技术领域
本发明涉及肽YY(PYY)的类似物和/或衍生物及其制药用途。
序列表的援引并入
标题为“序列表”的序列表为25054个字节，于2013年11月12日创建并通过引用并 入本文。
背景技术
PYY在进餐过程中从在远端小肠和结肠中的L-细胞中释放。已知PYY在胃肠(GI)道 中具有外周作用，并且也作为饱腹感信号作用于中枢。PYY作为具有C-末端酰胺的36氨基酸 肽(PYY(1-36))被天然地分泌，但被切割成构成约50％的循环PYY的PYY(3-36)。负责该降解 的酶是二肽基肽酶IV(DPPIV)。PYY(3-36)快速地被蛋白酶及其他清除机制消除。已经报道， PYY(3-36)在猪中的半衰期<30分钟(ItoT等人,JournalofEndocrinology(2006),191, pp113-119)。因此，PYY显示出次优的药代动力学性质，这意味着该肽必须每天施用至少两 次。
PYY(1-36)以几乎没有选择性地激活Y1、Y2和Y5受体，并以更低选择性激活Y4受 体，但DPPIV处理过的PYY(3-36)显示出对Y2受体的选择性比对Y1、Y4和Y5受体的选择性增 加，尽管保留了一定的Y1和Y5亲和性。已知Y2受体活化降低食欲和食物摄取，而Y1和Y5受体 活化导致食欲和食物摄取增加。此外，Y1和Y5受体活化可导致血压升高。
根据这些PYY(3-36)肽在动物模型和人中所显示出的效果，以及根据肥胖者具有 低基础水平的PYY以及该肽较低的进餐响应这一事实，PYY(3-36)已被建议在肥胖症以及相 关疾病的治疗中使用。此外，已经证明Y2激动剂在胃肠(GI)道中具有抗分泌和促吸收作用。 已经提示了Y2激动剂在一些胃肠病症的治疗中的潜在应用。
根据在例如Zucker大鼠和饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠中所显示出的效果，Y2选择 性PYY(3-36)类似物对葡萄糖代谢具有积极影响，并因此被建议用于糖尿病的治疗(van denHoekA.等人,AmJPhysiolEndocrinolMetab(2006),292,ppE238-E245；和Ortiz A.等人,TheJournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics(2007),323,pp 692-700)。
WO2009/138511A1涉及长效Y2和/或Y4受体激动剂。WO2011/033068A1涉及针对 C-末端蛋白水解分解而稳定化的PYY类似物。WO2011/058165A1涉及具有延长的药代动力 学性质的Y2受体激动剂。
对于对Y受体调节具有响应的病况如肥胖症和糖尿病的治疗，使用对Y受体亚型Y2 具有特异性且重要的是也显示出延长的药代动力学性质的PYY类似物将是有吸引力的，由 此该PYY类似物可在具有比PYY或PYY(3-36)更低的施用频率的给药方案中使用。
发明概述
本发明涉及在与人PYY(1-36)(hPYY(1-36)，SEQIDNO:1)的位置35相对应的位置 处包含β-高精氨酸的PYY化合物。
另外或可替代地，在一个方面，所述PYY化合物还包含在与hPYY(1-36)的位置7相 对应的位置处的赖氨酸，以及连接至该赖氨酸的ε氨基基团的修饰基团。
在一个方面，本发明还涉及包含这样的PYY化合物和药学上可接受的辅料的药物 组合物，以及该PYY化合物的医疗用途。
另外或可替代地，在一个方面，本发明涉及为Y2受体激动剂的PYY化合物。
另外或可替代地，在一个方面，本发明涉及相比于对Y受体亚型Y1、Y4和Y5，显示出 对Y受体亚型Y2的选择性的PYY化合物。
另外或可替代地，在一个方面，本发明涉及具有比hPYY(3-36)的半衰期更长的半 衰期的PYY化合物。另外或可替代地，在一个方面，本发明涉及具有比hPYY(1-36)的半衰期 更长的半衰期的PYY化合物。
发明详述
本发明涉及PYY化合物。本发明的PYY化合物在与hPYY(1-36)的位置35相对应的位 置处的氨基酸被β-高精氨酸置换。
另外或可替代地，在一个方面，所述PYY化合物还包含在与hPYY(1-36)的位置7相 对应的位置处的赖氨酸，以及连接至该赖氨酸的ε氨基基团的修饰基团。
另外或可替代地，在一个方面，本发明涉及为Y受体亚型Y2激动剂的PYY化合物。
另外或可替代地，在一个方面，本发明涉及相比于对Y受体亚型Y1、Y4和Y5，显示出 对Y受体亚型Y2的选择性的PYY化合物。
在一个方面，对特定受体相比于对其他受体具有“选择性”的肽是指这样的肽：如 在受体功能试验如Actone功能效力试验中体外测量并按照EC50值进行比较，或者在测量受 体结合亲和力的闪烁迫近分析(ScintillationProximityAssay,SPA)中体外测量并按照 Ki值进行比较，其显示出对一种Y受体相比于对其他Y受体为至少10倍，如至少20倍、至少50 倍或至少100倍的效力。
在下文中，希腊字母可由其符号或相应的书面名称来表示，例如：α＝alpha；β＝ beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。
PYY化合物
如本文所用的术语“hPYY(1-36)”是指人肽YY，其序列作为SEQIDNO:1被包括在 序列表中。具有SEQIDNO:1的序列的肽也可称为天然hPYY。
如本文所用的术语“PYY化合物”是指为hPYY(1-36)的变体的肽或化合物。如本文 所用的术语“PYY化合物”还可指为hPYY(3-36)(SEQIDNO:2)的变体的肽或化合物。
如本文所用的术语“PYY化合物”还可指为hPYY(4-36)的变体的肽或化合物。
本发明的PYY化合物的C-末端是酰胺，正如天然hPYY(1-36)(SEQIDNO:1)和hPYY (3-36)(SEQIDNO:2)各自的C-末端一样。
本发明的PYY化合物可以是PYY类似物和/或其衍生物。
术语“PYY类似物”用于其中存在至少一个在骨架中的氨基酸修饰的PYY化合物。
术语“PYY衍生物”用于包含至少一个共价连接的非氨基酸取代基的PYY化合物。
因此，PYY类似物的衍生物是包含至少一个氨基酸修饰和至少一个共价连接的非 氨基酸取代基的PYY化合物。
相比于hPYY(3-36)，本发明的PYY化合物可包含至多10个氨基酸修饰。
在整个申请中使用的术语“氨基酸修饰”以相比于hPYY(3-36)具有氨基酸修饰的 含义使用。该修饰可以是氨基酸缺失、氨基酸添加、一种氨基酸被另一种氨基酸置换、或共 价连接至该肽的氨基酸的取代基的结果。
本发明的PYY化合物在与hPYY(1-36)的位置35相对应的位置处包含L-β-高精氨酸 (β-homoArg)，这意味着除了在与hPYY(1-36)的位置35相对应的位置处的该修饰之外，本发 明的PYY化合物还可包含至多9个氨基酸修饰。
在又一个方面，本发明的PYY肽可表现出与hPYY(3-36)至少70％、75％或80％的序 列同一性。作为用于确定两种类似物之间的序列同一性的方法的实例，将两种肽[β- homoArg35]hPYY(3-36)和hPYY(3-36)进行比对。[β-homoArg35]hPYY(3-36)类似物相对于 hPYY(3-36)的序列同一性通过用被比对的残基总数减去经比对显示不同残基的数目，然后 除以hPYY(3-36)中残基的总数而得出。相应地，在所述实例中，序列同一性为(34-1)/34。
本发明的PYY化合物或PYY类似物可参照以下方面进行描述：i)在hPYY(1-36)中与 被改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基(即，hPYY(1-36)中的相应位置)的数字编号，和 ii)实际的变化。
以下是合适的类似物命名的非限制性实例。[β-homoArg35]hPYY(3-36)命名人PYY (1-36)的一种类似物，其中在位置35处的天然存在的精氨酸已被L-β-高精氨酸置换，并且 分别在位置1和2处的天然存在的酪氨酸和脯氨酸已缺失。
以下是合适的类似物命名的非限制性实例。[β-homoArg35]hPYY(3-36)命名人PYY (1-36)的一种类似物，其中在位置35处的天然存在的精氨酸已被β-高精氨酸置换，并且分 别在位置1和2处的天然存在的酪氨酸和脯氨酸已缺失。
以下是PYY类似物的衍生物的合适命名的非限制性实例。7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2- [2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰基]-[Lys7,β-homoArg35]hPYY(3-36)命名人PYY(3-36)的 类似物的一种衍生物，其中[Lys7,β-homoArg35]指与hPYY(3-36)(SEQIDNO:2)相比的氨 基酸变化，并且其中取代基[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基 氨基)丁酰基]-氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-连接至在与 hPYY(1-36)的位置7相对应的位置处的赖氨酸的ε氨基基团。
表述“与…等同的位置”或“对应的位置”可用于表征PYY变体序列中相对于hPYY (1-36)发生变化的位点。
通常在整个申请中，当提及PYY类似物的特定位置时，所提及的位置是与hPYY(1- 36)的该特定位置相对应的PYY类似物的位置。
在整个申请中所用的表述，PYY化合物在与hPYY(1-36)的某位置相对应的位置处 包含特定氨基酸，意指在该位置处的天然氨基酸已被该特定氨基酸替换。
氨基酸残基可用其全名、其单字母密码和/或其三字母密码来表示。这三种方式是 完全等同的。
