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1、(10)授权公告号 CN 102851215 B (45)授权公告日 2014.07.23 CN 102851215 B (21)申请号 201210301019.0 (22)申请日 2012.08.23 C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 临沂大学 地址 276000 山东省临沂市双岭路中段临沂 大学生命科学学院 (72)发明人 王培磊 不详 . 单胞藻塑料桶封闭式扩种技 术 . fb7191fb705cc17552709a1.html .2011, 全文 . 逄少军 . 海藻种质分离、 培养和应用的 技术操作规范 . topic/7。
2、607542 .2006, 全文 . 陆德祥 . 金藻、 角毛藻等藻种的固体培养基 保藏技术. 水产养殖 .2003,第24卷(第6期), 第 1.4.3 节 . (54) 发明名称 牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养 方法 (57) 摘要 本发明属海洋微藻养殖领域， 涉及一种牟氏 角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养方法。牟 氏角毛藻是一种小型海洋硅藻， 富含多不饱和脂 肪酸、 蛋白质等， 是对虾、 鲍鱼等海珍品的优质育 苗饵料。目前牟氏角毛藻生产上多采用 f/2 培养 基配方进行培养， 存在问题是营养物质不均衡， 不 全面， 生长缓慢、 倍增时间长、 产量低。我的实验 显示， 用尿素取代。
3、硝酸盐作氮源并补充 NaHCO3和 植物生长刺激素、 VB12、 VB1后， 营养更加全面、 均 衡， 牟氏角毛藻产量能提高 87。另外， 现生产中 多采用水泥池或玻璃缸桶进行培养， 有很多缺点 ： 易污染、 洗刷困难、 操作不便、 易划破。本研究表 明， 用白塑料桶充气培养角毛藻， 操作灵活， 不易 污染， 洗刷方便， 不易划破， 成本低， 产量高， 可大 规模推广。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 罗霄 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 102851215 B 。
4、CN 102851215 B 1/1 页 2 1. 一种牟氏角毛藻的培养方法， 其特征在于步骤如下 ： 配 置 牟 氏 角 毛 藻 培 养 基 配 方 如 下 ： CO(NH2)221.5mg， FeC6H5O75H2O0.5mg， Na2SiO39H2O8mg， NaHCO3500mg， 九 二 0 植 物 生 长 刺 激 素 5 国 际 单 位， VB12510-4mg， VB10.1mg， VB60.1mg， 柠檬酸铁铵 1mg， ZnSO4500mg， 体积比 1的钼酸水溶液 15ml， 硫酸锰 5mg， 磷酸二氢钾 18mg， 氯化钾 3mg， 海水 1000mL ； 所述的牟氏角毛。
5、藻培养基的制备方法， 包括如下步骤 ： 1) 因柠檬酸铁较难溶解， 加少量自来水在火炉上微热至 80-90， 并不断搅拌至全部 融化 ； 2) 九二 0 植物生长刺激素为白色结晶粉末， 不易溶解于水， 先用酒精充分溶解， 每克用 50 毫升酒精或 60 度白酒溶解 1 小时以上， 再按所需浓度兑水稀释 ； 3) 加营养盐的过程中需不断搅水， 而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入， 以免发 生化学反应 ； 4) 各种营养盐可先配成浓度较高的母液， 再依次添加 ； 5) 全部营养盐加完后再充气搅拌 15 分钟， 即可接种 ； 6) 此培养基配方对牟氏角毛藻各级培养阶段都适用 ； 所述牟氏角毛藻培养。
6、方法， 包括如下步骤 ： 采用白塑料桶充气培养方法 ； 白色塑料桶为市场售常用聚乙烯塑料桶， 圆筒形， 直 径 30cm， 高 60cm， 加满水约 6.5104ml， 消毒海水洗净， 再用蒸馏水润洗 3 遍， 桶口处用 酒精擦洗消毒备用 ； 白色塑料桶置于室外水泥地上， 顶部有透明玻璃钢瓦遮阴， 四周开放 式， 将白桶放置于离地 0.5m 的水泥板上， 自然光照射， 最佳温度 25-30， 最佳光照强度 10000-15000lx， 或人工光源光照， 60100瓦电灯或日光灯， 需15003000勒克斯厘米 2 ； 培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒 ； 漂白液氧化法消毒方法是1m3。
