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1、(10)申请公布号 CN 102757936 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757936 A *CN102757936A* (21)申请号 201210197417.2 (22)申请日 2012.06.15 C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 江苏瑞思坦生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市吴中区越溪镇创 高路 168 号 (72)发明人 焦阳 (74)专利代理机构 北京商专永信知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11400 代理人 高之波 邬玥 (54) 发明名称 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 (57) 摘要 本申请公开。
2、了一种人脂肪干细胞增殖促进剂 及其应用方法。所述的人脂肪干细胞增殖促进剂 由胰岛素、 氢化可的松、 甲状旁腺激素、 雌二醇、 睾 酮、 血小板衍生生长因子 -AB、 表皮生长因子、 碱 性成纤维细胞生长因子、 L- 谷氨酰胺、 2- 巯基乙 醇、 白血病抑制因子、 L- 抗坏血酸、 生物素、 地塞 米松、 IGF-I 和 SCF 组成。本发明应用于脂肪干细 胞的增殖传代培养， 不但能特异性促进脂肪干细 胞生长速度和扩增数量程几何级数增长， 又能抑 制其过早分化成熟， 避免干细胞在培养中凋亡或 早衰， 保持脂肪干细胞旺盛活跃的分化潜能。 在脂 肪干细胞培养领域有着良好的应用前景。 (51)Int。
3、.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种人脂肪干细胞增殖促进剂， 其特征在于 : 由胰岛素、 氢化可的松、 甲状旁腺 激素、 雌二醇、 睾酮、 血小板衍生生长因子 -AB、 表皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子、 L- 谷氨酰胺、 2- 巯基乙醇、 白血病抑制因子、 L- 抗坏血酸、 生物素、 地塞米松、 胰岛素样生长 因子 IGF-I 和人干细胞因子 SCF 组成。 2. 如权利要求 1 所述的人脂肪干细胞增殖促进剂， 其特征在于 ： 。
4、各成分的比例为使 得在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰 岛素浓度为 0.110g/mL、 氢化可的松浓度为 10-10510-9mol/L、 甲状旁腺激素浓度 为 210-10710-10mol/L、 雌二醇浓度 0.23.5ng/mL、 睾酮浓度为 0.815ng/mL、 血小板 衍生生长因子 -AB 浓度为 18ng/mL、 表皮生长因子浓度为 216ng/mL、 碱性成纤维细胞 生长因子浓度为 220ng/mL、 L- 谷氨酰胺优选浓度为 0.44mmol/L、 2- 巯基乙醇浓度为 0.070.15mmol/L、 白血病抑制因子浓度为 17ng/m。
5、L、 L- 抗坏血酸浓度为 1080g/mL、 生 物素浓度为 1045g/mL、 地塞米松浓度为 10-8510-8mol/L、 IGF-I 浓度为 110ng/mL 和 SCF 浓度为 0.815ng/mL。 3. 如权利要求 1 所述的人脂肪干细胞增殖促进剂， 其特征在于 ： 各成分的比例为使得 在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素 浓度为 6.25g/mL， 氢化可的松浓度为 110-9mol/L， 甲状旁腺激素浓度为 510-10mol/L， 雌二醇浓度为 1ng/mL， 睾酮浓度为 4ng/mL， 血小板衍生生长因子 -AB 浓度为 4ng/。