“包含”某些指定变化的类似物可包含与hPYY(1-36)相比进一步的变化。在一个方 面，该类似物“具有”该指定的变化。
PYY类似物
PYY类似物是与hPYY(1-36)相比其中一些氨基酸残基已经被修饰的PYY肽。这些修 饰包括置换、插入和/或缺失，或上述的组合。
在特定的方面，本发明的PYY类似物包含一个或多个“非必需”氨基酸残基修饰。在 本发明的上下文中，“非必需”氨基酸残基是在人PYY氨基酸序列中可被改变，即删除或置换 而不消除或不显著降低PYY类似物对Y2受体的活性的残基。
置换。在一个方面，氨基酸可通过保守置换进行置换。如本文所用的术语“保守置 换”表示一个或多个氨基酸被另外的生物学相似的残基替换。实例包括具有相似特征的氨 基酸残基如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸以及芳香族氨 基酸的置换。
在一个方面，本发明的PYY类似物可包含一个或多个非天然氨基酸和/或非氨基酸 例如氨基酸模拟物向PYY序列中的置换。
缺失和截短。在一个方面，本发明的PYY类似物可相对于人PYY的氨基酸序列缺失 一个或多个氨基酸残基，其单独发生或与一个或多个插入或置换组合。
插入。在一个方面，本发明的PYY类似物可具有一个或多个插入到人PYY的氨基酸 序列中的氨基酸残基，其单独发生或与一个或多个缺失和/或置换组合。
在一个方面，本发明的PYY类似物可包含一个或多个非天然氨基酸和/或非氨基酸 向PYY序列中的插入。
PYY肽可来源于脊椎动物，如人、小鼠、绵羊、山羊、牛或马。术语“脊椎动物”意指脊 索动物门的主要分支—脊椎动物亚门的成员，其包括鱼、两栖动物、爬行动物、禽类和哺乳 动物，所有这些动物的特征都在于分节的脊柱和明显的分化良好的头部。术语“哺乳动物” 指人类以及哺乳纲中具有体内平衡机制的动物界中的其他温血成员，例如，陪伴哺乳动物、 动物园哺乳动物以及食物来源哺乳动物。陪伴哺乳动物的一些实例是犬科动物(例如，狗)、 猫科动物(例如，猫)和马；食物来源哺乳动物的一些实例是猪、牛、羊等。在一个方面，哺乳 动物是人或陪伴哺乳动物。在一个方面，哺乳动物是人(男性或女性)。
例如在本发明的PYY化合物的上下文中使用的术语“肽”是指包含一系列由酰胺 (或肽)键相互连接的氨基酸的化合物。
本发明的PYY肽包含至少25个通过肽键连接的组成性氨基酸。在特定的实施方案 中，该PYY肽包含至少33个氨基酸。在特定的实施方案中，该PYY肽包含至少34个氨基酸。
氨基酸是含有胺基团和羧酸基团并任选地包含一个或多个常被称为侧链的其他 基团的分子。
术语“氨基酸”包括蛋白原(proteinogenic)(或天然)氨基酸(20种标准氨基酸中 的)，以及非蛋白原(或非天然)氨基酸。蛋白原氨基酸是天然地包含在蛋白质中的那些氨基 酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸。非蛋白原氨基酸或者未见于蛋白质中，或 者不通过标准细胞机制产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。非蛋白原氨基酸的非 限制性实例是Aib(α-氨基异丁酸)、β-homoArg(L-β-高精氨酸)以及蛋白原氨基酸的D-异构 体。
在下文中，对其旋光异构体没有说明的PYY化合物的所有氨基酸应理解为指L-异 构体(除非另有说明)。
PYY衍生物
如本文在PYY肽或类似物的上下文中所用的术语“衍生物”是指化学修饰的PYY肽， 其中一个或多个取代基被共价连接至该肽。
在本发明的一个方面，所述取代基可以是N-末端取代基。
另外或可替代地，在一个方面，所述取代基可以是修饰基团或可替代地被称作延 长部分。
N-末端取代基
在本发明的一个方面，PYY化合物包含共价连接至PYY化合物N-末端氨基酸残基中 的α-氨基基团的取代基。在一个方面，在与hPYY(1-36)的位置1-3相对应的位置处的氨基酸 残基缺失，并且N-末端取代基共价连接至与hPYY(1-36)的位置4相对应位置处的氨基酸残 基。
在一个方面，所述N-末端取代基是烷氧基基团。在一个方面，所述N-末端取代基是 包含至多12个碳原子的烷氧基基团。在另一个方面，所述N-末端取代基是包含至多6个碳原 子的烷氧基基团。
修饰基团/延长部分
在一个方面，PYY化合物包含共价地连接至与hPYY(1-36)的位置7相对应位置处的 氨基酸残基的取代基或修饰基团。在一个进一步的方面，该取代基或修饰基团能够与蛋白 质形成非共价缀合物，由此促进该衍生物随血流的循环，并且由于PYY衍生物与白蛋白的缀 合物仅通过肾脏清除缓慢地除去，该取代基或修饰基团还具有延长该衍生物的作用时间的 效果。因此，该取代基或修饰基团作为整体也可被称为延长部分。
所述修饰基团可通过酰化，即经由修饰基团的羧酸基团与赖氨酸残基的ε氨基基 团之间形成的酰胺键而共价连接至PYY肽的赖氨酸残基。赖氨酸的氨基基团还可通过还原 氨化与修饰基团的醛偶联。在另一个方面，半胱氨酸的巯基基团可通过迈克尔加成偶联至 修饰基团的马来酰亚胺基基团，或通过亲核取代偶联至修饰基团的氯乙酰基或碘乙酰基基 团。
在一个方面，所述修饰基团可通过酰化，即经由修饰基团的羧酸基团与赖氨酸残 基的ε氨基基团之间形成的酰胺键而共价连接至在与hPYY(1-36)的位置7相对应的位置处 的赖氨酸残基。
本发明的衍生物可以以不同的立体异构形式存在，该立体异构形式具有相同的分 子式和键合原子的序列，仅在其原子在空间中的三维取向上不同。本发明的示例性衍生物 的立体异构性在实验部分中使用标准命名法以名称及结构的形式说明。除非另外说明，本 发明涉及所请求保护的衍生物的所有立体异构形式。
在本发明的一个方面，对其旋光异构体没有说明的PYY化合物的所有氨基酸应理 解为指L-异构体(除非另有说明)。
药学上可接受的盐
本发明的PYY化合物可以是药学上可接受的盐的形式。
例如，盐通过碱与酸之间的化学反应形成，例如：2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。
所述盐可以是碱性盐、酸性盐，或者其可以两者都不是(即中性盐)。在水中碱性盐 产生氢氧根离子，而酸性盐产生水合氢离子。
本发明的衍生物的盐可通过分别在阴离子或阳离子基团间添加阳离子或阴离子 来形成。这些基团可位于本发明的衍生物的肽部分，和/或位于侧链中。
本发明的衍生物的阴离子基团的非限制性实例包括在侧链(如果存在)以及肽部 分中的游离羧基基团。肽部分通常包括在内部酸性氨基酸残基如Asp和Glu处的游离羧基基 团。
在肽部分中的阳离子基团的非限制性实例包括在N-末端(如果存在)的游离氨基 基团，以及内部碱性氨基酸残基如His、Arg和Lys的任何游离氨基基团。
功能性质
在第一个功能方面，本发明的PYY化合物具有优良的Y2受体效力。另外或可替代 地，在第二个方面，这些PYY化合物与Y2受体非常好地结合。优选这些PYY化合物是完全Y2受 体激动剂，其反映在这些PYY化合物与Y2受体强烈结合的能力，并且相比于hPYY(1-36)和 hPYY(3-36)，这些PYY化合物使受体完全活化的能力。
另外或可替代地，在第二个功能方面，本发明涉及相比于对Y受体亚型Y1、Y4和Y5， 显示出对Y受体亚型Y2的选择性的PYY化合物。
另外或可替代地，在第三个功能方面，本发明的PYY化合物具有改善的药代动力学 性质。另外或可替代地，在第四个功能方面，本发明的PYY化合物具有延长的半衰期和/或降 低的清除率。另外或可替代地，在第五个功能方面，其具有降低血糖的体内效果。另外或可 替代地，在第六个功能方面，其具有降低食物摄取的体内效果。
生物活性—体外效力
根据第一功能方面，本发明的PYY化合物是生物活性的或有效力的。
在特定的实施方案中，效力和/或活性是指体外效力，即在功能性Y2受体试验中的 表现，更具体地指激活人Y2受体的能力。
术语半数最大有效浓度(EC50)通常是指参考剂量响应曲线，诱发响应达到基线与 最大值之间的一半时的浓度。EC50用作化合物效力的量度，并代表观察到其最大效果的50％ 时的浓度。
本发明的衍生物的体外效力可如实施例31中所述进行确定，并确定所讨论的衍生 物的EC50。EC50值越低，效力越高。
在一个方面，本发明的衍生物具有对应于100nM或以下的EC50的体外效力，该体外 效力采用实施例31的方法确定。在另一个方面，本发明的衍生物具有对应于50nM或以下的 EC50的体外效力，该体外效力采用实施例31的方法确定。在另一个方面，本发明的衍生物具 有对应于25nM或以下的EC50的体外效力，该体外效力采用实施例31的方法确定。
生物活性—体外受体结合
根据第二个功能方面，本发明的PYY化合物与Y2受体非常好地结合。这可以如实施 例32中所述进行确定。
通常，与Y2受体的结合应尽可能的好，这对应于低Ki值。Ki值通过Cheng-Prusoff 等式Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)确定，其中IC50是激动剂的半数最大抑制浓度，[L]是放射配体 的浓度，且Kd是结合的解离常数。
作为示例，在一个方面，Y2受体结合亲和力(Ki)低于100nM。在一个方面，Y2受体结 合亲和力(Ki)低于50nM。在一个方面，Y2受体结合亲和力(Ki)低于10nM。
生物活性—体内药理学
在另一个特定的实施方案中，本发明的PYY化合物在体内有效力，这可以如本领域 已知的在任何合适的动物模型以及临床试验中确定。
糖尿病db/db小鼠是合适的动物模型的一个实例，并且例如如实施例34中所述，可 以在这样的小鼠中体内确定血糖降低效果。
此外，如同样在实施例34中描述的，对db/db小鼠的食物摄取的抑制是用于确定对 食物摄取和体重的影响的合适的模型。
通常，1umol/kg剂量的葡糖糖降低效果应尽可能的好，其对应于较低的相对％葡 萄糖水平。
