的转录在体内形成。制备和使用这种发夹RNA 以在哺乳动物细胞中用于基因沉默的实例已经描述，例如见Paddison et al.，Genes Dev，2002，16：948-58；McCaffrey et al.，Nature，2002， 418：38-9；McManus et al.，RNA 2002，8：842-50；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：6047-52)中。优选地，将该发夹RNA在细胞 或动物中工程化以确保连续且稳定的抑制期望基因。本领域已知通过在 细胞中加工发夹RNA可制备miRNA和siRNA。
在另一些实施方案中，使用质粒递送双链RNA，如作为转录产物。 转录编码序列后，互补性RNA转录物碱基配对而形成双链RNA。
适配体和小分子
本发明还提供特异性结合与AMD相关的变体CFH多肽的治疗性 适配体(aptamer)，由此调节变体CFH多肽的活性。“适配体”可以是 能以高亲和力和特异性结合特异性分子的核酸分子，比如RNA或DNA (Ellington et al.，Nature 346，818-22(1990)；和Tuerk et al.，Science 249，505-10(1990))。最典型地通过在体外选择与靶分子的结合而获得适 配体。例如，可以通过从多核苷酸池中与变体CFH多肽的结合进行体 外选择而获得与变体CFH多肽特异性结合的适配体。但是，体内选择 适配体也是可能的。适配体具有在一定环境中与目标靶分子形成复合物 的特异性结合区域，在相同环境中其它物质不与所述核酸形成复合物。 通过结合的特异性由适配体对其配体(如变体CFH多肽)的相对解离 常数(Kd)来定义，其中该相对解离常数与适配体对于该环境中其它 物质或一般地不相关分子的解离常数相比较。与不相关物质相比，配体 (如变体CFH多肽)在结合适配体时具有更大的亲和力。通常，适配 体对其配体的Kd相比适配体对于环境中不相关物质或共存物质的Kd 至少低10倍。更优选地，该Kd至少低约50倍、更优选至少低约100 倍，最优选至少低约200倍。适配体通常约为10至约300个核苷酸长。 更通常地，适配体约为30至约100个核苷酸长。
本领域已知选择对感兴趣靶标有特异性的适配体的方法。例如， 有机分子、核苷酸、氨基酸、多肽、细胞表面的靶特征、离子、金属、 盐、糖均已表明适于分离可与各自配体特异性结合的适配体。例如，有 机染料比如Hoechst 33258已成功用作体外选择适配体的靶配体 (Werstuck and Green，Science 282：296-298(1998))。其它小有机分子 比如多巴胺、茶碱、磺酰罗丹明B和纤维二糖也已用作配体以分离适配 体。也已分离抗生素的适配体，比如卡那霉素A、利维霉素、妥布霉素、 新霉素B、紫霉素、氯霉素和链霉素。对于识别小分子的适配体的综述， 参见Famulok，Science 9：324-9(1999)。
本发明的适配体可完全由RNA组成。但在本发明的其它实施方 案中，适配体可完全或部分由DNA组成或部分由其它核苷酸类似物组 成。为了特异性抑制体内翻译，优选RNA适配体。优选将这种RNA适 配体作为DNA引入细胞并转录为RNA适配体。作为替代，可将RNA 适配体自身引入细胞。
通常通过使用已知的称为SELEX的体内或体外(最经常体外) 选择技术开发与特定配体结合的适配体(Ellington et al.，Nature 346， 818-22(1990)；and Tuerk et al.，Science 249，505-10(1990))。制备适配 体的方法例如还描述于美国专利No.5,582,981，PCT公开No.WO 00/20040，美国专利No.5,270,163，Lorsch and Szostak，Biochemistry， 33：973(1994)，Mannironi et al.，Biochemistry 36：9726(1997)，Blind， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3606-3610(1999)，Huizenga and Szostak， Biochemistry，34：656-665(1995)，PCT公开No.WO 99/54506，WO 99/27133，WO 97/42317和美国专利No.5,756,291中。
通常，以它们最基本的形式，鉴定适配体的体外选择技术涉及首 先制备具有期望长度且包含至少一些随机或突变区域的DNA大库 (large pool)。例如，用于适配体选择的常见寡核苷酸库可包含20-100 个随机核苷酸的区域，在两端旁侧有约15-25个核苷酸长的确定序列区， 用于结合PCR引物。使用标准PCR技术扩增寡核苷酸库，尽管也可使 用忠实、高效扩增选定核苷酸序列的任何方式。然后在体外转录该DNA 库以产生RNA转录物。然后对该RNA转录物进行亲和色谱，尽管也可 使用基于特异性结合另一分子(如蛋白或任何靶分子)的能力而选择核 酸的任何方法。使用亲和色谱时，通常使转录物经过柱子或与磁珠等接 触，其上已固定了靶配体。库中结合于配体的RNA分子被保留在柱上 或珠上，不结合的序列被洗掉。然后逆转录与配体结合的RNA分子并 再次经PCR扩增(通常在洗脱后)。然后使所选库序列经历另一轮相同 类型的选择。通常，库序列经历总共约3-10轮重复的选择过程。然后 使用标准方法对cDNA进行扩增、克隆和测序以鉴定可用作靶配体的适 配体的RNA分子序列。一旦成功地鉴定了适配体序列，通过从包含诱 变的适配体序列的寡核苷酸库起始再进行选择循环可进一步优化适配 体。为了用于本发明，优选在模拟正常生理条件的盐浓度和温度下选择 结合配体的适配体。
尽管完全缺乏关于结合期望配体的结构类型的已有知识，体外选 择过程的独特性允许分离结合期望配体的适宜适配体。
适配体与相关配体的结合常数优选使得配体具有结合适配体的功 能并且在施用该配体时所得配体浓度下配体具有期望的作用。对于体内 应用，例如，结合常数应使得在远低于血清或其它组织中可达到的配体 浓度之下发生结合。优选地，体内应用所需的配体浓度还低于可引起机 体不期望作用的浓度。
本发明还提供特异性结合于与AMD相关的变体CFH多肽的小分 子和抗体，由此抑制变体CFH多肽的活性。小分子的实例包括但不限 于药物、代谢物、中间体、辅因子、过渡态类似物、离子、金属、毒素 以及天然和合成的聚合物(如蛋白质、肽、核酸、多糖、糖蛋白、激素、 受体和细胞表面比如细胞壁和细胞膜)。
抗体
本发明的另一方面涉及抗体。在一种实施方案中，与变体CFH多 肽特异性反应的抗体可用于检测是否存在变体CFH多肽或抑制变体 CFH多肽的活性。例如，通过使用源自变异CFH肽的免疫原，采用标 准方法可制备抗-蛋白质/抗-肽抗血清或单克隆抗体(例如见Antibodies： A Laboratory Manual ed.by Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press：1988))。哺乳动物，比如小鼠、苍鼠或兔可用免疫原性形式的变 体CFH肽、可引起抗体应答的抗原性片段、或融合蛋白进行免疫。在 一个具体实施方案中，接种小鼠不表达内源性CFH，由此有利于分离 否则将作为抗自身抗体而被清除的抗体。向蛋白质或多肽赋予免疫原性 的技术包括与载体缀合或本领域公知的其它技术。变体CFH肽的免疫 原性部分可在佐剂存在下施用。免疫的进程可通过检测血浆或血清中的 抗体效价而监测。标准ELISA或其它免疫分析可与作为抗原的免疫原 一起使用以评价抗体水平。
使用变体CFH多肽的抗原制备物免疫动物后，可获得抗血清，且 需要时，可从血清中分离多克隆抗体。为了制备单克隆抗体，可从免疫 动物中收获抗体产生细胞(淋巴细胞)，并通过标准的体细胞融合方法 与永生化细胞比如骨髓瘤细胞融合以得到杂交瘤细胞。本领域公知这些 技术，例如包括杂交瘤技术(最初由Kohler and Milstein开发，(1975) Nature，256：495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar et al.，(1983) Immunology Today，4：72)和EBV-杂交瘤技术以制备人单克隆抗体 (Cole et al.，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。杂交瘤细胞可经免疫化学筛选用以制备与变体 CFH多肽特异性反应的抗体并从包含这些杂交瘤细胞的培养物中分离 出单克隆抗体。
本文所用术语“抗体”意在包括也可与变体CFH多肽特异性反应 的片段。使用常规技术可将抗体片段化，并可使用上述用于完整抗体的 相同方式筛选片段。例如通过使用胃蛋白酶处理抗体可产生F(ab)2片 段。可处理所得F(ab)2片段以还原二硫键从而产生Fab片段。本发明抗 体还意在包括双特异性、单链、以及嵌合体和人源化分子，其对变体 CFH多肽具有亲和力，其亲和力来自所述抗体的至少一个CDR区。在 优选的实施方案中，抗体进一步包含连接其上并可被检测的标签(如， 该标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。
在某些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体，在某些实施方 案中，本发明提供产生特异性结合变体CFH多肽的新型抗体的方法。 例如，产生特异性结合变体CFH多肽的单克隆抗体的方法可包括向小 鼠小鼠施用一定量的包含CFH多肽的免疫原组合物，其量可有效刺激 可检测的免疫应答，从小鼠获得抗体产生细胞(如脾细胞)并使该抗体 产生细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤，测试该产生抗体 的杂交瘤以鉴定产生特异性结合变体CFH多肽的单克隆抗体的杂交 瘤。一旦获得，杂交瘤可在细胞培养中扩增，任选在杂交瘤-衍生细胞 产生特异性结合CFH多肽的单克隆抗体的培养条件下。单克隆抗体可 从细胞培养物中纯化。