6、mL， 表皮 生长因子浓度为 10ng/mL， 碱性成纤维细胞生长因子浓度为 10ng/mL， L- 谷氨酰胺浓度为 2mmol/L， 2- 巯基乙醇浓度为 0.1mmol/L， 白血病抑制因子浓度为 5ng/mL， L- 抗坏血酸浓度 为50g/mL， 生物素浓度为33g/mL， 地塞米松浓度为10-8mol/L， IGF-I浓度为5ng/mL， SCF 浓度为 5ng/mL。 4. 权利要求 1-3 中任一项所述的人脂肪干细胞增殖促进剂的应用方法， 其特征在于 ： 将人脂肪干细胞增殖促进剂各成分分别加入人脂肪干细胞的培养基中。 5. 根据权利要求 4 所述的一种人脂肪干细胞增殖促进剂的应用。
7、方法， 其特征在于加入 人脂肪干细胞的培养基中使其培养的人脂肪干细胞迅速增殖。 6. 根据权利要求 4 所述的一种人脂肪干细胞增殖促进剂的应用方法， 其特征在于 ： 人 脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为 0.110g/mL、 氢化可的 松浓度为 10-10510-9mol/L、 甲状旁腺激素浓度为 210-10710-10mol/L、 雌二醇浓度 0.23.5ng/mL、 睾酮浓度为 0.815ng/mL、 血小板衍生生长因子 -AB 浓度为 18ng/mL、 表 皮生长因子浓度为 216ng/mL、 碱性成纤维细胞生长因子浓度为 220ng/mL、 L- 谷氨酰胺 优选。
8、浓度为 0.44mmol/L、 2- 巯基乙醇浓度为 0.070.15mmol/L、 白血病抑制因子浓度为 17ng/mL、 L- 抗坏血酸浓度为 1080g/mL、 生物素浓度为 1045g/mL、 地塞米松浓度为 10-85x10-8mol/L、 IGF-I 浓度为 110ng/mL 和 SCF 浓度为 0.815ng/mL。 7. 根据权利要求 4 所述的一种人脂肪干细胞增殖促进剂的应用方法， 其特征在于 ： 胰 岛素最优浓度为 6.25g/mL， 氢化可的松最优浓度为 110-9mol/L， 甲状旁腺激素最优浓 度为 510-10mol/L， 雌二醇最优浓度为 1ng/mL， 睾酮最优。
9、浓度为 4ng/mL， 血小板衍生生长 因子-AB最优浓度为4ng/mL， 表皮生长因子最优浓度为10ng/mL， 碱性成纤维细胞生长因子 最优浓度为 10ng/mL， L- 谷氨酰胺最优浓度为 2mmol/L， 2- 巯基乙醇最优浓度为 0.1mmol/ L， 白血病抑制因子最优浓度为 5ng/mL， L- 抗坏血酸最优浓度为 50g/mL， 生物素最优浓度 权 利 要 求 书 CN 102757936 A 2 2/2 页 3 为 33g/mL， 地塞米松最优浓度为 10-8mol/L， IGF-I 最优浓度为 5ng/mL， SCF 组成最优浓度 为 5ng/mL。 8. 根据权利要求 4。
10、 所述的一种人脂肪干细胞增殖促进剂的应用方法， 其特征在于 ： 所 述的人脂肪干细胞的培养基为 DMEM/F12 细胞培养基。 权 利 要 求 书 CN 102757936 A 3 1/7 页 4 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术及细胞工程领域， 特别涉及一种人脂肪干细胞增殖促进剂。 背景技术 0002 人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞 （adipose-derived stem cells,ADSCs） 是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞， 与骨髓间充质干细胞一样 具有多向分化潜能。ADSCs 呈成纤维细胞样生长， 胞浆和核仁丰。
11、富， 呈平行或漩涡样排列。 细胞周期分析显示 G0/G1 期的细胞占 69%， S 期占 24%， G2/M 期占 8%。在胎牛血清的存在条 件下传代培养 2-3 天细胞增殖 1 倍。多次传代 (10-20 代 ) 后 , 细胞增殖速度无明显减慢， 在传代 6 次后细胞群体中出现衰老细胞， 第 15 代细胞群体中衰老细胞约占 15%3。ADSCs 具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型， 经流式细胞仪分析 CD9,CD10,CD13,CD 29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1 均 为 。