7、海水中加 入漂白液 200 300mL， 使海水中有效氯含量达到 10 20mg/L， 充气 8 12h 后， 用硫代硫 酸钠中和余氯 ； 硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定， 直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止 ； 按照上述的牟氏角毛藻培养基配方添加培养基， 藻种要选择生长良好、 生活力旺盛、 色 泽鲜艳、 无沉淀及无明显附壁现象的藻种， 镜检无其它杂藻、 原生动物等 ； 充气培养， 接种密 度为 30104cell mL， 充入空气和二氧化碳混合气体， 体积比比例为 V空气： V二氧化碳=15 ： 1， 充气量不宜太大， 以藻细胞浮起不下沉即可 ； 夜间停止充气， 白天行间隔充气， 即充气 1 小。
8、 时， 停 1 小时， 重复进行 ； 用透明薄膜盖于桶上部， 然后用橡皮筋拉紧， 进行封闭式培养 ； 经 过 5-7 天的培养， 密度达 300104-400104cell/mL 即可采收或转入下一级培养 ； 在充气培养时充入空气和二氧化碳、 臭氧混合气体， 体积比比例为 V空气： V二氧化碳： V臭氧 =15:1:1。 权 利 要 求 书 CN 102851215 B 2 1/4 页 3 牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养方法 技术领域 0001 本发明属于海洋微藻养殖领域， 尤其涉及一种牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶 充气培养方法。 背景技术 0002 牟氏角毛藻 (Chaetocer。
9、os muelleri) 隶属硅藻门， 中心纲， 盒形藻目， 角毛藻科， 角毛藻属， 是一种小型海洋浮游硅藻， 细胞小， 壁薄， 多数单个生活， 在 10 39环境温度 下均能生长繁殖， 最适温度 25 30， 是一种沿岸性半咸水种类。与其它常用单胞藻如 球等鞭金藻 (Isochrysis galbana Parke)、 湛江叉鞭金藻 (Dicrszhan jiangensis) 和扁 藻 (Platymonas) 相比， 牟氏角毛藻藻含有大量脂肪酸、 蛋白质等营养物质， 繁殖快且耐高 温。多不饱和脂肪酸含量高， 在良好培养条件下， 其二十碳五烯酸 (EPA) 占总脂肪酸含量 10.2， 是对。
10、虾、 海参、 文蛤、 牡蛎、 鲍鱼、 魁钳、 海胆等海珍品优质育苗饵料， 在医药、 保健品 行业也有重要应用价值。 0003 海水中无机碳的存在形式以 HCO3-为主 (90 )， 而游离的 CO2不足 1。过去人们 一直认为， 水体中游离 CO2是藻类利用外源无机碳的唯一形式。张学成的工作表明， 螺旋藻 培养基中添加 50 100mmol/L NaHCO3时， 不仅可以满足螺旋藻生长的需要， 而且有助于保 持藻体生长的 pH 值。林惠民认为， NaHCO3在培养基中的作用之一是作为碳源。我的研究 结果表明， 牟氏角毛藻可以利用 HCO3-作为碳源。另外， 氮磷营养盐对牟氏角毛藻的生长影 响极。
11、显著， 氮的影响高于磷。传统上人们习惯利用硝酸钠或硝酸钾作为培养牟氏角毛藻氮 源， 但我的实验显示， 用尿素作氮源牟氏角毛藻生长更快， 产量更高。尿素对不同微藻生长 影响机理较无机氮复杂。 已经证实许多藻含有尿素酶， 在酶的催化下， 尿素分解出氨被微藻 利用。可能是酶功能的差异造成了各种微藻利用氮或磷的能力差异。 0004 目前牟氏角毛藻生产上多采用 f/2 培养基配方进行培养。牟氏角毛藻规模化培 养存在的主要问题是营养物质不均衡， 不全面， 藻细胞生长缓慢、 倍增时间长、 细胞密度低 ( 室外培养密度最高仅为 2106cell/mL 酶， 产量低。合适的培养基是实现牟氏角毛藻高 密度培养的重。
12、要因素之一。以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠和维生素及微量元素， 但大量实验表明， 牟氏角毛藻除了能利用空气中游离的 CO2， 还能有效地利用培养液中的 HCO3-作为碳源。添加 NaHCO3不仅缩短了牟氏角毛藻的倍增时间， 而且延长了藻的生长时 间。我的实验表明， 添加 500mg 的 NaHCO3和 5 国际单位九二 0 植物生长刺激素 ( 即赤霉 素 )， 510-4mg VB12， 0.1mg VB1后， 营养更加全面、 均衡， 能大大提高生长速度， 牟氏角毛藻 产量能提高 87。 0005 贝类人工苗种技术的不断改进和工厂化种苗技术的提高， 要求技术人员在生产中 能够稳定提供大量单胞。
13、藻作为饵料， 为解决这个问题， 国内外藻类培养工作者做了很多研 究， 有封闭立柱式、 薄膜袋式、 开放水泥池式等多种培养方法。生产上现在一般采用玻瓶一 级保种， 小池或小型薄膜袋或玻璃缸桶二级扩种和大池三级培养， 存在很多缺点 ： 易污染、 成本高、 洗刷困难、 操作不便、 容易划破等。我用聚乙烯白色塑料桶并充入空气和 CO2混合 说 明 书 CN 102851215 B 3 2/4 页 4 气体进行牟氏角毛藻二级扩种， 并取得了理想效果。CO2来源广泛， 利用 CO2促进微藻细胞 的生长， 具有良好的经济价值。 我的研究证明， 将CO2和空气形成的混合气体(VCO2V空气 1 15) 充入藻。