如本领域通常的理解，与抗体相关的所用术语“特异性反应”意 指，抗体在感兴趣抗原(如变体CFH多肽)和非感兴趣的其它抗原之 间具有足够选择性，使得该抗体至少可用于检测特定类型生物样品中感 兴趣抗原的存在。在使用该抗体的某些方法中，比如治疗性应用，可能 需要结合时的较高特异性。单克隆抗体通常更易于(与多克隆抗体相比) 有效区别期望抗原与交叉反应的多肽。影响抗体：抗原相互作用特异性 的一个特性是抗体对抗原的亲和力。尽管一定范围的不同亲和力均可实 现期望的特异性，通常优选抗体具有约10-6、10-7、10-8、10-9或更低的 亲和力(解离常数)。
此外，用于筛选抗体以鉴定所需抗体的技术可影响所需抗体的性 质。例如，如果抗体用于结合溶液中的抗原，可能期望在溶液中测试结 合。许多不同技术可用于测试抗体和抗原之间的相互作用以鉴定特别期 望的抗体。这些技术包括ELISA、表面等离子体共振结合分析(如 Biacore结合分析，Bia-core AB，Uppsala，Sweden)、夹心分析法(如， 顺磁珠系统，来自IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland)、 Western印迹、免疫沉淀分析和免疫组化法。
6、筛选测验
在某些方面，本发明涉及CFH多肽在鉴定作为CFH多肽激动剂 或拮抗剂的化合物(试剂)中的用途。通过这种筛选鉴定的化合物可在 眼细胞(如上皮和内皮细胞)以及其它组织(如肌肉和/或神经元)的 细胞中进行测试以评价它们在体内或体外调节CFH活性的能力。在某 些方面，通过这种筛选鉴定的化合物调节玻璃疣沉积的形成。任选地， 可在动物模型中进一步测试这些化合物以评价它们在体内调节CFH活 性的能力。
存在许多方法可以筛选靶向CFH多肽的治疗剂。在某些实施方案 中，可进行化合物的高通量筛选以鉴定影响CFH多肽活性的试剂。很 多分析方法，以及基于本公开的内容在此未清楚描述的方法也可以被本 领域技术人员所理解。如本文所述，本发明的测试化合物(药物)可通 过任何组合化学的方法创制。作为替代，所述化合物可以是在体内或体 外合成的天然存在的生物分子。待测试其作为CFH活性调节剂能力的 化合物(试剂)例如可由细菌、酵母、植物或其它生物产生(如天然产 物)、经化学制备(如小分子，包括肽模拟物)或重组产生。本发明所 涵盖的测试化合物包括非肽有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素 和核酸分子。
本发明的测试化合物可作为单个、离散的实体提供或在较复杂的 文库(比如通过组合化学制备)中提供。这些文库例如可包含醇、卤代 烃、胺、酰胺、酯、醛、醚及其它类型的有机化合物。向测试系统提供 测试化合物可以是分离的形式或可以作为化合物的混合物，尤其在初始 筛选步骤中。任选地，化合物可任选用其它化合物来衍生且具有辅助分 离化合物的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括生物素、荧光素、 地高辛、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶 (GST)、光活性交联剂或其任意组合。
在测试化合物与天然提取物文库的许多药物筛选项目中，为了在 给定时间内测试尽可能多的化合物可以期望使用高通量分析。在无细胞 系统中进行的分析，比如可源自纯化或半纯化的蛋白质，通常被优选作 为“初步”筛选，由此在该筛选中产生的系统可快速开发并较易检测由 测试化合物所介导的分子靶中的改变。而且，在体外系统中通常可忽略 测试化合物的细胞毒性或生物利用度的影响，从而分析主要致力于药物 对分子靶标的影响。
在某些实施方案中，通过它们与本发明CFH多肽相互作用的能力 鉴定所述化合物。化合物与CFH多肽的相互作用可以是共价的或非共 价的。例如，该相互作用可以在蛋白质水平使用体外生化方法进行鉴定， 包括光交联、放射性标记配体结合和亲和层析(Jakoby WB et al.，1974， Methods in Enzymology 46∶1)。在某些情况下，化合物可通过基于机理 的分析进行筛选，比如检测结合CFH多肽的化合物的分析。这可包括 固相或液相结合事件。作为替代，编码CFH多肽的基因可与报告系统 (如β-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)一起转染入细胞并优 选通过高通量筛选来筛选文库或用该文库中的个别成员进行筛选。其它 基于机理的结合分析可以使用，例如检测自由能改变的结合分析。进行 结合分析时可使用固定于孔、珠或芯片上的或者被固定化抗体所俘获的 或者经毛细管电泳分辨的靶标。所结合的化合物通常可使用比色法或荧 光或表面等离子体共振来检测。
7、药物组合物
用于治疗患有AMD的对象的本文所述方法和组合物可用于预防 性治疗已诊断或预测有发生AMD风险的个体。在此情况下，以足以延 迟、减缓或预防AMD或相关症状发作的量和剂量来施用所述组合物。 作为替代，本发明所述方法和组合物可用于治疗性治疗患有AMD的个 体。在此情况下，以足以完全或部分地延迟或减缓病情进程的量和剂量、 或足以逆转病情至消除该疾病之程度的量或剂量来施用所述组合物。应 该理解，用于治疗已诊断或预测有发生AMD风险的对象的有效量是足 以治疗对象或治疗该疾病本身的剂量或量。
在某些实施方案中，本发明化合物(如分离或重组制备的编码 CFH多肽的核酸分子或者分离或重组制备的CFH多肽)与药学可接受 的载体一起配制。例如，CFH多肽或编码CFH多肽的核酸分子可单独 或作为药物制剂(治疗组合物)的组分来施用。所述化合物可以配制成 用于人类医学中使用的任何常规方式来施用。
在某些实施方案中，本发明的治疗方法包括局部外用(topically)、 全身或定点(locally)施用。例如，本发明的治疗组合物可配制成用于 例如注射(如静脉内、皮下或肌内)、吸入或吹入(通过口或鼻)或者 口服、口腔含化、舌下、透皮、鼻腔或肠胃外施用。本文所述组合物可 被配制为植入物或装置的一部分。当施用时，用于本发明的治疗组合物 是无热源的、生理可接受的形式。此外，该组合物可以被胶囊化或以粘 性形式注射以递送至存在靶细胞比如眼细胞的部位。技术和剂型通常可 参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.， Easton，PA。除CFH多肽或编码CFH多肽的核酸分子外，治疗用试剂 可任选包括在上述任一组合物中。此外，作为替代或额外地，治疗用试 剂可与根据本发明方法的CFH多肽或编码CFH多肽的核酸分子同时或 相继施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以口服给药，例如采用如 下形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用着味基质，通常是蔗 糖与阿拉伯胶或者黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂或者作为在含水或非水液体 中的溶液剂或混悬剂，或者作为水包油或油包水液体乳液剂，或者作为 酏剂或糖浆，或者作为软锭剂(使用惰性基质，比如凝胶与甘油、或蔗 糖与阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，每个包含预定量的作为活性成分 的试剂。试剂还可作为推注剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste) 来施用。
在用于口服的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗 粒剂等)中，本发明的一种或多种治疗化合物可与一种或多种药学可接 受的载体比如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或下列任何物质相混合：(1)填 充剂或增容剂比如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2) 粘合剂，比如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖 和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂比如甘油；(4)崩解剂，比如琼脂、碳酸 钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、与碳酸钠；(5)溶液阻滞 剂比如石蜡；(6)吸收加速剂比如季铵化合物；(7)润湿剂比如鲸蜡醇 与单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂比如高岭土与膨润土；(9)润滑剂，比 如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸盐及其混 合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂中，药物组合物还可包 含缓冲剂。相似类型的固体组合物还可用作使用比如乳糖或奶糖(milk sugars)以及高分子量聚乙二醇等作为赋形剂的软或硬填充明胶胶囊的 填充剂。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液剂、微乳剂、 溶液剂、混悬剂、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型可包含通常用 于本领域的惰性稀释剂，比如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂比如乙醇、 异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二 醇、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和 芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和失水山梨醇脂肪酸酯、及其 混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括辅剂比如润湿剂、乳化 剂和助悬剂、增甜剂、着味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