12、阳 性 , 而 CD31,CD34,CD45 均为阴性。最大的区别是 ADSCs 表达 CD49d, 不表达 CD106; 而正 好相反 ,BMSCs 表达 CD106, 不表达 CD49d。 0003 目前常用的 ADSCs 分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞， 经机械和酶处理方 法除去红细胞等成熟细胞后， 利用饲养层细胞与采用含 10% 胎牛血清的培养基进行培养。 这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂， 提取的干细胞数量少， 纯度不高， 继代增殖缓慢。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂， 用于提高继代增殖效率。 0005 常用的培养干细胞方法的缺点是方法复杂。
13、， 提取的干细胞数量少， 纯度不高， 继代 增殖缓慢。 0006 根据本发明的一个方面， 提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂， 其特征在于 : 由胰 岛素、 氢化可的松、 甲状旁腺激素、 雌二醇、 睾酮、 血小板衍生生长因子 -AB、 表皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子、 L- 谷氨酰胺、 2- 巯基乙醇、 白血病抑制因子、 L- 抗坏血酸、 生物 素、 地塞米松、 胰岛素样生长因子 IGF-I 和人干细胞因子 SCF 组成。在加入人脂肪干细胞 培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为 0.110g/mL、 氢化可的松浓度为 10-10510-9mol/L、 甲状旁腺激。
14、素浓度为 210-10710-10mol/L、 雌二 醇浓度 0.23.5ng/mL、 睾酮浓度为 0.815ng/mL、 血小板衍生生长因子 -AB 浓度为 18ng/ mL、 表皮生长因子浓度为 216ng/mL、 碱性成纤维细胞生长因子浓度为 220ng/mL、 L- 谷氨 酰胺优选浓度为 0.44mmol/L、 2- 巯基乙醇浓度为 0.070.15mmol/L、 白血病抑制因子浓度 为 17ng/mL、 L- 抗坏血酸浓度为 1080g/mL、 生物素浓度为 1045g/mL、 地塞米松浓度 为 10-8510-8mol/L、 IGF-I 浓度为 110ng/mL 和 SCF 浓度为。
15、 0.815ng/mL。其中胰岛素最 优选浓度为 6.25g/mL， 氢化可的松最优选浓度为 110-9mol/L， 甲状旁腺激素最优选浓 度为 510-10mol/L， 雌二醇最优选浓度为 1ng/mL， 睾酮最优选浓度为 4ng/mL， 血小板衍生 生长因子-AB最优选浓度为4ng/mL， 表皮生长因子最优选浓度为10ng/mL， 碱性成纤维细胞 说 明 书 CN 102757936 A 4 2/7 页 5 生长因子最优选浓度为10ng/mL， L-谷氨酰胺最优选浓度为2mmol/L， 2-巯基乙醇最优选浓 度为 0.1mmol/L， 白血病抑制因子最优选浓度为 5ng/mL， L- 抗坏。
16、血酸最优选浓度为 50g/ mL， 生物素最优选浓度为 33g/mL， 地塞米松最优选浓度为 10-8mol/L， IGF-I 最优选浓度为 5ng/mL， SCF 组成最优选浓度为 5ng/mL。 0007 本发明提供对维持细胞指数生长的激素和各种生长因子作用如下 ： 0008 insulin 胰岛素 ： 能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸 0009 hydrocortisone 氢化可的松 ： 刺激干细胞的生长， 保证细胞功能 0010 parathyroid hormone 甲状旁腺激素 ： 刺激干细胞的生长 0011 estradiol 雌二醇 ： 刺激干细胞的生长， 保证细胞功能 0012。