作为示例，在本发明的特定方面，给药后16小时，相对％葡萄糖水平低于80％。在 本发明的一个方面，给药后16小时，相对％葡萄糖水平低于70％。在本发明的一个方面，给 药后16小时，相对％葡萄糖水平低于60％。
作为示例，在本发明的特定方面，给药后16小时，％相对食物摄取低于40％。在本 发明的一个方面，给药后16小时，％相对食物摄取低于30％。在本发明的一个方面，给药后 16小时，％相对食物摄取低于20％。
药代动力学概况
根据第三个功能方面，本发明的PYY化合物具有改善的药代动力学性质，如延长的 终末半衰期(terminalhalf-life)和/或降低的清除率。
延长终末半衰期和/或降低清除率意味着所讨论的化合物从体内排除变慢。对于 本发明的化合物，这导致延长的药理学作用时间。
本发明的衍生物的药代动力学性质可适当地在体内药代动力学(PK)研究中确定。 进行这样的研究以评价药物化合物如何在体内吸收、分布和排除，以及这些过程如何随时 程影响化合物在体内的浓度。
在医药药物开发的发现和临床前阶段，可使用动物模型如小鼠、大鼠、猴、狗或猪 来进行该表征。这些模型中的任意模型均可用于测试本发明的衍生物的药代动力学性质。
在新药化合物的评价中，终末半衰期和/或清除率的估计与给药方案和药物开发 中的重要参数的评价相关。
药代动力学概况—在小型猪中的体内半衰期
根据第三个功能方面，本发明的衍生物具有改善的药代动力学性质。
在特定的实施方案中，药代动力学性质可确定为在小型猪中静脉内施用后的体内 终末半衰期(T1/2)，例如，如本文实施例33中所述。
在本发明的一个方面，在小型猪中的终末半衰期为至少10小时。在本发明的一个 方面，在小型猪中的终末半衰期为至少20小时。在本发明的又一个方面，在小型猪中的终末 半衰期为至少40小时。
PYY化合物的生产
肽如本发明的PYY化合物的生产是本领域公知的。
例如，本发明的衍生物的PYY部分可通过经典的肽合成，例如，采用t-Boc或Fmoc化学法的固相肽合成或其他公认的技术来生产，参见，例如，Greene和Wuts,“ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis”,JohnWiley&Sons,1999；FlorencioZaragoza“OrganicSynthesisonsolidPhase”,Wiley-VCHVerlagGmbH,2000；以及“FmocSolidPhasePeptideSynthesis”,W.C.Chan和P.D.White编著,OxfordUniversityPress,2000。
另外或可替代地，它们可以通过重组方法来生产，也就是通过将含有编码该类似 物的DNA序列并能够表达该肽的宿主细胞在合适的营养培养基中在允许该肽表达的条件下 培养而进行生产。适合于这些肽的表达的宿主细胞的非限制性实例是：大肠杆菌、酿酒酵母 以及哺乳动物BHK或CHO细胞系。
例如，包含非天然氨基酸和/或共价连接的取代基的本发明的PYY化合物可以如实 验部分所述进行生产。
制备若干本发明的PYY化合物的方法的具体实例包括在实验部分中。
蛋白质纯化
本发明的PYY化合物可通过本领域已知的多种方法进行纯化，这些方法包括但不 限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法和反相高效液相色谱法(RP- HPLC))、电泳法或萃取(参见，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden编 著,VCHPublishers,NewYork,1989)。
给药方式
除非另外指出或明显与上下文矛盾，否则术语“治疗”意在包括对所提及的疾病、 病症或病况的预防和最小化(即，“治疗”指本发明的PYY化合物或包含本发明PYY化合物的 组合物的预防性和治疗性给药两者)。
给药途径可以是将本发明的化合物有效递送到身体中期望的或适当的位置的任 何途径，如肠胃外，例如，皮下、肌内或静脉内。或者，本发明的化合物可以口服、经肺、经直 肠、经皮、经颊、舌下或经鼻给药。
药物组合物
包含本发明的PYY化合物的可注射组合物可采用制药工业的常规技术来制备，该 常规技术包括将成分适当地溶解并混合以得到期望的终产物。因此，根据一种方法，将本发 明的PYY化合物溶解于在适当pH的合适缓冲液中，以便使沉淀最小化或避免沉淀。可注射的 组合物可以通过，例如无菌过滤，被制成无菌的。
组合物可以是稳定化的制剂。术语“稳定化的制剂”是指具有提高的物理和/或化 学稳定性(优选两者兼具)的制剂。通常，制剂在使用和储存(按照推荐的使用和储存条件) 期间必须是稳定的，直到达到有效期。
术语“物理稳定性”是指由于暴露于热-机械应力和/或与去稳定化界面和表面(如 疏水表面)相互作用而导致多肽形成无生物活性和/或不溶性聚集体的倾向。水性多肽制剂 的物理稳定性可通过目测的方法，和/或通过在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如，搅 拌)不同时间段后的浊度测量来评价。或者，可使用多肽构象状态的光谱剂或探针，例如，硫 黄素T(ThioflavinT)或“疏水补片(hydrophobicpatch)”探针来评价物理稳定性。
术语“化学稳定性”是指导致化学降解产物形成的多肽结构的化学(特别是共价 的)变化，该化学降解产物可能具有相比于完整多肽降低的生物学效力和/或增加的免疫原 性效应。可通过例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC测量在暴露于不同环境条件后的不同时间点化 学降解产物的量来评价化学稳定性。
在一个方面，本发明提供了具有改善的物理稳定性的PYY化合物。在一个方面，本 发明提供了具有改善的化学稳定性的PYY化合物。
联合治疗
采用根据本发明的PYY化合物的治疗还可与一种或多种其他药理学活性物质相组 合，该药理学活性物质例如选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗 和/或预防由糖尿病引起或与糖尿病相关的并发症的药剂、以及用于治疗和/或预防由肥胖 症引起或与肥胖症相关的并发症和病症的药剂。
这些药理学活性物质的实例是：GLP-1受体激动剂、胰岛素、DPP-IV(二肽基肽酶- IV)抑制剂、胰淀素(amylin)激动剂和瘦素受体激动剂。
药物适应症
本发明还涉及用作药物的本发明的PYY化合物。
在本发明的特定方面，本发明的PYY化合物可用于以下的医学治疗：
(i)预防和/或治疗所有形式的糖尿病，如高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、 1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、MODY(青春晚期糖尿病(maturityonsetdiabetes oftheyoung))、妊娠期糖尿病和/或HbA1C的减少；
(ii)延缓或阻止糖尿病进展，如2型糖尿病的进展，延缓葡萄糖耐量降低(IGT)向 需要胰岛素的2型糖尿病的进展，延缓或阻止胰岛素抗性，和/或延缓不需要胰岛素的2型糖 尿病向需要胰岛素的2型糖尿病的进展；
(ⅲ)改善β-细胞功能，如降低β-细胞凋亡、增加β-细胞功能和/或β-细胞量，和/或 用于恢复β-细胞的葡萄糖敏感性；
(iv)通过例如减少食物摄取、减轻体重、抑制食欲、诱发饱腹感预防和/或治疗进 食障碍，诸如肥胖症；治疗或预防暴食症、神经性贪食症和/或由抗精神病药物或类固醇给 药而引起的肥胖症；减少胃运动；延缓胃排空；增加身体活动；和/或预防和/或治疗肥胖症 的共病，例如骨关节炎和/或尿失禁；
(v)预防和/或治疗糖尿病并发症，如血管病；神经病，包括周围神经病变；肾病； 和/或视网膜病变；
(vi)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常、降低总血清脂质；增加HDL；降低 小而密的LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低人体内脂蛋白a(Lp(a))的血浆水 平；抑制载脂蛋白a(apo(a))的体外和/或体内产生；
(vii)预防和/或治疗心血管疾病；和/或
(viii)预防和/或治疗睡眠呼吸暂停。
下列适应症是特别优选的：2型糖尿病和/或肥胖症。
在一个方面，本文中公开了用于改变受试者的能量代谢的方法。该方法包括向受 试者施用治疗有效量的本发明的PYY化合物，由此改变能量消耗。能量在所有的生理过程中 燃烧。身体可通过调节这些过程的效率，或改变正在发生的过程的数目和性质，来直接改变 能量消耗的速率。例如，在消化过程中，身体耗费能量使食物移动通过肠并消化食物，并且 在细胞内，细胞代谢的效率可被改变，以产生更多或更少的热量。
在一个方面，本文公开了用于在本申请中描述的精确循环(circuitry)中的任意 和全部操作的方法，这些操作协作地(co-ordinately)改变食物摄取并相互地 (reciprocally)改变能量消耗。能量消耗是细胞代谢、蛋白质合成、代谢速率和卡路里使用 的结果。因此，在该实施方案中，外周给药导致能量消耗增加，以及卡路里利用效率降低。在 一个方面，向受试者施用治疗有效量的根据本发明的PYY化合物，由此增加能量消耗。
尽管“肥胖”通常被定义为身体质量指数超过30，但对于本公开内容而言，“肥胖” 的范围内包括需要或希望减轻体重的任何受试者，包括那些身体质量指数小于30的受试 者。不希望受到理论的限制，认为外周施用本发明的PYY化合物在减少食物摄取、延迟胃排 空、降低营养物可利用性以及体重减轻的诱因方面的效果取决于其与一种或多种PP家族具 体受体或与之相似的受体的相互作用。更具体地，似乎涉及到与PYY-优选(或Y2)受体相似 的一种或多种受体。
具体实施方案
通过以下本发明的非限制性实施方案对本发明进行进一步描述：