混悬剂，除活性物质之外，可包含助悬剂比如乙氧基化异硬脂醇、 聚氧乙烯山梨醇、和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、 琼脂和黄蓍胶、及其混合物。
本文公开的某些组合物可局部外部施用于皮肤或粘膜。该局部外 用制剂可进一步包括一种或多种已知有效作为皮肤或角质层渗透增强 剂的许多试剂。例如2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮，、二甲基乙酰胺、 二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲基亚砜和氮酮(azone)。 还可包括另外试剂以制备化妆品可接受的制剂。例如脂肪、蜡、油、染 料、香料、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。还可包括本领域已知的角质 溶解剂。例如水杨酸与硫。
局部或透皮给药的剂型包括粉剂、喷剂、膏剂、糊剂、乳剂、洗 液、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与药 学可接受的载体混合，以及与所需的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。 除本发明所述化合物(如分离或者重组制备的编码CFH多肽的核酸分 子或者分离或重组制备的CFH多肽)外，膏剂、糊剂、乳剂与凝胶剂 可包含赋形剂，比如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、 纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或其 混合物。
除所述化合物外，粉末与喷剂可以包含赋形剂，比如乳糖、滑石、 硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷剂还可 包含常规抛射剂比如氯氟烃与挥发性非取代烃比如丁烷与丙烷。
应该理解，为个体确定给药方案时应考虑例如改变本发明所述化 合物(如分离或者重组制备的编码CFH多肽的核酸分子或者分离或重 组制备的CFH多肽)作用的许多因素、AMD的严重程度或阶段、给药 途径和个体特性比如年龄、体重和体型大小。本领域普通技术人员可确 定治疗对象所需的剂量。在一种实施方案中，该剂量的范围可以是约1.0 ng/kg-约100mg/kg对象体重。基于组合物，所述剂量可以连续给予 或以周期性间隔给予。例如，在一个或多个分开的时机。多次给予具体 组合物所需的时间间隔可以由本领域技术人员无需过多试验即可确定。 例如，化合物可以每小时、每天、每周、每月、每年(如以时间释放形 式)给予或作为一次给药。
在某些实施方案中，适于胃肠外施用的药物组合物可含有CFH多 肽或编码CFH多肽的核酸分子，并组合有一种或多种药学可接受的无 菌等渗含水或非水溶液、分散剂、混悬剂或乳液剂，或在临用前即时可 重构成无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、 抗菌剂、使制剂与目标受体的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。可 用于本发明药物组合物的适宜的含水和非水载体的实例包括水、乙醇、 多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物、植物油 比如橄榄油、和可注射的有机酯比如油酸乙酯。例如通过使用涂敷材料 (coating materials)比如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持期望颗 粒大小以及通过使用表面活性剂可维持适当的流动性。
本发明的组合物还可包含辅剂，比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和 分散剂。通过包括许多抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁 醇、苯酚、山梨酸等可预防微生物作用。还可以期望在该组合物中包括 等渗剂比如糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂比如单硬脂酸铝 与明胶可导致注射药物形式的吸收延长。
在某些实施方案中，本发明还提供用于在体内产生CFH多肽的基 因疗法。该疗法通过将CFH多核苷酸序列引入缺少正常CFH功能的细 胞或组织内以实现其疗效。使用重组表达载体比如嵌合病毒或胶体分散 体系可实现CFH多核苷酸序列的递送。靶向性脂质体也可用于治疗性 递送CFH多核苷酸序列。
如本文所教导的可用于基因疗法的多种病毒载体包括腺病毒、疱 疹病毒、痘苗病毒、或RNA病毒比如逆转录病毒。逆转录病毒载体可 以是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。其中可插入单外源基因的逆转录病毒 载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠 肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)以及劳斯肉瘤病毒 (RSV)。许多其它的逆转录病毒载体可以掺入多个基因。这些载体均 可转移或掺入选择标记基因以便识别并产生转导细胞。通过附加例如 糖、糖脂或蛋白质可使得逆转录病毒载体具有靶特异性。优选使用抗体 进行靶向。本领域技术人员将认识到可将特异性多核苷酸序列插入逆转 录病毒基因组中或附着于病毒包膜上，以允许靶特异性递送包含CFH 多核苷酸的逆转录病毒载体。在一种优选实施方案中，载体靶向眼细胞 或组织。
作为替代，通过常规磷酸钙转染，组织培养细胞可用编码逆转录 病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染。然后用包含感兴趣基 因的载体质粒转染这些细胞。所得细胞将逆转录病毒载体释放入培养基 中。
用于CFH多核苷酸的另一靶向递送系统是胶体分散体系。胶体分 散系包括高分子复合物、纳米胶囊、微球、小珠以及基于脂质的系统， 包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体体系是 脂质体。脂质体是可用作体外与体内递送载体的人工膜泡。RNA、DNA 和完整病毒粒子可被包封在水性内部并以生物活性形式递送至细胞(例 如参见，Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.，6：77，1981)。使用脂质体载 体的高效基因转移方法是本领域已知的，例如参见Mannino，et al.， Biotechniques，6：682，1988.脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常还组 合有甾类尤其是胆固醇。还可使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理 性质取决于pH、离子强度和是否存在二价阳离子。
用于脂质体制备的脂质的实例包括磷脂酰化合物，比如磷脂酰甘 油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂类、 以及神经节苷脂。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰 胆碱以及二硬脂酰基磷脂酰胆碱。脂质体的靶向也可能基于例如器官特 异性、细胞特异性以及细胞器特异性，这些为本领域已知。
此外，药物制剂可以基本由在可接受稀释剂中的基因递送系统组 成，或者可以包含其中包埋了基因递送载体的缓慢释放基质。作为替代， 当由重组细胞完整地制备整个基因递送系统时，例如逆转录病毒包装， 该药物制剂可包含产生所述基因送递系统的一个或多个细胞。就后者而 言，例如通过可再释放和可生物降解的装置可提供引入病毒包装细胞的 方法。近年来，已开发并体内试验了许多缓慢释放聚合物装置用于受控 的药物递送，包括蛋白质生物药物，还可以通过操控聚合物组成和形式 来改变病毒粒子的释放。许多生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括 可生物降解以及不可降解的聚合物，均可用于形成通过在特定靶点植入 的细胞而持续释放病毒粒子的植入物。本发明的这些实施方案可用于递 送外源纯化病毒，其已被掺入聚合物装置中，和用于递送由包封在聚合 物装置内的细胞产生的病毒粒子。
本领域普通技术人员可确定治疗对象所需的量。应该理解，为个 体确定给药方案时，应考虑例如改变本发明所述化合物作用的多种因 素、AMD的严重性或阶段、给药途径以及个体的独特性质比如年龄、 体重和体型大小。本领域普通技术人员可确定治疗对象所需的剂量。在 一种实施方案中，该剂量的范围可以是约1.0ng/kg-约100mg/kg对象 体重。可持续给药或周期性间隔给药。例如，在一个或多个分开的时期。 本领域技术人员无需过多试验即可确定多次给予特定组合物所需的时 间间隔。例如，可以每小时、每天、每周、每月、每年(如以时间释放 形式)施用化合物或作为一次施用。如本文所用，术语“对象”意指能 受AMD影响的任何个体动物。对象包括但不限于人、灵长类、马、鸟、 牛、猪、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂和兔。在一个优选实施方案 中，对象是人。
用于本文所述方法的样品可包含来自眼、耳、鼻、牙、舌、表皮、 上皮、血、泪、唾液、粘液、尿道、尿、肌肉、软骨、皮肤或任何其它 组织的细胞或体液，从中可得到充足的DNA或RNA。