17、 testosterone 睾酮 ： 刺激干细胞的生长， 保证细胞功能 0013 PDGF-AB 血小板衍生生长因子 -AB ： 促细胞分裂剂， 可刺激成纤维细胞和其他多种 细胞分裂增殖。 0014 EGF 表皮生长因子 ： 对多种组织细胞有强烈的促分裂作用 0015 bFGF 碱性成纤维细胞生长因子 ： 能刺激细胞增殖、 迁移， 诱导纤溶酶原激活物及 胶原酶活性， 是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。 0016 L-Glutamine L- 谷氨酰胺 ： 增加细胞的体积， 促进细胞增长 0017 2-Mercaptoethanol 2- 巯基乙醇 ： 可以保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧 化。
18、， 促进细胞的贴壁和增殖。 0018 LIF 白血病抑制因子 ： 具有抑制干细胞分化等功能， 用于维持培养中的干细胞处 于未分化状态。 0019 L-ascorbic acid L- 抗坏血酸 ： 抗氧化剂皆能促进干细胞的生长 , 增加成活率。 0020 biotin 生物素 ： 生物素又被称作维生素 H， 属于水溶性 B 族维生素家族， 参与帮助 脂肪细胞内物质正常的合成与代谢。促进干细胞生长。 0021 Dexamethasone 地塞米松 ： 属于肾上腺皮质激素类药物， 在细胞培养过程中起到 生长因子的作用， 促进细胞的增殖分化。 0022 IGF-I 胰岛素样生长因子 ： 是一类多功能。
19、细胞增殖调控因子。在细胞的分化、 增 殖、 个体的生长发育中具有重要的促进作用。 0023 SCF 人干细胞因子 ： 是一种广泛表达的型跨膜糖蛋白， 可促进干细胞成活、 加速 增殖。 0024 根据本发明的一个方面， 提供的一种人脂肪干细胞增殖促进剂， 包含对维持细胞 指数生长的激素和各种生长因子， 用于脂肪干细胞的增殖传代培养， 不但能特异性促进脂 肪干细胞生长速度和扩增数量呈几何级数增长， 又要抑制其过早分化成熟， 避免干细胞在 培养中凋亡或早衰， 保持脂肪干细胞旺盛活跃的分化的潜能， 促进提取出的干细胞成活。 附图说明 0025 图 1 是本发明中添加人脂肪干细胞增殖促进剂的基础培养基与。
20、未添加人脂肪干 细胞增殖促进剂的基础培养基培养人脂肪干细胞生长曲线图 ； 0026 图 2 是本发明中使用普通基础培养基组培养人脂肪干细胞培养 6 天时细胞的形 态 ; 说 明 书 CN 102757936 A 5 3/7 页 6 0027 图3是本发明中使用人脂肪干细胞增殖促进剂培养人脂肪干细胞培养6天时细胞 的形态 ； 0028 图 4 是本发明中使用人脂肪干细胞增殖促进剂培养人脂肪干细胞人脂肪干细胞 端粒酶活性检测结果。 具体实施方式 0029 下述实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 实验所用器具仪器试剂 皆可通过商业途径获得。 0030 实施例 1 ： 普通人脂肪干细。
21、胞基础培养基配制 : 0031 取 900mL 的 DMEM/F12 细胞培养液 （从 TAKARA BIO INC. 购得） 加抗生素 ： 青霉素 90000U， 链霉素 90000U。 0032 调 pH 值 ： 用质量分数 5 NaHCO3调节 pH 到 7.2。 0033 过滤除菌 ： 采用孔径 0.45m 和 0.22m 滤膜各一张， 上层为 0.45m， 下层为 0.22um， 以保证过滤效果。 0034 加小牛血清 ： 临用前将加入小牛血清定容至 1000mL（从 TAKARA BIO INC. 购得） 。 0035 实施例 2 ： 制备一种含人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基 。