1.一种在与hPYY(1-36)(SEQIDNO:1)的位置35相对应的位置处包含L-β-高精氨 酸的PYY化合物，及其药学上可接受的盐。
2.根据实施方案1的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合物具有最多10 个氨基酸修饰。
3.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有最多8个氨基酸修饰。
4.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有最少4个氨基酸修饰。
5.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有最少6个氨基酸修饰。
6.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有最少8个氨基酸修饰。
7.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有4到10个氨基酸修饰。
8.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有6到8个氨基酸修饰。
9.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有6个氨基酸修饰。
10.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(3-36)相比，该PYY化合 物具有8个氨基酸修饰。
11.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中该PYY化合物表现出与hPYY(3- 36)至少70％的序列同一性。
12.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中该PYY化合物表现出与hPYY(3- 36)至少75％的序列同一性。
13.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中该PYY化合物表现出与hPYY(3- 36)至少80％的序列同一性。
14.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(1-36)(SEQIDNO:1) 的位置1和2相对应的位置缺失。
15.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(1-36)(SEQIDNO:1) 的位置1-3相对应的位置缺失。
16.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步在与hPYY(1-36)(SEQID NO:1)的位置4相对应的位置处包含精氨酸。
17.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步在与hPYY(1-36)(SEQID NO:1)的位置18相对应的位置处包含谷氨酰胺。
18.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步在与hPYY(1-36)(SEQID NO:1)的位置22相对应的位置处包含Aib。
19.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步在与hPYY(1-36)(SEQID NO:1)的位置24相对应的位置处包含丙氨酸。
20.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步在与hPYY(1-36)(SEQID NO:1)的位置24相对应的位置处包含Aib。
21.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步在与hPYY(1-36)(SEQID NO:1)的位置30相对应的位置处包含色氨酸。
22.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中与hPYY(1-36)(SEQIDNO:1) 的位置1-3相对应的位置缺失，并且其中该PYY化合物进一步包含N-末端取代基，其中该N- 末端取代基是包含至多12个碳原子的烷氧基基团。
23.根据实施方案22的PYY化合物，其中所述N-末端取代基是包含至多10个碳原子 的烷氧基基团。
24.根据实施方案22的PYY化合物，其中所述N-末端取代基是包含至多8个碳原子 的烷氧基基团。
25.根据实施方案22的PYY化合物，其中所述N-末端取代基是包含至多6个碳原子 的烷氧基基团。
26.根据实施方案22的PYY化合物，其中所述N-末端取代基是包含6个碳原子的烷 氧基基团。
27.根据实施方案26的PYY化合物，其中所述N-末端取代基是3-甲基丁酰基。
28.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其进一步包含在与hPYY(1-36)(SEQ IDNO:1)的位置7相对应的位置处的赖氨酸，以及连接至在位置7处的赖氨酸残基的ε氨基 基团的修饰基团，其中所述修饰基团被定义为A-B-C-，其中A-包含羧酸或磺酸。
29.根据实施方案28的PYY化合物，其中A-选自
其中a为12到19的整数，且b为10到16的整数，并且其中*表示与–B-的连接点。
30.根据实施方案29的PYY化合物，其中a为15且c为13。
31.根据实施方案28的PYY化合物，其中A-是
其中a为12到19的整数，并且其中*表示与–B-的连接点。
32.根据实施方案31的PYY化合物，其中a为15。
33.根据实施方案29的PYY化合物，其中A-是
其中b为10到16的整数，并且其中*表示与–B-的连接点。
34.根据实施方案33的PYY化合物，其中b为13。
35.根据实施方案28-34中任一个的PYY化合物，其中B-选自
其中c为1或2；且d为1或2；并且其中***表示与A-的连接点，且**表示与–C-的连接 点。
36.根据实施方案35的PYY化合物，其中B-为
其中c为1或2；并且其中***表示与A-的连接点，且**表示与–C-的连接点。
37.根据实施方案28-36中任一个的PYY化合物，其中-C-为
其中e为在1-5范围内的整数，f为在1-5范围内的整数，g为在2到6范围内的整数， 并且其中****表示与-B-的连接点，且*****表示与在与hPYY(1-36)的位置7相对应的位置 处的赖氨酸残基的ε氨基基团的连接点。
38.根据实施方案37的PYY化合物，其中e和f分别为1。
39.根据实施方案37-38中任一个的PYY化合物，其中g选自2、4或6。
40.根据实施方案39的PYY化合物，其中g为2。
41.根据实施方案39的PYY化合物，其中g为4。
42.根据实施方案39的PYY化合物，其中g为6。
43.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其中该PYY化合物不是盐。
44.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其选自如下的化合物：
[L-β-精氨酸35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:3)
[L-β-二高精氨酸35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:4)
[D-β-高精氨酸35]hPYY(3-36(SEQIDNO：5)
[β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:6)
[Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:7)
[Gln18,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:8)
[Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:9)
[Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:10)
[Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:11)
[Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:12)
[Aib24,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:13)
[Arg4,Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:14)