14、液， 可明显促进牟氏角毛藻的生长， 生产量大大高于不充气和只充入纯空气 或纯CO2的平行对照。 CO2对微藻的光合作用及固碳效率的影响机理， 已有广泛的研究。 用白 塑料桶充气培养方法进行牟氏角毛藻二级扩种， 大小合适， 易于搬动， 操作灵活， 不易污染， 不忌直射光， 可封闭式充气， 洗刷方便， 可以重复使用， 不易损坏， 不易划破， 透光性好， 成本 低廉， 生长快， 产量高。 发明内容 0006 为了克服目前技术的不足， 本发明提供了一种牟氏角毛藻培养基配方及白塑料 桶充气培养方法， 具体技术方案如下 ： 一种牟氏角毛藻培养基， 配方如下 ： CO(NH2)2( 即尿 素 )21.5mg。
15、， KH2PO48mg， FeC6H5O75H2O( 即柠檬酸铁 )0.5mg， Na2SiO39H2O 8mg， NaHCO3 500mg， 九二 0 植物生长刺激素 ( 即赤霉素 )5 国际单位， VB12510-4mg， VB1 0.1mg， 海水 1000mL。 0007 一种牟氏角毛藻培养基， 其特征在于该牟氏角毛藻培养基配方如下 ： 0008 CO(NH2)2( 尿素 )21.5mg， KH2PO48mg， FeC6H5O75H2O( 柠檬酸铁 )0.5mg， Na2SiO39H2O8mg， NaHCO3 500mg， 九 二 0 植 物 生 长 刺 激 素 ( 即 赤 霉 素 )。
16、5 国 际 单 位， VB12510-4mg， VB10.1mg， VB6 0.1mg， 柠檬酸铁铵 1mg， ZnSO4500mg， 体积比 1的钼酸水溶液 15ml， 硫酸锰 5mg， 磷酸二氢钾 10mg， 氯化钾 3mg， 海水 1000mL。 0009 一种牟氏角毛藻培养方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 0010 采用白塑料桶充气培养方法 ； 白色塑料桶为市场售常用聚乙烯塑料桶， 圆筒形， 直径 30cm， 高 60cm， 加满水约 6.5104ml， 消毒海水洗净， 再用蒸馏水润洗 3 遍， 桶口处用 酒精擦洗消毒备用 ； 白色塑料桶置于室外水泥地上， 顶部有透明玻璃钢瓦遮阴， 。
17、四周开放 式， 将白桶放置于离地 0.5m 的水泥板上， 自然光照射， 最佳温度 25-30， 最佳光照强度 10000-15000lx， 或人工光源光照， 60100瓦电灯或日光灯， 需15003000勒克斯/厘米 2 ； 培养用海水采用漂白液 ( 次氯酸钠 ) 氧化法消毒 ； 漂白液氧化法消毒方法是 1m3海水中 加入漂白液 200 300mL， 使海水中有效氯含量达到 10 20mg/L， 充气 8 12h 后， 用硫代 硫酸钠中和余氯 ； 硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定， 直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。 0011 按照所述的牟氏角毛藻培养基配方添加培养基， 藻种要选择生长良好、 生活。
18、力旺 盛、 色泽鲜艳、 无沉淀及无明显附壁现象的藻种， 镜检无其它杂藻、 原生动物等 ； 充气培养， 接种密度为 30104cell/mL， 充入空气和二氧化碳混合气体， 体积比比例为 V空气 V二氧化碳 15 1， 充气量不宜太大， 以藻细胞浮起不下沉即可 ； 夜间停止充气， 白天行间隔充气， 即 充气 1 小时， 停 1 小时， 重复进行 ； 用透明薄膜盖于桶上部， 然后用橡皮筋拉紧， 进行封闭式 培养 ； 经过 5-7 天的培养， 密度达 300104-400104cell/mL 即可采收或转入下一级培养。 0012 优选地， 充气培养时充入空气和二氧化碳、 臭氧混合气体， 体积比比例为。
19、V空气V二 氧化碳臭氧 15 1 1。 0013 有益效果 ： 0014 我的实验表明， 用尿素代替硝酸钠或硝酸钾作为培养牟氏角毛藻的氮源， 并补充 500mg 的 NaHCO3和 5 国际单位九二 0 植物生长刺激素 ( 即赤霉素 )， 510-4mg VB12， 0.1mg 说 明 书 CN 102851215 B 4 3/4 页 5 VB1后， 营养更加全面、 均衡， 缩短了牟氏角毛藻的倍增时间， 延长了藻的生长时间， 能大大 提高生长速度， 牟氏角毛藻产量能提高 87。用白桶并充入 CO2混合气体方法进行牟氏角 毛藻二级扩种， 大小合适， 易于搬动， 操作灵活， 不易污染， 不忌直射光。