22、A 0036 预定量为1000mL则取900mL的DMEM/F12细胞培养液 （TAKARA BIO INC.） ， 加抗生 素 ： 青霉素 90000U， 链霉素 90000U。 0037 调 pH 值 ： 用质量分数 5 NaHCO3调节 pH 到 7.2。 0038 加入增殖促进剂 ： 按下表 1 所示成分与量称量并依次加入到上述配制好的 DMEM/ F12 细胞培养液中， 振荡或超声助溶， 不加热助溶。 0039 表 1 说 明 书 CN 102757936 A 6 4/7 页 7 0040 0041 则上表所示各成分在增殖培养基 A 中浓度依次为胰岛素 0.1g/mL、 氢化可的松 。
23、10-10mol/L、 甲状旁腺激素 210-10mol/L、 雌二醇 0.2ng/mL、 睾酮 0.8ng/mL、 血小板衍生生 长因子 -AB 1ng/mL、 表皮生长因子 2ng/mL、 碱性成纤维细胞生长因子 2ng/mL、 L- 谷氨酰胺 0.4mmol/L、 2- 巯基乙醇 0.07mmol/L、 白血病抑制因子 1ng/mL、 L- 抗坏血酸 10g/mL、 生物 素 10g/mL、 地塞米松 10-8mol/L、 IGF-I 1ng/mL 和 SCF 0.8ng/mL 0042 过滤除菌 ： 采用孔径 0.45um 和 0.22um 滤膜各一张， 上层为 0.45um， 下层为。
24、 0.22um， 以保证过滤效果。 0043 加小牛血清 ： 临用前将加入小牛血清定容至 1000mL（从 TAKARA BIO INC. 购得） 。 0044 实施例 3 ： 制备一种含人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基 B 0045 制备方法及预定量如实施例 2， 但称量时将表 1 中各成分按能使其在增殖培养基 B 中浓度依次为胰岛素 10g/mL、 氢化可的松 510-9mol/L、 甲状旁腺激素 710-10mol/ L、 雌二醇 3.5ng/mL、 睾酮 15ng/mL、 血小板衍生生长因子 -AB8ng/mL、 表皮生长因子 16ng/ mL、 碱性成纤维细胞生长因子 20ng/m。
25、L、 L- 谷氨酰胺 4mmol/L、 2- 巯基乙醇 0.15mmol/L、 白 血病抑制因子 7ng/mL、 L- 抗坏血酸 80g/mL、 生物素 45g/mL、 地塞米松 510-8mol/L、 IGF-I10ng/mL 和 SCF 15ng/mL 的量称量。 0046 实施例 4 ： 制备人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基 C 说 明 书 CN 102757936 A 7 5/7 页 8 0047 制备方法及预定量如实施例2， 但称量时将表1中各成分按能使其在增殖培养基C 中浓度依次为胰岛素 6.25g/mL， 氢化可的松 110-9mol/L， 甲状旁腺激素 510-10mol/L。
26、， 雌二醇 1ng/mL， 睾酮 4ng/mL， 血小板衍生生长因子 -AB 4ng/mL， 表皮生长因子 10ng/mL， 碱 性成纤维细胞生长因子10ng/mL， L-谷氨酰胺2mmol/L， 2-巯基乙醇0.1mmol/L， 白血病抑制 因子 5ng/mL， L- 抗坏血酸 50g/mL， 生物素 33g/mL， 地塞米松 10-8mol/L， IGF-I5ng/mL， SCF 5ng/mL 的量称量。 0048 实施例 5 ： 利用本发明的增殖剂培养细胞和测试 0049 使用上述 4 种培养基培养人脂肪干细胞 0050 1. 将 1106个的脂肪干细胞分别接种到四组盛有不同的培养基的直。
27、径 100mm 培 养皿中并混匀， 每组 10 个培养皿， 置于倒置显微镜下观察 ； 0051 2. 加入培养基 ： 0052 对照组 10 个培养皿， 加入实施例 1 中普通培养基 5mL ； 0053 第 A 组 10 个培养皿， 加入增殖培养基 A5mL ； 0054 第 B 组 10 个培养皿， 加入增殖培养基 B5mL ； 0055 第 C 组 10 个培养皿， 加入增殖培养基 C5mL。 0056 3.将细胞放在在37， 5CO2的培养箱中进行培养 ； 倒置式显微镜观察， 每隔3天 用移液管吸去上层培养基， 加入新的培养基， 继续培养。 0057 4. 细胞计数 ： 每天在各组中取。