[Arg4,Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:15)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基-氨基)丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,β-homoArg35] hPYY(3-36)(SEQIDNO:16)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,β- homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:17)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧 基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,β- homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:18)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十 七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧 基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:19)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:20)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Aib22, β-homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:21)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Arg4,Lys7,β- homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:22)
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Arg4,Lys7,Gln18,β- homoArg35]hPYY(3-36)(SEQIDNO:23)
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4- [[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]丁酰基]-氨基]乙氧基]-乙氧 基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36)(SEQ IDNO:24)
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17- 羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰 基]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36)(SEQIDNO:25)
4-N{α}(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧 基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰 基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)(SEQIDNO:26)
4-N{α}(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4- [[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]-乙氧基]乙氧 基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36) (SEQIDNO:27)
4-N{α}(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺 基十六碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]-乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]-乙酰 基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)(SEQIDNO:28)
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17- 羧基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙氧基]乙氧基]乙酰 基]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)(SEQIDNO:29)
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16- 磺基十六碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)(SEQIDNO:30)
45.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其为人Y2受体激动剂。
46.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其为完全人Y2受体激动剂。
47.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其为选择性人Y2受体激动剂。
48.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其为选择性完全人Y2受体激动剂。
49.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其能够激活人Y2受体。
50.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其能够在使用表达人Y2受体的全细 胞的试验中激活人Y2受体。
51.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其能够在实施例31的Actone功能效 力试验中激活人Y2受体。
52.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其能够与人Y2受体结合。
53.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其能够与人Y2受体结合，其中与人 Y2受体的结合在竞争性结合试验如实施例32的试验中进行测量。
54.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其具有改善的药代动力学性质。
55.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其具有延长的半衰期和/或降低的 清除率。
56.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其具有降低血糖的体内效果，所述 效果在db/db小鼠模型中的单剂量研究中确定。
57.根据前述实施方案中任一个的PYY化合物，其具有降低食物摄取的体内效果， 所述效果在db/db小鼠模型中的单剂量研究中确定。
58.根据实施方案1-44中任一个的PYY化合物，其用作药物。
59.根据实施方案1-44中任一个的PYY化合物，其用于治疗和/或预防所有形式的 糖尿病及相关疾病，如进食障碍、糖尿病并发症、心血管疾病和/或睡眠呼吸暂停；和/或用 于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延缓或阻止糖尿病进展。
60.根据实施方案1-44中任一个的PYY化合物的用途，其用于制备药物，该药物用 于治疗和/或预防所有形式的糖尿病及相关疾病，如进食障碍、糖尿病并发症、心血管疾病 和/或睡眠呼吸暂停；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延缓或阻止糖 尿病进展。
61.一种通过施用药学活性量的根据实施方案1-44中任一个的PYY化合物治疗和/ 或预防所有形式的糖尿病及相关疾病，如进食障碍、糖尿病并发症、心血管疾病和/或睡眠 呼吸暂停；和/或改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或延缓或阻止糖尿病进展的方法。
实施例
该实验部分从缩写列表开始，随后为包括用于合成和表征本发明化合物的通用方 法的部分。然后为若干个涉及具体PYY化合物的制备的实施例，在最后，也包括若干个涉及 这些化合物的活性和性质的实施例(标题为药理学方法的部分)。
这些实施例用于说明本发明。
缩写列表
Aib：α-氨基异丁酸
r.t：室温
ACN：乙腈
DIPEA：二异丙基乙胺
H2O：水
CH3CN：乙腈
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
Fmoc：9H-芴-9-基甲氧基羰基
Boc：叔丁氧羰基
OtBu：叔丁酯
tBu：叔丁基
Trt：三苯甲基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
HFIP：六氟异丙醇
Mtt：4-甲基三苯甲基
DCM：二氯甲烷
TIPS：三异丙基硅烷
TFA：三氟乙酸
Et2O：乙醚
NMF：1-甲基-甲酰胺
NMP：1-甲基-吡咯烷-2-酮
DIPEA：二异丙基乙胺
HOAc：乙酸
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
DIC：二异丙基碳二亚胺
Min：分钟
MW：分子量
HMWP：高分子量蛋白质
β-homoArg：L-β-高精氨酸
材料与方法
通用制备方法
该部分涉及用于肽骨架的固相合成和连接至骨架的侧链的合成的方法(SPPS法， 包括氨基酸偶联、Fmoc-氨基酸去保护的方法，从树脂上切割肽以及其纯化的方法)。
1.与树脂结合的受保护的肽骨架的合成