样品应经充分加工以提供DNA或RNA以用于本文所述方法中进 行分析。例如，可加工样品以便来自该样品的DNA可用于扩增或与另 一个多核苷酸杂交。所加工的样品可以是粗制裂解物，其中可用的DNA 或RNA没有从其它细胞物质中纯化。作为替代，可加工样品以从其天 然来源的一种或多种污染物中分离可用的DNA或RNA。可使用本领域 已知的任何方法加工样品以使得DNA或RNA可用于本文所述方法中进 行分析。加工样品的方法非限制性地可包括裂解和/或纯化细胞与细胞 裂解物的机械、化学或分子手段。加工方法可包括例如离子交换色谱、 体积排阻色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳 和使用对所述多肽的特定表位具有特异性之抗体的免疫亲和纯化。
8.试剂盒
本文还提供试剂盒，如，用于治疗目的的试剂盒或用于在来自个 体的样品中检测变体CFH基因的试剂盒。在一种实施方案中，试剂盒 包含至少一个容器装置，其中放置预定剂量的多核苷酸探针，该探针在 严谨条件下杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异。在另一种实 施方案中，试剂盒包含至少一个容器装置，其中放置预定剂量的多核苷 酸引物，该引物在严谨条件下杂交至邻近与人发生AMD相关的CFH 基因变异的一侧。在另一个实施方案中，在严谨条件下杂交至与人发生 AMD相关的CFH基因变异的另一侧的第二多核苷酸引物以预定剂量 提供。试剂盒进一步包含使用该治疗试剂盒或检测样品中CFH的诊断 试剂盒的标签和/或说明。试剂盒还可包括包装材料，比如但不限于冰、 干冰、泡沫聚苯乙烯、泡沫、塑料、玻璃纸、收缩包装、气泡包、纸、 卡板、淀粉花生、扭曲带、金属夹、金属罐、燥石膏、玻璃、和橡胶(参 见www.papermart.com可得的产品，例如包装材料)。
除非另有说明，本发明方法的实施将采用细胞生物学、细胞培养、 分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技 术，其在本领域技能之内。这样的技术在文献中有充分地说明。例如参 见，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.， 1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S. Patent No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J. Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J. Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R. Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B. Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise， Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987， Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London， 1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M. Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo， (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.， 1986)。
实施例
下面的实施例用于解释说明的目的而非意在以任何方式进行限 定。
实施例1：对AMD相关基因的全基因组SNP关联性
本文描述了对与AMD相关基因的全基因组病例对照的关联性研 究。两个关键因素用于设计该试验；选择明确定义的表型用于病例和对 照。病例的定义基于存在至少一些大玻璃疣的定量照相评价并结合威胁 视觉的AMD(地理萎缩症(geographic atrophy)或新血管AMD)的 照相证据。对照的定义基于没有玻璃疣或仅有少量小玻璃疣的研究参与 者。使用统计学保守方法以校正所测试的大量SNP来分析数据，由此 保证假阳性的实际概率不超过所报道的p-值。
将参与年龄相关眼病研究(Age-Related Eye Disease Study， AREDS)(AREDS Research Group，Arch Ophthamol 119，1417，(2001)) 的个体的亚组用于该关联性研究。从AREDS样本中，在最近的研究访 问中，96个病例对象被鉴定为或者有单眼新生血管形成(50例)或者 在黄斑中央或非中央区域有地理萎缩(46例)。这些病例对象的另一眼 要求具有至少一个大玻璃疣(直径＞125μm)且玻璃疣总面积相当于直 径至少为1061μm的圆。选择具有大玻璃疣和威胁视觉的AMD的研究 参与者，因为可能有发展成脉络膜新血管形成或地理萎缩的许多前兆。 对照组为50名来自在参与AREDS期间没有或很少有玻璃疣(在每眼 中直径＜63μm)的AREDS样本的个体。所有个体自我识别为“白人， 非西班牙裔”。尽可能地，在病例组与对照组中保持同样的性别以及吸 烟状态的比例。有意地选择较病例组年长者作为对照组以增加它们保持 没有AMD的概率(表1)。
表1.样品表型总结
实施例2：在研究群体中个体的基因分型和SNP鉴定
使用Affymetrix GeneChip Mapping 100K Set微阵列对每个个体 进行基因分型(H.Matsuzaki et al.，Nat Methods 1，109(2004))。该作 图分析由两种各约50,000SNP的芯片(XbaI和HindIII)的组成，用 于每个个体。约250ng基因组DNA经两种限制性酶XbaI和HindIII 消化并根据Affymetrix操作方案加工(H.Matsuzaki et al.，Nat Methods 1，109(2004))。使用GDAS软件(Affymetrix)分析图像。对于来自各 芯片的数据，使用两种内部质量控制措施：呼叫率总是超过95％且对于 X染色体的杂合性正确地鉴定个体的性别。将31个相同的SNP置于两 芯片上并检验它们对于同一个体获得相同的基因型以确保样品没有混 淆。
进行三次试验以测试该系统的重复性。首先，使用Xba芯片处理 4个样品两次。接着，与样品平行将由Affymetrix提供的参考DNA阳 性对照的两个复本在Xba芯片上分析。最后，使用Affymetrix 10K SNP 平台比较3个个体的结果以检验该分析的准确性(H.Matsuzaki et al.， Genome Res 14，414(2004))。
评价对于各SNP产生基因型呼叫的个体的百分比，以检查对于每 个个体SNP的基因分型质量。呼叫率100％的SNP意味着每一个体均 对于该SNP成功地分配了基因型且没有丢失数据。呼叫率需要至少为 85％以除去基因型一致性存在问题的SNP。还除去在数据中为单态性的 SNP，因为这些SNP无法提供信息。除去其中基因型频率偏离Hardy- Weinberg平衡预期(HWDχ2＞25，P＝0.05，1df，经Bonferroni校正后) 的SNP，因为其较真实不平衡可能包含更多基因分型错误。在全部样品 中没有观察到纯合子的SNP也因可能由于错误而除去。总之，在基因 分型的116,204个SNP中，105,980个具有呼叫率至少85％的SNP， 并且观察到两个等位基因，至少观察到一个纯合子，并且发现HWDχ2≤ 25从而被考虑。其中，分析了位于22个常染色体上的103,611个SNP。
表2中可见基因分型质量的总结。
表2.基因分型质量控制和信息提供
＊对于大部分，当SNP不匹配时，其是因为SNP之一未被呼叫。在4485个比较中仅观察到3个错 配，其相当于99.93％的一致性。
实施例3：SNP与疾病状态关联性的统计学分析
对每个SNP测试等位基因与疾病状态的关联性。构建等位基因频 率的2x2列联表(contingency table)。在无效假设与1自由度无关联性 下基于中央χ2分布，计算Pearson χ2值和P-值。通过使用Bonferroni 校正以校正多次测试的这种名义P-值，其中仅考虑p值小于 0.05/103,611＝4.8x10-7的SNP。这就产生了Bonferroni-校正的P-值。该 校正已知是保守的且由此可能“过度校正”原始p-值(L.M.Mclntyre， E.R.Martin，K.L.Simonsen，N.L.Kaplan，Genet Epidemiol 19，18 (2000))。尽管该技术可能忽略真是关联性，但其调整了大量多重比较且 得到了没有低估假阳性率的p-值。
基因组对照的两种方法用于寻找群体分层(stratification)，GC 和GCF(B.Devlin，S.A.Bacanu，K.Roeder，Nat Genet 36，1129 (2004))。在第一种方法中，中位χ2值被当作很多SNP被假设与该疾病 无关联性(无关SNP)的等位基因关联性。该测试统计χ2(1)值除以该中 值，使用χ2分布检验显著性。作为替代，对于GCF方法，使用无关χ2统计的均值而非中值；商数(quotient)的显著性经F(1，L)分布来检验， 其中L是所用无关SNP的数目(B.Devlin，S.A.Bacanu，K.Roeder，Nat Genet 36，1129(2004))。使用两种不同组的不相关SNP：除两种显著(见 下)SNP外，所有SNP均成功地基因分型，两芯片之间共有的31个 SNP的组合用于该分析(参见上述实施例2)。