28、一个培养皿放入洁净工作台， 然后用移液管吸弃培 养基。PBS 缓冲液洗涤 2 次， 加入 1mL 胰蛋白酶复合体 Trypsin-EDTA， 倒置显微镜下发现贴 壁细胞分离后， 加入 4mL 含有 10% 牛血清 FBS 的基础培养基终止胰酶作用。 0058 使用台盼蓝 （Typan Blue） 染色血细胞计数板计数活细胞数。 0059 5.实验结果如图1所示， 使用增殖培养基C能十分有效地加速脂肪干细胞的繁殖。 使用普通基础培养基和增殖培养基 A 的细胞生长曲线近似倒 “S” 形， 在接种的前 3d 细胞处 于滞留期， 而后进入对数生长期， 约在第 6 天达最高峰。之后细胞增长减速进入平台区。
29、， 到 第 9 天凋亡的细胞增多， 细胞满盘率达到 90% 以上， 但使用增殖培养基 A 仍优于普通基础培 养基。使用高剂量 （B 组） 和最优选剂量 （C 组） 细胞增殖剂的人脂肪干细胞能很快从成活并 加速增殖， 表现在滞留期很短， 只不到两天的时间就开始迅速分裂增殖， 比普通培养基组细 胞提前进入对数增长期， 增长数目约是普通培养基组的 5-6 倍。到第 5 天起高剂量组与最 优选剂量组的细胞增长率发生区别， 最优选剂量组的细胞持续增长到第 7 天达到高峰值， 细胞数量达到 7x107， 此后进入平台区， 9 天始见少数凋亡细胞。而高剂量组的细胞最多只 长到5x107， 此后凋亡细胞不断增。
30、加， 细胞数量渐减， 到第8天以后该组细胞数量与低剂量组 和普通基础培养基没有有意义的差别。 所以高剂量增殖剂并不能得到最佳的人脂肪干细胞 增殖的效果， C 组剂量促进干细胞繁殖增长并且在体外培养 10 天未出现大量凋亡。 0060 细胞增殖剂培养人脂肪干细胞安全性测试 0061 1 细胞形态 ： 0062 初分离的细胞接种 4h 后开始贴壁， 无论哪一组细胞在停滞期的细胞形态都呈小 圆形， 细胞核居中， 可出现双核或多核。进入增长期后细胞出现伸展生长， 细胞增长明显 加快， 呈纺锤形、 多角形等改变， 接着进入高峰期时可见贴壁细胞出现梭形及纤维细胞状形 态。 四组细胞在形态上完全相同只不过在。
31、某一时间点上， 表现出细胞数量明显差异 （图2、 图 说 明 书 CN 102757936 A 8 6/7 页 9 3） ， 仍然凸显出使用 C 剂量细胞增殖剂的脂肪干细胞细胞生长密集而活跃。 0063 2 表面抗原分析 ： 0064 取培养的脂肪原代培养的干细胞， 去掉培养液， 用体积比 1 1 的 2.5% 的胰蛋白 酶溶液和0.02%EDTA溶液混合消化， 用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤后制成每100ul 含有 1106个细胞的单细胞悬液， 等分为 7 份， 分别加入 7 个 Eppendorf 管中， 一号管加入 共 20L 的 FITC Mouse IgG1、 APC-C。
32、Y7Mouse IgG2b 和染色缓冲液用于检测由于抗体非特 异性结合产生的背景作为对照， 其他试管分别加入 CD29、 CD34、 CD44、 CD45、 CD105、 HLA.DR 单克隆抗体各 20L， 每管分别加入细胞悬液 100L( 含 1106个细胞 )， 室温孵育 25min， 用含 1%BSA 的 PBS 洗涤后， 流式细胞仪检测。 0065 流 式 细 胞 仪 分 析 原 代 人 脂 肪 干 细 胞 表 型 ： CD29+(77.5%)， CD34-(3.3%)， CD44+(26.8%)， CD45-(3.8%)， CD105+(30.1%)， HLA.DR-(2.0%)，。