用于肽骨架的自动化逐步组装的方法。根据在固相肽合成仪Prelude(Protein Technologies,Tucson,USA)上0.25mmol规模或0.4mmol规模的Fmoc策略，采用制造商提供 的机器加工方案合成了受保护的肽基树脂。所使用的Fmoc-保护的氨基酸衍生物是以下推 荐的标准品：由例如Bachem、IrisBiotech、ProteinTechnologies或Novabiochem提供的 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc- Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc- Tyr(tBu)-OH或Fmoc-Val-OH等。如果没有另外指定，则使用氨基酸的天然L-形式。通过使用 在NMP(N-甲基吡咯烷酮)中DIC(二环己基碳二亚胺)和OzymaPure(2-氰基-2-(羟基亚氨 基)-乙酸乙酯,Merck,Novabiochem,Switzerland)介导的偶联来实现偶联。采用相对于树 脂取代过量4-8倍(4-8当量)的氨基酸，如上所述完成Fmoc-氨基酸的偶联。偶联时间在1小 时直到4小时的范围内。采用双偶联程序(1小时+1小时)使Fmoc-Arg(pbf)-OH偶联。用于合 成肽酰胺的树脂可以是TentagelRAM(RappPolymere,Germany)、RinkamidChemMatrix 树脂(MatrixInnovation,Canada)、Rink-Amide树脂(Merck/Novabiochem)。所使用的受保 护的氨基酸衍生物是标准的Fmoc-氨基酸(由例如ProteinTechnologies或Novabiochem提 供)。用Mtt保护待衍生的赖氨酸的ε氨基基团。N-末端氨基酸或构件作为Boc-保护的氨基 酸，例如，Boc-Ile进行偶联。或者，根据以上针对Fmoc-氨基酸所述的偶联程序将异戊酸偶 联。采用以下步骤完成在Prelude上的逐步固相组装：1)通过使用在NMP中的25％哌啶去保 护(去除Fmoc)，持续2x4min，步骤2)用NMP和DCM洗涤(去除哌啶)，步骤3)通过添加1/10体积 的在NMP中的3MDIC和1/10体积的在NMP中的可力丁引发过量4-8当量的Fmoc-氨基酸(在 NMP中的0.3MOxymaPure中的0.3MFmoc-氨基酸)的偶联，持续1-4小时。通过不时用氮气 鼓泡完成混合，步骤4)洗涤(通过使用NMP和DCM去除过量的氨基酸和试剂)。最后一步包括 用DCM洗涤，这使得该树脂备用于白蛋白结合部分在赖氨酸侧链上的连接。
2.修饰基团与树脂结合的受保护的肽骨架的连接
用于手工去除Mtt-保护(赖氨酸(Mtt))的方法：在修饰基团合成之前，必须去除在 连接位点上的Mtt基团(赖氨酸)。将该树脂置于注射器或反应烧瓶中并用75％六氟异丙醇 (HFIP)+25％DCM处理2X30min以去除Mtt基团。然后如上所述用DCM和NMP洗涤该树脂，并用 在NMP中的5％DIPEA或在NMP中的25％哌啶进行中和(中和步骤)，随后在偶联白蛋白部分之 前进行NMP洗涤。或者省略中和步骤。
用于Prelude去除Mtt-保护(赖氨酸(Mtt))的方法：在Prelude上，将树脂用75％六 氟异丙醇(HFIP)+25％DCM处理2x2min，随后处理2X30min，以去除在赖氨酸上的Mtt基团。 然后将该树脂用DCM和NMP洗涤，之后为使用在NMP中的25％哌啶持续4分钟的中和步骤，随 后将该树脂备用于修饰基团的合成。
用于将修饰基团手工合成至赖氨酸残基上的方法：
采用DIC和OxymaPure，以相对于树脂取代的4-8当量将构件Fmoc-8-氨基-3,6-二 氧杂辛酸、Fmoc-Glu-OtBu和二十烷二酸单叔丁酯(CASNo.843666-40-0)偶联。偶联时间为 2-16小时，通常随后为采用1M乙酸酐持续15-60min的加帽步骤。通过采用在NMP中的25％哌 啶处理10-30分钟，随后洗涤来去除Fmoc-基团。将16-磺基十六烷酸溶解于在60摄氏度或以 上的NMP或N-甲基甲酰胺(NMF)中，并用相对于该磺基十六烷酸为1当量的PyBOP进行活化， 并且还添加相对于该磺基十六烷酸为2当量的二异丙基乙胺(DIPEA)。在临添加活化的磺基 十六烷酸之前，将肽基树脂用热的NMP或NMF洗涤。采用3-4倍过量的磺酸构件并使偶联进行 >16小时。
用于将修饰基团自动化合成至赖氨酸残基上的方法：
为合成修饰基团，使用了以下的构件：Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、Fmoc-Glu- OtBu和二十烷二酸单叔丁酯(CASNo.843666-40-0)。采用DIC和OxymaPure，以相对于树脂 替代物的4-8当量将修饰基团偶联。偶联时间为2-16小时，通常随后为采用1M乙酸酐持续 20min的加帽步骤。如在肽骨架的SPPS中描述的，通过采用在NMP中的25％哌啶处理2x4分 钟，随后洗涤来去除Fmoc-基团。所有其他合成步骤也都与以上针对骨架合成所述的相同。 通过如上所述的手工程序，采用pyBOP作为偶联剂实现16-磺基十六烷酸的偶联。
3.对连接了或没有连接修饰基团的与树脂结合的肽的切割以及纯化
在TFA去保护之前，将肽基树脂用DCM或乙醚洗涤并干燥。通过添加20-40ml (0.25mmol规模)或30-60(0.4mmol规模)ml92％TFA、5％TIPS和3％H2O持续2-4小时来去除 肽和侧链保护基团。然后将TFA过滤，并在一些情况下用氩气流进行浓缩，并且添加乙醚以 使肽沉淀。将肽用乙醚洗涤3-5次并干燥。
检测和表征的通用方法
该部分涉及用于检测和表征所得肽的方法，包括LCMS、MALDI和UPLC方法。
1.LC-MS方法(LCMS1)
使用AgilentTechnologiesLC/MSDTOF(G1969A)质谱仪来确定从Agilent1200 系列HPLC系统洗脱后的肽的分子量。使用Agilents软件计算质量数据的去卷积。
洗脱液：
缓冲液A：在水中的0.1％TFA
缓冲液B：在CH3CN中的0.1％TFA
LC-MSWatersAcquity(LCMS2)
LC-系统：WatersAcquityUPLC
柱子：WatersAcquityUPLCBEH,C-18,1.7μm,2.1mmx50mm
检测器：Waters(Micromass)LCTPremierXE
线性梯度：5％到95％B
梯度运行时间：4.0分钟
总运行时间：7.0分钟
流速：0.4ml/min
柱温：40℃
溶剂A：99.90％MQ-水，0.1％甲酸
溶剂B：99.90％乙腈，0.1％甲酸
2.UPLC方法
UPLC26v01法
缓冲液A：0.05％TFA
缓冲液B：CH3CN+0.05％TFA
流速：0.45ml/min
梯度：5-60％缓冲液B(0.5–4min.)
柱子：AcquityUPLCBEHC181.7um,2.1x50mm
柱温：40℃
UPLC29v01法
缓冲液A：0.05％TFA
缓冲液B：CH3CN+0.05％TFA
流速：0.45ml/min
梯度：15-35％缓冲液B(0.5–4min.)
柱子：AcquityUPLCBEHC181.7um,2.1x50mm
柱温：40℃
UPLC30v01法
缓冲液A：0.05％TFA
缓冲液B：CH3CN+0.05％TFA
流速：0.45ml/min
梯度：20-40％缓冲液B(0.5–4min.)
柱子：AcquityUPLCBEHC181.7um,2.1x50mm
柱温：40℃
UPLC31v01法
缓冲液A：0.05％TFA
缓冲液B：CH3CN+0.05％TFA
流速：0.45ml/min
梯度：25-45％缓冲液B(0.5–4min.)
柱子：AcquityUPLCBEHC181.7um,2.1x50mm
柱温：40℃
UPLC02v01法
系统：WatersAcquityUPLC系统
缓冲液A：在H2O中的0.05％TFA
缓冲液B：CH3CN+0.05％TFA
流速：0.40ml/min
梯度：5-95％缓冲液B(16min.)
柱子：AcquityUPLCBEHC181.7um,2.1x150mm
柱温：40℃
UPLC07v01法
系统：WatersAcquityUPLC系统
缓冲液A：0.09M磷酸氢二铵(水溶液)和10％乙腈，pH3.6
缓冲液B：20％异丙醇、20％水和60％乙腈
流速：0.50ml/min
梯度：35-65％缓冲液B(2-17min.)
柱子：PhenomenexKinetexC18,1.7um,2.1mmx150mm柱
柱温：60℃
UPLC16v01法
系统：WatersAcquityUPLC系统
缓冲液A：0.2M硫酸钠、0.02M磷酸氢二钠、0.02M磷酸二氢钠、90％水和10％乙腈， pH7.2
缓冲液B：70％乙腈，30％水
流速：0.40ml/min
梯度：20-50％缓冲液B(3-20min.)
柱子：ACQUITYUPLCBEHShieldRP18,1.7um,2.1mmx150mm柱
柱温：60℃
UPLC17v01法
系统：WatersAcquityUPLC系统
缓冲液A：0.2M硫酸钠、0.02M磷酸氢二钠、0.02M磷酸二氢钠、90％水和10％乙腈， pH7.2
缓冲液B：70％乙腈，30％水
流速：0.40ml/min
阶梯梯度：10-20％B历时3分钟，然后20-80％B历时17分钟，然后80-90％B历时1分 钟
柱子：ACQUITYUPLCBEHShieldRP18,1.7um,2.1mmx150mm柱
柱温：60℃
UPLC-AP-01法
缓冲液A：在H2O中的0.1％TFA
缓冲液B：CH3CN+0.1％TFA
流速：0.40ml/min
梯度：5-95％缓冲液B(16min.)