通过寻找在其中观察到所有四个配子(R.R.Hudson，N.L. Kaplan，Genetics 111，147(1985))的邻近SNP且在那结合该区域而定 义候选区。为了观察在候选区内SNP之间的连锁不平衡，使用PHASE 2.1版本推断该区域中的单倍型频率(M.Stephens，P.Donnelly，Am J Hum Genet 73，1162(2003)；M.Stephens，N.J.Smith，P.Donnelly，Am J Hum Genet 68，978(2001))。基于推断的在整个区域的单倍型频率，通 过首先计算由整体单倍型频率所隐含的两-基因座单倍型频率以计算成 对连锁不平衡。然后使用标准方程(D.L.Hartl，A.G.Clark，Principles of Population Genetics(Sinauer Associates，Sunderland，MA，ed.Third， 1997))并使用GOLD程序作图(G.R.Abecasis，W.O.Cookson， Bioinformatics 16，182(2000))计算连锁不平衡的量度D′值。
为了定义4-配子区内的较小单倍型模块，使用HapMap数据网站 (http://www.hapmap.org)。下载SNP在rs10494744至rs10484502区 域中的SNP基因型。下载CEU群体(北欧和西欧祖先的CEPH犹他州 群体)基因型并使用Haploview 3.0版本观察。然后使用Gabriel et al(S. B.Gabriel et al.，Science 296，2225(2002))的方法和参数来定义单倍型 模块。
跨由HapMap模块限定的较窄区域的单倍型也可通过PHASE 2.1 版本推断。考虑进一步分析估计频率至少为1％的单倍型。使用最大简 约的PHYLIP 3.62(″dnapars″程序)来构建系统树。对于单倍型，计 算巢式进化枝框架(nested cladistic framework)中的优势比(P. Armitage，G.Berry，Statistical Methods in Medical Research(Blackwell Scientific Publications，Oxford，ed.Second，1987)；A.R.Templeton，E. Boerwinkle，C.F.Sing，Genetics 117，343(1987))。
计算优势比、置信区间和群体归因风险度(population attributable risk)，其描述于P.Armitage，G.Berry，Statistical Methods in Medical Research(Blackwell Scientific Publications，Oxford，ed.Second，1987) 中。感兴趣等位基因的群体频率(参见下面实施例4)相对高，对于纯 合rs380390和rs1329428分别为23％和41％。因此，从此处所用的病 例对照设计研究中所必需计算的优势比将过高估计(没有改变显著性水 平)需要计算生命期风险的等价相对风险估计。前瞻性队列研究设计将 提供在有或没有遗传等位基因的个人的生命期风险的有效估计。
实施例4：补体因子H基因的多态性与AMD相关
在常染色体SNP中只有两个，rs380390和rs10272438，与疾病状 态显著相关(Bonferroni校正后分别为p＝0.0043和p＝0.0080；图1A)。 对于病例-对照关联性研究比如这一个的一种批评是群体分层可导致假 阳性结果。如果从具有不同等位基因频率的、不同祖先的群体中抽取病 例和对照，有可能检测到这些群体差异而非与疾病相关的基因座。本研 究中的所有个体自我识别起种族为非西班牙裔白人，从同一AREDS群 体中抽取所有病例和对照个体。存在一些差别：从办公室人员中招募病 例而从无线电和报纸广告人员中招募对照(AREDS Research Group， Ophthamology 107，2224(2000))。发现＞100,000个中有两个SNP提示 没有遗传分层，但使用基因组控制方法以控制该概率(B.Devlin，S.A. Bacanu，K.Roeder，Nat Genet 36，1129(2004))。始终发现这些测试的显 著性没有扩大，因此这两个SNP与疾病显著相关。
SNP rs380390在所有个体中成功地基因分型。在21个个体中， 没有确定SNP rs10272438的基因型，这似乎超出了Hardy-Weinberg平 衡(HWE χ2＝36)，表明可能出现基因分型错误。通过重测序确定丢失 的基因型。包括这些额外的基因型之后，经Bonferroni校正后关联性不 再显著。此外，具有第3低p-值的SNP，rs1329428(Bonferroni校正 后p＝0.14)，在同一染色体上距离rs380390为1.8kb。这两个邻近基因 座处的基因型频率在病例与对照人群中明显不同(图1B)。rs380390的 C等位基因和rs1329248的C等位基因的纯合子明显发生AMD的风险 增加(表1)。由这些基因型造成的风险占群体中观察到病例的约45％ (rs380390)-61％(rs1329248)(表3)。因此，我们决定集中于这两 种SNP作为标记我们最有前景的基因座。
表3.对于不同基因型和单倍型的风险比和群体归因风险度
rs380390(C/G) rs1329428(C/T) 风险等位基因 C C 等位相关χ2名义p-值 4.1e-08 1.4e-06 优势比(显性)(95％CI) 4.6(2.0-11) 4.7(1.0-22) PAR(95％CI) 70％(42％-84％) 80％(0％-96％) HapMap CEU中的频率 0.70 0.82 优势比(隐性)(95％CI) 7.4(2.9-19) 6.2(2.9-13) PAR(95％CI) 46％(31％-57％) 61％(43％-73％) HapMap CEU中的频率 0.23 0.41
显性和隐性是指由具有至少一拷贝(显性)和两拷贝(隐性)风 险等位基因组成的风险因子。PAR是群体归因风险度。显性优势 比和PAR比较AMD在具有一拷贝风险等位基因的个体中相对于 没有风险等位基因拷贝的个体中的可能性。隐性优势比和PAR 比较AMD在具有两拷贝风险等位基因的个体中相对于不超过一 拷贝风险等位基因的个体中的可能性。从CEU HapMap群体(北 欧和西欧祖先的犹他居民的CEPH收藏)中取得风险基因型的群 体频率。
rs380390和rs1329248位于补体因子H(CFH)的基因的内含子 中。由于这两个SNP是非编码的并且似乎都不改变保守序列，这两个 SNP可能与对应的功能突变处于连锁不平衡中。为了圈定其中可能存在 功能突变的区域，分析遍及该区域的连锁不平衡(图2A)。这两个关联 SNP位于长约500kb的高度连锁不平衡区域中。由于这一区域较其它常 见的高度连锁不平衡块更长(S.B Gabriel et al.，Science 296，2225 (2002))且在该区域很长一段内没有我们数据组中的SNP(图2B)，使 用具有更密集SNP覆盖的其它数据源来细化该区域。
来自International HapMap计划的数据用于分析北欧和西欧祖先 的犹他居民群体(CEPH样本)中连锁不平衡的模式(The International HapMap Consortium，Nature 426，789(2003))。在感兴趣的500kb区 中，在该数据组中存在152个SNP。使用连锁不平衡块的标准定义(S. B Gabriel et al.，Science 296，2225(2002))，发现这两个相关SNP存在 于41kb长的块内并且完全包含在CFH基因之内(图2C)。
从本研究数据组中在该41kb区域存在6个SNP。这些SNP形成 4个频率高于1％的优势单倍型(表4)。综合而言，这4个单倍型代表 本研究中99％的染色体。重建所推断的单倍型并构建系统进化树允许评 价单倍型之间的进化关系(图2D)。使用对各个体所推断的单倍型，计 算在显性和隐性模型下巢式进化枝框架中的疾病优势比(A.R. Templeton，E.Boerwinkle，C.F.Sing，Genetics 117，343(1987))。单倍型 N1赋予了最高的风险，其是包含在SNP rs380390处风险等位基因的仅 有单倍型。
表4.具有推定疾病变体的单倍型块中的单倍型
名称 rs2019727 rs10489456 rs3753396 rs380390 rs2284664 rs1329428 频率 N1 A C T C C G 0.59 N1 A C T G C G 0.0068 N3 A C T G T A 0.12 N4 A T C G C G 0.15 N5 T C T G C A 0.12 N6 T C T G C G 0.0071
使用程序PHASE估算单倍型频率(M.Stephens，P.Donnelly，Am J Hum Genet 73，1162(2003)；M.Stephens，N.J.Smith，P.Donnelly，Am J Hum Genet 68，978 (2001))。用于构建所述单倍型的SNP是来自由HapMap数据所定义41kb单倍 型块中发现的作图微阵列的SNP。频率是各单倍型在组合的病例和对照群体中 的估计频率。在初始分析中显示关联性的两种SNP以黑体表示。
具有至少一拷贝该单倍型使AMD风险增加4.6倍(95％CI 2.0-11)。具有两拷贝该单倍型使AMD风险增加7.4倍(95％CI 3.0-19)。 由此，应在单倍型N1周围发现功能相关的突变。该突变将发生于CFH 基因的某处，因为该41kb单倍型块完全在CFH内。
实施例5：重测序证明CFH中的变异与AMD相关
为了鉴定引起易感AMD的功能突变，选择96名个体(66名病例 和30名对照)用于外显子的重测序，包括外显子/内含子连接处。选择 大多数这些个体的原因或者是SNP rs380390是纯合的(代表相反风险 组)或者是SNP rs10272438没有成功地基因分型(相同的板用于重测 序该SNP进行基因分型)。随机选择3名另外个体以得到整板96例。 由Genaissance(New Haven，CT)进行引物设计、PCR扩增、双向测 序PCR产物和突变分析。
测序所有CFH外显子，包括41kb块之外的，以及SNP rs380390 区作为对照。优先测序SNP rs380390处的纯合子以便更易于确定单倍 型。在93名个体中成功地重测序SNP rs380390；来自重测序的基因型 在所有病例中匹配原来的基因型。鉴定了共50个多态性：其中17个具 有至少5％的较小等位基因频率(minor allele frequency)(表5)。在这 17个中，三个代表非-同义突变。若这些SNP基于等位基因关联性χ2量度进行排列，在非-同义突变中SNP rs1061170最为相关。该SNP代 表酪氨酸和组氨酸之间的突变。该SNP位于CFH外显子9中，在41kb 单倍型块的仅2kb上游。将该SNP加入单倍型分析中显示，97％具有 最高-风险单倍型(N1)的染色体也具有该风险等位基因(His)。