33、 表明该细胞具有干细胞特 性。HLA.DR 表达不明显， 排除该类细胞是成纤维细胞。 0066 3 增殖中端粒酶活性的测定 ： 0067 用 TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA 试剂盒 (Chemocon Inc.) 按说明书 (TRAP 法 ) 检测体外培养 6 天以上的人脂肪干细胞， 同时以人胚肾细胞 293 细胞株细胞 (293T) 为 阳性对照， 干扰素为阴性对照 ( 试剂盒内提供 )。检测方法如下， 取 2106个细胞， 裂解细 胞， 取离心上清 2L 进行端粒酶催化特异底物反应的 PCR， PCR 产物变性后用 DIG 标记的 特异探针杂交， 而后用偶联过。
34、氧化物酶的抗 DIG 抗体行 ELISA 反应， 在酶标仪测定 ELISA 结 果。测定波长为 450nm 和 690nm 吸光度 (A) 值， 吸光度差值 A=A450A690， A 代表端 粒酶活性。结果判断标准 ： 阳性对照 A1.5， 阴性对照 A0.2 者为阳性。采用 SAS9.0 软件包进行结果分析， 测定值以均值 标 准差表示。 0068 使用最适宜剂量细胞增殖剂培养的人脂肪干细胞样本测定值为第 6 天人脂肪干 细胞为 (0.0500.002)， 第 10 天人脂肪干细胞为 (0.0550.012)， 阳性对照 293 细胞为 2.1， 阴性对照干扰素为 0.048（图 4） 。。
35、 0069 端粒是染色体末端由 TTAGGG 重复序列和相关结合蛋白质所组成的特殊结构， 与 细胞的增殖分裂能力密切相关。已证明约 80% 的恶性肿瘤和永生化细胞系细胞 （如本实验 的阳性对照 293 细胞） 表达高水平的端粒酶活性， 而正常体细胞端粒酶表达水平很低。因 此， 增殖培养基培养的无论是在生长的最旺盛的第 6 天以及持续增殖的第 10 天， 细胞端粒 酶活性始终保持正常水平， 说明培养的细胞正常， 没有癌变。 0070 4 人脂肪干细胞的染色体核型分析 ： 0071 各取增殖剂培养的第 6 天、 第 10 天的脂肪干细胞， 加入 5g/L 的秋水仙素 ( 终质 量浓度为 0.04m。
36、g/L)， 然后置于 37、 5%( 体积分数 )CO2孵箱中培养 5h， 消化、 离心， 加入 0.075%kcl， 静置 20min， 加入少许固定液 (10% 福尔马林 ) 预固定后离心， 然后固定 30min， 离心， 滴片， 干燥后 Giemsa 染色， 烘干， 显微镜下观察。以上各方法用不同样本细胞重复实 验3次。 结果显示 ： 使用本专利细胞增殖剂在体外培养扩增的条件下， 人脂肪干细胞的染色 体核型未发生易位、 倒位、 缺失或复制、 融合等异常变化。染色体核型的异常改变和癌症的 发生有着密切关系。 目前的研究已经证实肿瘤的发生与细胞染色体互易、 缺失、 插入和倒位 致染色体特异性。
37、断裂点区域癌基因激活表达或抑癌基因缺失， 导致相关编码蛋白异常和细 说 明 书 CN 102757936 A 9 7/7 页 10 胞生物学性状改变之间存在着必然的联系。因此 , 人脂肪干细胞在体外条件下分离培养、 扩增数代后， 其染色体核型是否发生异常改变， 这与其作为组织工程种子细胞的安全性有 着重要的关系。 本专利实验结果表明 ： 经过细胞增殖剂多日培养， 人脂肪干细胞核型均未发 生易位、 倒位、 缺失或复制、 融合等异常变化， 为正常的细胞核型。 0072 由上可见， 使用本专利发明的细胞增殖剂刺激人脂肪干细胞在体外进行增殖和分 裂过程中其端粒酶是呈阴性或低于 TRAP 法检测水平的低水平表达， 而不像肿瘤细胞那样 持续高表达端粒酶活性。此外， 其染色体核型也未见异常改变。这一研究预示体外培养的 人脂肪干细胞可能是安全的， 为其进一步应用于各项研究提供了安全性指标及理论基础。 0073 以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说， 在不 脱离本发明创造构思的前提下， 还可以做出若干改变和改进， 这些都属于本发明的保护范 围。 说 明 书 CN 102757936 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2图 3 说 明 书 附 图 CN 102757936 A 11 2/2 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757936 A 12 。