柱子：AcquityUPLCBEH130；150x2.1；1.7um
柱温：40℃
UPLC-AP-02法
缓冲液A：在90％水/10％乙腈中的20mMNa2HPO4、20mMNaH2PO4、200mMNa2SO4，pH 7.20
缓冲液B：70％乙腈/30％水
流速：0.40ml/min
梯度：10-20％缓冲液B(0-3min.)；20-50％缓冲液B(3-20min)；50-80％(20- 21min)
柱子：AcquityUPLCBEHShield,RP181.7um,2.1x150mm
柱温：40℃
3.MALDI-MS方法
使用记录在Microflex(Bruker)上的基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDI- MS)来确定肽的分子量。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质。采用由制造商提供的软件，基于 MALDI-MS分析的结果计算产物的分子量。
中间体的合成
16-磺基-十六烷酸的合成
将16-十六内酯(997g，3.92mol)溶解于甲醇(15.1L)中，并添加甲苯-4-磺酸一水 合物(90.0g，0.473mol)。将反应混合物在55℃下在50L反应器中加热16小时。冷却后，添加 碳酸氢钠(56.0g，0.67mol)，并将反应混合物搅拌15min。在Heidolph20L旋转蒸发仪上蒸 发溶剂。添加乙酸乙酯(12L)，并将混合物用5％的碳酸氢钠溶液(10L)萃取。将有机层分离； 将乳液层用乙酸乙酯(3x3L)萃取，分离白色不溶性泥状物质，并将乙酸乙酯层用5％的碳 酸氢钠溶液(5L)再次洗涤。将有机层合并，并用饱和的碳酸氢钠溶液(5L)和盐水(10L)洗 涤。在Heidolph20L旋转蒸发仪上蒸发溶剂。使粗产物从己烷(8L)中结晶。倒出在己烷中的 热溶液，随后使其在冰浴中结晶。将该物质在大烧结滤器(frit)上过滤并用冷己烷(2L)洗 涤。将纯物质真空干燥。
产量：1062.2g(95％)。RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇95:5)：0.65。
1HNMR谱(300MHz,CDCl3,δH)：3.67(s,3H)；3.67-3.60(m,2H)；2.30(t,J＝7.5Hz, 2H)；1.67-1.53(m,4H)；1.25(s,22H)。
将上述酯(957g，3.34mol)在Heidolph20L旋转蒸发仪上溶解于二氯甲烷(7L)中。 添加三乙胺(695mL，4.98mol)，将反应混合物冷却至0℃(通过将冰放入蒸发仪浴中)，并采 用微小真空通过外部管线在10分钟内缓慢添加在二氯甲烷(200mL)中的甲磺酰氯(325mL， 4.19mol)。然后将反应混合物加热至35℃持续1小时。NMR分析显示完全转化。添加水 (690mL)并蒸发溶剂。添加乙酸乙酯(8L)，并将混合物用1M盐酸(4L)和5％的碳酸钠溶液 (4L)洗涤。由于碳酸钠萃取物形成乳液，因此将该层用乙酸乙酯(4L)萃取并添加至主要部 分。将合并的乙酸乙酯层用盐水(4L)洗涤，经无水硫酸钠干燥并过滤。蒸发溶剂，得到呈白 色固体的16-甲磺酰基氧基-十六烷酸甲酯。
产量：1225.4g(100％)。
1HNMR谱(300MHz,CDCl3,δH)：4.22(t,J＝6.6Hz,2H)；3.66(s,3H)；3.00(s,3H)； 2.30(t,J＝7.5Hz,2H)1.82-1.67(m,2H)；1.68-1.54(m,2H)；1.36-1.17(m,22H)。
将上述甲磺酸酯(1.23kg，3.34mol)溶解于丙酮(8L)中，并添加溴化锂(585g， 6.73mol)，并将反应混合物在50℃下在Heidolph20L旋转蒸发仪上加热12小时。冷却后，蒸 发溶剂，添加乙酸乙酯(10L)，并将混合物用5％的碳酸氢钠溶液(3x15L)和盐水(8L)洗涤。 将溶剂蒸发至干，以产生呈浅黄色油的开始结晶的16-溴-十六烷酸甲酯。
产量：1219g(105％)；含有丙酮和丙酮缩醛反应的产物。
RF(SiO2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.90。
1HNMR谱(300MHz,CDCl3,δH)：3.65(s,3H)；3.42(t,J＝6.9Hz,2H)；2.32(t,J＝ 7.5Hz,2H)；1.92-1.77(m,2H)1.69-1.53(m,2H)；1.50-1.35(m,2H)；1.25(bs,10H)。
将亚硫酸钠(327g，2.60mol)的水(1.26L)溶液和16-溴-十六烷酸甲酯(728g， 2.00mol，96％纯度)在1-丙醇(945mL)和甲醇(420mL)中的溶液在装备有机械搅拌器的6L反 应器中加热至回流48小时。将反应混合物冷却至27℃并用四氢呋喃(2L)稀释。将反应混合 物过滤并将固体物质用四氢呋喃(3x700mL)洗涤。将滤液冷却至0℃并使物质的另一部分 沉淀。将该沉淀物过滤并用四氢呋喃(2x200mL)洗涤。将固体合并，并与水(8.4L)在20L的 锅中混合。添加氢氧化钠(120g，3.00mol)的溶液。将混合物加热至沸腾，持续约5小时。将硫 酸(430mL，8.00mol)的水(500mL)溶液缓慢添加至反应混合物中(形成二氧化硫)。将反应混 合物加热至沸腾，持续10min，随后使其冷却至15℃(冰浴)。将混合物在施加真空的布氏漏 斗上通过滤纸Seitz(若干层滤纸)过滤。该程序非常缓慢，花费了两天。将固体物质用蒸馏 水洗涤若干次，直到滤液的pH在2到3之间。该程序花费了约三天。将泥状白色物质在80℃烘 箱中干燥，得到期望的产物。
产量：510g(76％)。
1HNMR谱(300MHz,DMSO-d6,δH)：2.45-2.33(m,2H)；2.18(t,J＝7.3Hz,2H)；1.60- 1.40(m,4H)；1.24(s,22H)。
MS-ESI(负，在H2O/MeCN+NaHCO3中的样品；m/z)：335.5(M-H)-,357.5(M-2H+Na)-, 167.3(M-2H)2-
本发明化合物的合成
实施例1：
SEQIDNO:1
hPYY(1-36)
YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2
实施例2：
SEQIDNO:2
hPYY(3-36)
IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2
停留时间HPLC方法UPLC16v01：3.37min(91.4％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：10.07min(85.6％)
MW计算值：4049.6g/mol
MALDIMS：4048.2g/mol
实施例3：
SEQIDNO:3
[L-β-精氨酸35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：9.35min(79.4％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.3min(82.3％)
MW计算值：4049.55g/mol
MALDI(MALDSI-MS实测值)：4048.3g/mol
实施例4：
SEQIDNO:4
[L-β-二高精氨酸35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：9.53min(83.4％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.33min(88.9％)
MW计算值：4077.61g/mol
MALDI(MALDSI-MS实测值)：4076.1g/mol
实施例5：
SEQIDNO:5
[D-β-高精氨酸35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：9.47min(82.8％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.31min(88％)
MW计算值：4063.58g/mol
MALDI(MALDSI-MS实测值)：4062.8g/mol
实施例6：
SEQIDNO:6
[β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：9.47min(92.9％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.4min(97.3％)
Mw计算值：4063.58g/mol
MALDI(MALDSI-MS实测值)：4060.5g/mol
实施例7：
SEQIDNO:7
[Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：10.25min(84.4％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.39min(93.9％)
MW计算值：4136.63g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1379.7((M/3)+3)；1035.0((M/4)+4)；690.4((M/6+6)
实施例8：
SEQIDNO:8
[Gln18，β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：9.70min(94.1％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.37min(96.5％)
MW计算值：4077.61g/mol
MALDI(MALDSI-MS实测值)：4076.2g/mol
实施例9：
SEQIDNO:9
[Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：5.92min(95.1％)
停留时间UPLC-AP-02：10.23min(90.6％)
MW计算值：4150.66g/mol
LCMS2：((M/3+3)1384.3；((M/4)+4)1038.5；((M/5+5)831.1
实施例10：
SEQIDNO:10
[Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：5.38min(97.3％)
停留时间UPLC-AP-02：8.29min(95.7％)
MW计算值：4035.53g/mol
LCMS2：((M/3+3)1346.0；((M/4)+4)1009.3；((M/5+5)808.4
实施例11：
SEQIDNO:11
[Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：11.01min(94.4％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.19min(100％)
MW计算值：4049.55g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1350.7((M/3)+3)；1013.3((M/4)+4)
实施例12：
SEQIDNO:12
[Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：8.6min(81.3％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.11min(98.7％)
MW计算值：4035.53g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1346((M/3)+3)；1009.8((M/4)+4)；673.5((M/6+6)
实施例13：
SEQIDNO:13
[Aib24,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：9.05min(84.4％)
停留时间HPLC方法UPLC29v01：3.19min(100％)
MW计算值：4108.58g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1370.4((M/3)+3)；1028.0((M/4)+4)
实施例14：
SEQIDNO:14
[Arg4,Gln18,Aib24,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：5.61min(99.3％)
停留时间UPLC-AP-02：10.0min(97.2％)
MW计算值：4077.57g/mol
LCMS2：((M/3+3)1360.1；((M/4)+4)1020.5；((M/5+5)816.3
实施例15：
SEQIDNO:15
[Arg4,Gln18,Ala24,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：5.4min(98％)
停留时间UPLC-AP-02：9.14min(95.1％)
MW计算值：4063.54g/mol