20、， 可封闭式充气， 洗刷 方便， 可以重复使用， 不易损坏， 不易划破， 透光性好， 成本低廉， 生长快， 产量高。 具体实施方式 0015 培养基配制方法 0016 1) 柠檬酸铁较难溶解， 可加少量自来水在火炉上微热至 80-90， 并不断搅拌至 全部融化 ； 0017 2)九二0植物生长刺激素(即赤霉素)为白色结晶粉末， 不易溶解于水， 可先用酒 精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)， 再按所需浓度兑水稀 释。 0018 3) 加营养盐的过程中需不断搅水， 而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入， 以 免发生化学反应 ； 0019 4) 各种营养盐可先配成浓度较高。
21、的母液， 再依次添加。 0020 5) 全部营养盐加完后再充气搅拌 15 分钟， 即可接种。 0021 6) 此培养基配方对牟氏角毛藻各级培养阶段都适用。 0022 一 种 牟 氏 角 毛 藻 培 养 基， 配 方 如 下 ： CO(NH2)2( 即 尿 素 )21.5mg， KH2PO48mg， FeC6H5O75H2O( 即柠檬酸铁 )0.5mg， Na2SiO39H2O 8mg， NaHCO3 500mg， 九二 0 植物生长刺 激素 ( 即赤霉素 )5 国际单位， VB12510-4mg， VB1 0.1mg， 海水 1000mL。 0023 一种牟氏角毛藻培养基， 其特征在于该牟氏角。
22、毛藻培养基配方如下 ： 0024 CO(NH2)2( 尿 素 )21.5mg， KH2PO4 8mg， FeC6H5O75H2O( 柠 檬 酸 铁 )0.5mg， Na2SiO39H2O8mg， NaHCO3 500mg， 九二 0 植物生长刺激素 ( 即赤霉素 )5 国际单位， VB12 510-4mg， VB10.1mg， VB6 0.1mg， 柠檬酸铁铵 1mg， ZnSO4500mg， 体积比 1的钼酸水溶液 15ml， 硫酸锰 5mg， 磷酸二氢钾 10mg， 氯化钾 3mg， 海水 1000mL。 0025 一种牟氏角毛藻培养方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 0026 采用白塑料。
23、桶充气培养方法 ； 白色塑料桶为市场售常用聚乙烯塑料桶， 圆筒形， 直径 30cm， 高 60cm， 加满水约 6.5104ml， 消毒海水洗净， 再用蒸馏水润洗 3 遍， 桶口处用 酒精擦洗消毒备用 ； 白色塑料桶置于室外水泥地上， 顶部有透明玻璃钢瓦遮阴， 四周开放 式， 将白桶放置于离地 0.5m 的水泥板上， 自然光照射， 最佳温度 25-30， 最佳光照强度 10000-15000lx， 或人工光源光照， 60100瓦电灯或日光灯， 需15003000勒克斯/厘米 2 ； 培养用海水采用漂白液 ( 次氯酸钠 ) 氧化法消毒 ； 漂白液氧化法消毒方法是 1m3海水中 加入漂白液 200。
24、 300mL， 使海水中有效氯含量达到 10 20mg/L， 充气 8 12h 后， 用硫代 硫酸钠中和余氯 ； 硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定， 直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。 0027 按照所述的牟氏角毛藻培养基配方添加培养基， 藻种要选择生长良好、 生活力旺 盛、 色泽鲜艳、 无沉淀及无明显附壁现象的藻种， 镜检无其它杂藻、 原生动物等 ； 充气培养， 接种密度为 30104cell/mL， 充入空气和二氧化碳混合气体， 体积比比例为 V空气 V二氧化碳 15 1， 充气量不宜太大， 以藻细胞浮起不下沉即可 ； 夜间停止充气， 白天行间隔充气， 即 充气 1 小时， 停 1 小时， 重。
25、复进行 ； 用透明薄膜盖于桶上部， 然后用橡皮筋拉紧， 进行封闭式 说 明 书 CN 102851215 B 5 4/4 页 6 培养 ； 经过 5-7 天的培养， 密度达 300104-400104cell/mL 即可采收或转入下一级培养。 0028 优选地， 充气培养时充入空气和二氧化碳、 臭氧混合气体， 体积比比例为V空气V二 氧化碳臭氧 15 1 1。 0029 最后应说明的是 ： 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制 ； 尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解 ： 其依然 可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换 ； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范 围。 说 明 书 CN 102851215 B 6 。