表5.通过重测序鉴定的新多态性
区域 位置 变化 类型 MAF AA变化 rs号 启动子 120992 A/G 非编码的 0.005263 启动子 120865 A/G 非编码的 0.010526 启动子 120546 C/T 非编码的 0.242105 rs3753394 启动子 120410 T/C 非编码的 0.005263 启动子 120294 A/G 非编码的 0.005263 内含子1 99391 C/T 非编码的 0.117021 rs511397 外显子2 99242 T/G 非同义的 0.005319 Ser 58 Ala 外显子2 99230 G/A 非同义的 0.117021 Val 62 Ile rs800292 内含子2 99114 GG//AA 非编码的 0.005319 内含子3 98283 T/C 非编码的 0.005263
内含子3 98188 T/G 非编码的 0.005263 外显子4 96315 G/A 非同义的 0.005263 Arg 127 His 外显子7 87139 A/C 同义的 0.415789 rs1061147 内含子7 83059 T/C 非编码的 0.005263 内含子7 82966 G/T 非编码的 0.410526 rs482934 内含子7 82957 A/G 非编码的 0.005263 外显子9 82232 C/A 非同义的 0.005208 Gln 400 Lys 外显子9 82226 C/T 非同义的 0.414894 His 402 Tyr rs1061170 内含子9 58652 T/C 非编码的 0.005319 外显子10 58516 G/A 同义的 0.22043 rs2274700 内含子10 58319 A/G 非编码的 0.005319 rs203678 内含子10 58260 C/G 非编码的 0.005319 内含子10 56838 G/T 非编码的 0.367021 rs203674 外显子12 47084 G/A 非同义的 0.005263 Val 609 Ile 内含子12 46992 T/G 非编码的 0.005208 外显子13 45721 A/G 同义的 0.143617 rs3753396 外显子15 43875 A/G 同义的 0.005376 内含子15 40549 A/G 非编码的 0.215054 rs7514261 内含子15 40445 C/T 非编码的 0.021277 内含子15 40412 G/C 非编码的 0.365591 rs380390 内含子15 40335 G/C 非编码的 0.005319 rs380060 内含子15 40179 C/T 非编码的 0.215054 rs7540032 内含子15 35577 T/G 非编码的 0.005208 rs435628 内含子15 35537 C/A 非编码的 0.357895 rs375046 内含子16 35263 C/T 非编码的 0.005263 rs428060 外显子17 34821 C/T 同义的 0.026316 外显子17 34786 G/T 非同义的 0.005263 Ser 890 Ile rs515299 内含子17 31825 A/C 非编码的 0.005319 外显子18 31689 G/T 非同义的 0.154255 Glu 936 Asp rs1065489 内含子18 30673 T/G 非编码的 0.005556 rs385892 内含子18 30547 T/C 非编码的 0.111702 rs16840522 内含子18 30546 A/G 非编码的 0.005319 rs385543 外显子19 30396 G/T 非同义的 0.005319 Val 1007 Leu rs534399 内含子19 28886 T/C 非编码的 0.154255 rs513699 外显子20 28877 C/T 同义的 0.154255 rs513729 外显子20 28867 A/T 非同义的 0.015957 Asn 1050 Tyr 内含子20 28592 A/G 非编码的 0.012987 内含子20 26589 G/C 非编码的 0.005618 外显子22 25219 C/A 非同义的 0.005556 Pro 1166 Gln 外显子22 25088 C/T 非同义的 0.005618 Arg 1210 Cys
各多态性的定位表示在GenBank登记号AL049744.8(SEQ ID NO：9)上或GenBank 登记号AL049744.8的互补DNA链上的位置。MAF是较小等位基因频率。
其它数据支持了这一发现：CFH中突变与AMD相关。CFH基因 位于染色体1q31，该区域先前已经6次独立的连锁扫描鉴定为与AMD 相关(J.Majewski et al.，Am J Hum Genet 73，540(2003)；J.M.Seddon， S.L.Santangelo，K.Book，S.Chong，J.Cote，Am J Hum Genet 73，780 (2003)；D.E.Weeks et al.，Am J Hum Genet 75，174(2004)；G.R. Abecasis et al.，Am J Hum Genet 74，482(2004)；S.K.Iyengar et al.，Am J Hum Genet 74，20(2004)；and D.W.Schultz et al.，Hum Mol Genet 12， 3315(2003))。在这些连锁研究之一中，使用单个大家系，作者推断该 区域中不同基因中的突变(HEMICENTIN-1)负责AMD(D.W.Schultz et al.，Hum Mol Genet 12，3315(2003))。该结论基于观察到在所有测试 的多态性中只有HEMICENTIN-1突变与疾病状态完美共分离。但在三 个独立的、基于单个群体的关联性研究中没有发现HEMICENTIN-1中 突变与AMD一般性相关(G.R.Abecasis et al.，Am J Hum Genet 74，482 (2004)；M.Hayashi et al.，Ophthalmic Genet 25，111(2004)；and G.J. McKay et al.，Mol Vis 10，682(2004))。CFH中突变，如本文所述，由 此更可能是在染色体1q31处观察到连锁信号的原因。
实施例6：C5b-9复合物在患AMD的对象眼中的免疫定位
补体级联的许多成分，包括末端C5b-9复合物，已被鉴定为患 AMD的对象眼中玻璃疣的组分(L.V.Johnson，W.P.Leitner，M.K. Staples，D.H.Anderson，Exp Eye Res 73，887(2001)；R.F.Mullins，S.R. Russell，D.H.Anderson，G.S.Hageman，FASEB J 14，835(2000))。检查 4名AMD患者的眼睛以寻找C5b-9的存在(图4)。检查了4名捐献者 死后视网膜。3名通过抗盲基金(FFB，the Foundation Fighting Blindness)眼睛捐献项目获得。所有这些均经临床诊断为干AMD。通 过耶鲁医学院尸检部门获得一对石蜡包埋的来自86岁高龄高加索女性 的眼睛。没有获得临床病史。在组织学上，这些视网膜具有多个大的或 与最小RPE融合中的玻璃疣并且光感受器丧失符合早期AMD诊断。
从耶鲁医学院获得了研究人死后捐赠眼球的许可。
摘除术后，将眼球固定于4％多聚甲醛、0.5％戊二醛的0.1M磷 酸缓冲液中几天。将固定的眼球移至2％多聚甲醛中储存。从各AMD 供体眼球中获取6个0.5cm圆孔组织。其中3个选自连接处萎缩的中央 视网膜与更正常视网膜，其余3个选自周边视网膜。将视网膜组织塞包 埋入石蜡中并切成5μm切片。
脱除石蜡并再水化后，通过在微波炉内在10mM柠檬酸钠(pH 6.0)中煮沸10分钟以进行抗原恢复。允许切片冷却20分钟，之后在 5％H2O2中进行5分钟的内源性过氧化酶阻断。使用抗人活化补体 C5b-9的小鼠单克隆抗体(Quidel Corporation，San Diego，CA， catalogue #A239)进行免疫组化。一级抗体的使用浓度为1∶250的1X PBS。生物素化山羊抗小鼠(cat# B A9200)二级抗体(Vector，Burlingame， CA)以1∶200的浓度使用。镍增强二氨基联苯胺(DAB；cat # SK4100； Vector)用于显示结合抗体。通过省略一级抗体而获得阴性对照。使用 装备有鉴别干涉对比透镜的Zeiss Axioplan显微镜和Zeiss Axiocam数 码相机获得图象。
CFH免疫荧光显微分析
将供体眼球包埋入最适切割温度化合物(OCT；Miles Laboratory， Elkhart，IN)中，快速冷冻，并于-70℃保存。以8-10μm切割冷冻视 网膜切片并置于载玻片上(Superfrost/Plus；Fisher Scientific，Fair Lawn， NJ)。所得的所有人眼球均征得供者知情同意，根据赫尔辛基宣言和 Institutional Review Board(IRB)的原则进行使用人眼球的研究。
为了免疫荧光标记，将人视网膜的冷冻切片固定于4％多聚甲醛 的磷酸盐缓冲液(PBS)中10分钟。使用稀释于IC缓冲液(PBS，含 0.2％Tween-20、0.1％叠氮化钠)中的5％正常驴血清(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)封闭该组织切片30分钟，使用在染 色缓冲液(IC缓冲液加1％正常驴血清)中以1∶200稀释的羊抗-人因子 H抗体(Quidel，Santa Clara，CA)在室温孵育1小时。切片在IC缓冲 液中重复洗涤并用1∶250稀释于染色缓冲液中的核染料4′，6′-二氨基-2 苯基吲哚(DAPI；1μg/mL)和Alexa-488驴抗-羊抗体(Molecular Probes， Eugene，OR)孵育1小时。用IC缓冲液重复洗涤后，将切片覆盖于封 固剂(Gel Mount；Biomeda，Foster City，CA)中并盖上玻片。对于对照， 使用纯化的人因子H蛋白(Calbiochem，La Jolla，CA)以3μg比1μl 抗体的比例与抗-人因子H抗体一起预孵育1小时。然后如前所述将预 处理的抗体用于染色组织切片。在装有Nomarski光学系统的激光扫描 共焦显微镜(SP2型；Leica Microsystems，Exton，PA)上分析样本。 在相同的扫描条件下获取免疫标记和阴性对照切片的图象。图象用 Photoshop(Adobe Systems，San Jose，CA)处理。
在所有患者中，注意到在玻璃膜(Bruch′s membrane)内有活化 补体C5b-9沉积。免疫染色经常扩展至包括毛细血管间的立柱 (intercapillary pillars)，并且在玻璃疣内有强染色。在血管基底 (stroma vascularis)中很少观察到染色。但是，当其存在时，其总是 位于脉络丛静脉的内壁(朝向视网膜)中，以及在极少情况下位于动脉 内壁中。在视网膜或切片的其它地方没有观察到C5b-9免疫染色。阴性 对照没有显示任何染色。关于玻璃疣组成的这些和其它生化分析可表明 AMD是由于异常的炎症过程，其中不恰当的补体活化发挥了作用(G.S. Hageman et al.，Prog Retin Eye Res 20，705(2001))。这得到了AMD小 鼠模型的支持，其中在玻璃疣内发现了补体成分(J.Ambati et al.，Nat Med 9，1390(2003))。
此外，年龄和吸烟，AMD的两种明显风险因素，影响补体因子H 的血浆水平(J.Esparza-Gordillo et al.，Immunogenetics 56，77(2004))。 在来自人RPE和脉络膜的EST文库也观察到CFH序列(G.Wistow et al.，Mol Vis 8，205(2002))。免疫荧光试验证实CFH存在于眼睛的该区 域(图3)。从人视网膜切片的两个不同区域所得的荧光图象以及它们相 应的DIC图象显示在脉络膜血管和邻近RPE(似乎在玻璃膜下面)的 区域内强烈染色(图3)。这一发现与与下面的发现相一致：RPE和脉 络膜产生在玻璃疣中发现的若干补体成分的mRNA(R.F.Mullins，S.R. Russell，D.H.Anderson，G.S.Hageman，FASEB J 14，835(2000))。在 AMD中发现的具有相似组成的玻璃疣也发现于II型膜增生性肾小球肾 炎(MPGNII)(一种肾病，R.F.Mullins，N.Aptsiauri，G.S.Hageman， Eye 15，390(2001))患者的眼中；因子H缺乏可引起MPGNII(S.R.D Cordoba，J.Esparza-Gordillo，E.G.d.Jorge，M.Lopez-Trascasa，P. Sanchez-Corral，Mol Immunol 41，355(2004))。我们的免疫染色试验(图 3和4)提示AMD的发病原因，其中损失、损害和缺乏因子H导致在 脉络膜毛细血管(较严重)和脉络膜血管(较轻微)内有补体沉积，随 后血浆蛋白泄漏至玻璃膜中。最后，80mg/天的锌营养补充降低AMD 风险；生化研究表明因子H功能对于锌浓度敏感(AREDS Research Group，Arch Ophthamol 119，1417，(2001)；A.M.Blom，L.Kask，B. Ramesh，A.Hillarp，Arch Biochem Biophys 418，108(2003))。
本发明还提供用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体以及 用于诊断或辅助诊断AMD的多核苷酸。尽管已讨论了本发明的具体实 施方案，但上述说明是示例性的而非限制性的。根据本说明书，本发明 的许多变化对于本领域技术人员是显而易见的。本发明的全部范围应通 过参考权利要求书及其等同物的全部范围、和说明书以及这些改变而确 定。
本文提及的所有出版物和专利在此通过参考全部引入，如同每个 出版物和专利已具体地和各自地指出通过参考而引入。发生冲突时，以 本申请包括其中的任何定义为准。
还并入以与进入公共数据库相关的登记号为参考的任何多核苷酸 和多肽序列，比如那些由基因组研究所(TIGR)(www.tigr.org)和/或 国立生物技术信息中心(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)维护的序列。
表6.重测序使用的引物序列
区域 正向引物序列 反向引物序列 启动子 AGAATCGTGGTCTCTGTGTGTGG AGCAGCTGGTGATATCCTCTGG 启动子 TCAAATGAGAGTGAGCCAGTTGC CTGTTCACAACGTCCAGTTCTCC 外显子1 GTGGGAGTGCAGTGAGAATTGG AACTCAACAATGTCAAAAGCC 外显子2 GATAGACCTGTGACTGTCTAGGC GGCAATAGTGATATAATTCAGGC 外显子3 ACCTCAGCCTCCCAAAGTGC TGCATACTGTTTTCCCACTCTCC 外显子4 AAGGAGGAGGAGAAGGAGGAAGG CAGGCTGCATTCGTTTTTGG 外显子5 CCACTCCCATAGAAAAGAATCAGG ACTTCTTTGCACCAGTCTCTTCC 外显子6 GATAAATCATTTATTAAGCGG GAACCTTGAACACAGAAAATGC 外显子7 GGATGACTTTGGAGAAGAAGG TATGAGTTTCGGCAACTTCG 外显子8 TCATCTTCATTAACAAAGACC AGATCTATTTTGGTCACTTTGC 外显子9 CTTTGTTAGTAACTTTAGTTCG TTATACACAGTTGAAAAACC 外显子10 GGCAACTCTGAGCTTATTTTCC AGAGTAGGAAAAGCCTGAATGG 外显子11 CATAGATTATTTTTGTACGG CAAAACTCCCTTCTTTTCCC 外显子12 ATCTGATGCCCCTCTGTATGACC ATTCAGTACTCAATACATGTCC 外显子13 CACCATTCTTGATTGTTTAGG GAATCTCCATAGTAATAAGG 外显子14 CAATGTGTTGATGGAGAGTGG ATTGAATTATAAGCAATATGC 外显子15 CATTTCAGCGACAGAATACAGG GTGTGTGTGTGTGTGTGTGC 内含子15 AAGGCAGGAAAGTGTCCTTATGC GTCAAATTACTGAAAATCACC 外显子16 AACTGTTACACAGCTGAAAAG GTGGTGATTGATTAATGTGC 外显子17 GGTGGAGGAATATATCTTTGC ATAGAATAGATTCAATCATGC 外显子18 CGATAGACAGACAGACACCAGAAGG CAGCTATAATTTCCCACAGCAGTCC 外显子19 GTGTAATCTCAATTGCTACGGCTACC CAAGTAGCTGGGACTTCAGATGC 外显子20 TAGTTTCATGTCTTTTCCTC GAATTTTAAGCACCATCAGTC 外显子21 CCAGGACTCATTTCTTTCACC CTTTCTGACAGAAATATTTGG 外显子22 TGATGTTTCTACATAGTTGG GGAGTAAAACAATACATAAAAAATG
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的 一部分并入此处：
1.用于在来自个体的样本中检测变体CFH基因的分离多核苷酸， 其包含特异性检测CFH基因中与人内发生年龄相关性黄斑变性的发生 相关的变异的核酸分子。
2.项1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是探针，其在严谨条件下 与CFH基因中人内年龄相关性黄斑变性的发生相关的变异杂交。
3.项2的探针，其中所述变异在CFH蛋白第402位处编码组氨酸 以外的氨基酸。
4.项3的探针，其中所述变异在CFH蛋白第402位编码酪氨酸。
5.项2的探针，其中所述探针是DNA探针。
6.项5的探针，其中所述探针是约8个核苷酸-约500个核苷酸。
7.项5的探针，其中所述探针是约10个核苷酸-约250个核苷酸。
8.项5的探针，其中所述探针包含一个或更多个非天然或经修饰 的核苷酸。
9.项8的探针，其中所述一个或更多个非天然或经修饰的核苷酸 是放射性、荧光或化学标记的核苷酸。
10.多核苷酸引物，其在严谨条件下与CFH基因中同人内发生年 龄相关性黄斑变性的发生相关的变异邻近相杂交。
11.项10的多核苷酸引物，其在紧邻着CFH基因中与人内年龄相 关性黄斑变性的发生相关的变异相杂交。
12.特异性检测CFH基因中与人内年龄相关性黄斑变性的发生相 关的变异的一对多核苷酸引物，其中第一多核苷酸引物杂交至所述变异 的一侧，而第二多核苷酸引物杂交至所述变异的另一侧。
13.杂交至包含CFH基因中与人内年龄相关性黄斑变性的发生相 关的变异的DNA区域的一对多核苷酸引物，其中所述多核苷酸引物以 如下方式杂交至所述区域：接近所述变异的杂交引物末端距离约20-约 10,000个核苷酸。
14.项12的一对多核苷酸引物，其中所述变异在CFH蛋白第402 位处编码组氨酸以外的氨基酸。
15.项14的一对多核苷酸引物，其中所述变异在CFH蛋白第402 位处编码酪氨酸。
16.项12的一对多核苷酸引物，其中所述引物是DNA引物。
17.项16的一对多核苷酸引物，其中所述引物分别是约8个核苷 酸-约500个核苷酸。
18.项16的一对多核苷酸引物，其中所述引物分别是约10个核苷 酸-约250个核苷酸。
19.项16的一对多核苷酸引物，其中所述引物包含一个或更多个 非天然或经修饰的核苷酸。
20.项19的一对多核苷酸引物，其中所述一个或更多个非天然或 经修饰的核苷酸是放射性或荧光标记的核苷酸。
21.在从个体获得的样本中检测与人内年龄相关性黄斑变性的发生 相关的变体CFH基因的方法，其包括：
(a)将样品与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与人 内年龄相关性黄斑变性的发生相关的CFH基因变异杂交，但不与野生 型CFH基因杂交；和
(b)确定是否发生杂交；
其中发生杂交则指示样品中存在与发生年龄相关黄斑变性有关的 变体CFH基因。
22.在从个体获得的样本中检测与人发生年龄相关黄斑变性相关的 变体CFH基因的方法，其包括：
(a)将样品与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与人 发生年龄相关黄斑变性相关的CFH基因变异相杂交，从而产生组合；
(b)在严谨杂交条件下维持步骤(a)中所产生的组合；和
(c)比较所述组合中发生的杂交与对照中的杂交，其中对照是不 结合与人发生年龄相关黄斑变性相关的CFH基因变异或仅结合野生型 CFH基因的多核苷酸探针，且样品是与(a)中样品相同的类型并用(a) 中样品同样的方法处理；并且
其中所述组合中发生杂交而对照中不发生杂交则指示样品中存在 与年龄相关黄斑变性相关的变体CFH基因。
23.项22的方法，其中在步骤(c)中确定杂交程度。
24.在从个体获得的样本中检测与人发生年龄相关黄斑变性相关的 变体CFH基因的方法，其包括：
(a)将样品的第一部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨 条件下与CFH基因中与人发生年龄相关黄斑变性相关的变异相杂交；
(b)将样品的第二部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨 条件下与野生型CFH基因杂交；和
(c)确定是否发生杂交，
其中第一部分发生杂交而第二部分不发生杂交则指示样品中存在 与发生年龄相关黄斑变性相关的变体CFH基因。
25.项21的方法，其中所述变异在CFH蛋白第402位编码组氨酸 以外的氨基酸。
26.项25的方法，其中所述变异在CFH蛋白第402位编码酪氨酸。
27.项21的方法，其中所述样品包含从以下获得的细胞：眼、耳、 鼻、牙、舌、表皮、上皮、血液、泪、唾液、粘液、尿道、尿液、肌肉、 软骨、皮肤或任何其它组织或体液。
28.项21的方法，其中所述多核苷酸探针是DNA探针。
29.项21的方法，其中所述多核苷酸探针是约8个核苷酸-约500 个核苷酸。
30.在从个体获得的样本中检测与人发生年龄相关黄斑变性相关的 变体CFH基因的方法，其包括：
(a)将样品与一对多核苷酸引物相组合，其中第一多核苷酸引物 杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的一侧，第二多核苷酸引 物杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的另一侧；
(b)扩增样品中的DNA，由此产生扩增的DNA；
(c)测序所扩增的DNA；和
d)检测DNA中是否存在在CFH蛋白第402位编码组氨酸以外的 氨基酸的变异，
其中存在所述变异则指示在样品中检测到与人发生年龄相关黄斑 变性相关的变体CFH基因。
31.鉴定或辅助鉴定有发生年龄相关黄斑变性风险的个体的方法， 其包括分析从所述个体获得的样本中是否存在与人发生年龄相关黄斑 变性相关的变体CFH基因，其中存在所述变体CFH基因指示所述个体 有发生年龄相关黄斑变性的风险。
32.鉴定或辅助鉴定有发生年龄相关黄斑变性风险的个体的方法， 其包括：
(a)将从所述个体获得的样品与多核苷酸探针相组合，所述探针 在严谨条件下与人发生年龄相关黄斑变性相关的CFH基因变异杂交， 但不与野生型CFH基因杂交；和
(b)确定是否发生杂交；
其中发生杂交则指示所述个体有发生年龄相关黄斑变性的风险。
33.鉴定或辅助鉴定有发生年龄相关黄斑变性风险的个体的方法， 其包括：
(a)从个体获得DNA；
(b)对包含编码CFH蛋白第402位氨基酸的核苷酸的DNA区域 进行测序；和
(c)确定在所述DNA中是否存在在CFH蛋白第402位编码组氨 酸以外的氨基酸的变异，
其中存在所述变异则指示所述个体有发生年龄相关黄斑变性的风 险。
34.检测来自个体的样本中变体CFH基因的诊断试剂盒，其包含：
(a)其中放置多核苷酸探针的至少一个容器装置，所述探针在严 谨条件下与CFH基因中与人发生年龄相关黄斑变性相关的变异杂交； 和
(b)使用所述诊断试剂盒用于检测样品中变体CFH基因的标签和 /或指导。
35.检测来自个体的样本中变体CFH基因的诊断试剂盒，其包含：
(a)其中放置多核苷酸引物的至少一个容器装置，所述引物在严 谨条件下杂交至邻近与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFH基因变异 的一侧；和
(b)使用所述诊断试剂盒用于检测样品中CFH的标签和/或指导。
36.项35的诊断试剂盒，还包含第二多核苷酸引物，其在严谨条 件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFH基因变异的另一 侧。
37.用于治疗患年龄相关黄斑变性的对象的组合物，其包含：
(a)有效量的分离或重组制备的野生型CFH多肽或其片段；和
(b)药学可接受的载体。
38.项37的组合物，其中CFH多肽或其片段抑制C3的活化。
39.用于治疗患年龄相关黄斑变性的对象的方法，其包括向所述对 象施用有效量的项37的组合物。
40.用于治疗患年龄相关性黄斑变性的对象的组合物，其包含：
(a)有效量的分离或重组制备的编码CFH多肽或其片段的核酸分 子；和
(b)药学可接受的载体。
41.治疗患年龄相关黄斑变性的对象的方法，包括向所述患者施用 有效量的项40的组合物。
42.检测从个体获得的样品中与人发生年龄相关黄斑变性有关的变 体CFH多肽的方法，其包括：
(a)将样品与抗体相组合，所述抗体结合与人发生年龄相关黄斑 变性有关的变体CFH多肽；和
(b)确定是否发生结合，
其中发生结合则指示样品中存在与发生年龄相关黄斑变性有关的 变体CFH多肽。
43.用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其 包含：
(a)包含反义序列的核酸分子，所述反义序列与人发生年龄相关 黄斑变性有关的变体CFH基因或mRNA杂交；和
(b)药学可接受的载体。
44.项43的组合物，其中所述反义序列与变体CFH基因的杂交可 降低从变体CFH基因转录的RNA的量。
45.项43的组合物，其中所述反义序列与变体CFH mRNA的杂 交可降低从该变体CFH mRNA翻译的蛋白质的量，和/或改变该变体 CFH mRNA的剪接。
46.项43的组合物，其中所述核酸分子包括一个或更多个经修饰 的核苷酸或核苷，其可增强体内稳定性、跨细胞膜的转运或与变体CFH 基因或mRNA的杂交。
47.治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，其包括向 所述对象施用有效量的项43的组合物。
48.用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其 包含：
(a)包含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子，其可与 人内年龄相关性黄斑变性的发生有关的变体CFH基因或mRNA杂交； 和
(b)药学可接受的载体。
49.项48的组合物，其中所述siRNA或miRNA序列与变体CFH 基因的杂交可降低从所述变体CFH基因转录的RNA的量。
50.项48的组合物，其中所述siRNA或miRNA序列与变体CFH mRNA的杂交可降低从变体CFH mRNA翻译的蛋白质的量、和/或改 变变体CFH mRNA的剪接。
51.项48的组合物，其中所述核酸分子包括一个或更多个经修饰 的核苷酸或核苷，其可增强体内稳定性、跨细胞膜的转运、或与变体 CFH基因或mRNA的杂交。
52.治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，其包括向 所述对象施用有效量的项48的组合物。
53.用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其 包含：
(a)结合变体CFH多肽的适配体，所述变体CFH多肽与人发生 年龄相关黄斑变性有关；和
(b)药学可接受的载体。
其中所述适配体与变体CFH多肽的结合可降低该变体CFH多肽的活 性。
54.治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，包括向所 述对象施用有效量的项53的组合物。
55.用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其 包含：
(a)结合变体CFH多肽的小分子，所述变体CFH多肽与人发生 年龄相关黄斑变性有关；和
(b)药学可接受的载体，
其中所述小分子与变体CFH多肽的结合可降低该变体CFH多肽的活 性。
56.治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，包括向所 述对象施用有效量的项55的组合物。
57.用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其 包含：
(a)结合变体CFH多肽的抗体，所述变体CFH多肽与人发生年 龄相关黄斑变性有关；和
(b)药学可接受的载体，
其中所述抗体与变体CFH多肽的结合可降低该变体CFH多肽的活性。
58.治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，包括向所 述对象施用有效量的项57的组合物。