LCMS2：((M/3+3)1355.8；((M/4)+4)1016.9；((M/5+5)814.4
实施例16:
SEQIDNO:16
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基-氨基)丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,β-homoArg35] hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：7.34min(96.7％)
停留时间UPLC-AP-02：12.37min(91.4％)
MW计算值：4836.57g/mol
LCMS2：((M/3+3)1613.0；((M/4)+4)1209.3；((M/5+5)968.1
实施例17：
SEQIDNO:17
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,β- homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.21min(97.9％)
停留时间HPLC方法UPLC30v01：3.72min(98.2％)
MW计算值：4850.59g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1617.9((M/3)+3)；1213.7((M/4)+4)；809.5((M/6+6)
实施例18：
SEQIDNO:18
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧 基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,β- homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：11.63min(96.2％)
停留时间HPLC方法UPLC30v01：3.788min(95.9％)
MW计算值：5140.91g/mol
MALDI(MALDI-MS实测值)：5139.1g/mol
实施例19：
SEQIDNO:19
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十 七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧 基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：11.45min(95.1％)
停留时间HPLC方法UPLC02v01：7.26min(100％)
MW计算值：5052.76g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：2527.3((M/2)+2)；1685.23((M/3)+3)；1264.18((M/4)+4)
实施例20：
SEQIDNO:20
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Trp30, β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.25min(96.0％)
停留时间HPLC方法UPLC02v01：7.34min(99.1％)
MW计算值：4923.65g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：2462.78((M/2)+2)；1642.21((M/3)+3)；1231.92((M/4)+4)
实施例21：
SEQIDNO:21
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Aib22, β-homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.37min(91.5％)
停留时间HPLC方法UPLC30v01：3.88min(93％)
MW计算值：4864.62g/mol
MALDI(MALDI-MS实测值)：4863.1g/mol
实施例22：
SEQIDNO:22
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Arg4,Lys7,β- homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：7.31min(98.8％)
停留时间UPLC-AP-02：11.8min(94.1％)
MW计算值：4864.58g/mol
LCMS2：((M/3+3)1622.7；((M/4)+4)1216.8；((M/5+5)973.9
实施例23：
SEQIDNO:23
7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Arg4,Lys7,Gln18,β- homoArg35]hPYY(3-36)
停留时间UPLC-AP-01：7.31min(95.3％)
停留时间UPLC-AP-02：11.9min
MW计算值：4878.61g/mol
LCMS2：((M/3+3)1626.4；((M/4)+4)1220.2；((M/5+5)976.4
实施例24：
SEQIDNO:24
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4- [[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]丁酰基]-氨基]乙氧基]-乙氧 基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：11.03min(98.9％)
停留时间HPLC方法UPLC02v01：7.5min(100％)
MW计算值：4950.67g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z1653.23((M/3)+3)；1238.6((M/4)+4)
实施例25：
SEQIDNO:25
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17- 羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰 基]-[,Lys7,Gln18,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.18min(97.7％)
停留时间HPLC方法UPLC02v01：7.58min(99.3％)
MW计算值：4821.55g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z2411.79((M/2)+2)；1607.89((M/3)+3)；1206.43((M/4)+4)
实施例26：
SEQIDNO:26
4-N{α}(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧 基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]-乙氧基]乙酰 基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.56min(98.5％)
停留时间HPLC方法UPLC31v01：3.37min(98.8％)
MW计算值：4894.61g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1632.49((M/3)+3)；1224.35((M/4)+4)；979.67((M/5)+5)
实施例27：
SEQIDNO:27
4-N{α}(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4- [[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]-乙氧基]乙氧 基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.21min(83.11％)
停留时间HPLC方法UPLC30v01：3.44min(90.5％)
MW计算值：5045.75g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1682.85((M/3)+3)；1262.37((M/4)+4)；1010.09((M/5)+5)
实施例28：
SEQIDNO:28
4-N{α}(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺 基十六碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]-乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]-乙酰 基]-[Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：11.23min(88.1％)
停留时间HPLC方法UPLC30v01：3.35min(91.7％)
MW计算值：4916.63g/mol
MALDI(MALDI-MS实测值)：4914.5g/mol
实施例29：
SEQIDNO:29
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17- 羧基十七碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙氧基]乙氧基]乙酰 基]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：12.65min(94.8％)
停留时间HPLC方法UPLC32v01：2.5min(96.6％)
MW计算值：4922.62g/mol
LCMS(LCMS1)：m/z：1641.48((M/3)+3)；985.46((M/5)+5)
实施例30：
SEQIDNO:30
4-N{α}-(3-甲基丁酰基)-7-N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16- 磺基十六碳酰基氨基)-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]-[Arg4,Lys7,Gln18,Trp30,β-homoArg35]hPYY(4-36)
停留时间HPLC方法UPLC16v01：11.36min(83.4％)
停留时间HPLC方法UPLC30v01：3.37min(93.0％)
MW计算值：4944.64g/mol
MALDI(MALDI-MS实测值)：4944.3g/mol
药理学方法
本发明的PYY肽衍生物或其类似物作为药物活性剂在减少增重和治疗哺乳动物 (如人类)的肥胖症方面以及在治疗糖尿病方面的效用可通过在常规试验和在下文描述的 体外及体内试验中的激动剂的活性来证明。
这样的试验还提供了可将本发明的PYY化合物的活性与已知化合物的活性相比较 的方法。
实施例31：PYY化合物的受体效力
本实施例的目的在于体外测试PYY化合物的活性或效力。在全细胞试验中，体外效 力分别是人Y1、Y2、Y4和Y5受体亚型的活化的量度。
采用如下描述的Actone功能效力试验来确定实施例2-30的PYY化合物的效力。 hPYY(3-36)(实施例2，SEQIDNO:2)作为参照包括在内。实施例3-5的化合物作为比较例包 括在内。
Actone功能效力试验
神经肽Y(NPY)受体是Gi-偶联的七跨膜受体，其主要通过抑制腺苷酸环化酶活性 (导致由ATP产生的cAMP减少)经由cAMP依赖性途径发信号。Actone试验基于改进的钙通道， 该通道具有对cAMP的选择性结合，从而导致细胞钙流入，该细胞钙流入通过钙反应性染料 来检测。为了测量由NPY受体活化导致的降低的cAMP水平，添加β1/β2-肾上腺素能受体激动 剂异丙肾上腺素来激活腺苷酸环化酶并提高细胞中的cAMP水平。反映由NPY受体活化导致 的cAMP水平降低的细胞钙浓度降低作为来自该钙敏感性染料的荧光的减少进行检测。
将表达cAMP敏感性钙通道，以及NPYR-Y1、NPYR-Y2、NPYR-Y4或NPYR-Y5中的一种的 HEK-293细胞(CodexBiosolution,Gaithersburg,MD,USA)以14,000个细胞/孔的密度接种 到用聚赖氨酸包被的384孔板中体积为25μl的DMEM培养基中，该DMEM培养基含有10％胎牛 血清(FCS)、1％青霉素-链霉素、250μg/ml氨基糖苷抗生素G418和1μg/ml氨基核苷抗生素嘌 呤霉素。将细胞在+37℃下在5％CO2、加湿环境中温育过夜，随后添加25μl钙染料缓冲液，该 钙染料缓冲液含有：溶解于100ml缓冲液中的1小瓶Calcium5染料(MolecularDevices, Sunnyvale,CA,USA)，该缓冲液含有20mMHepes、0.1％卵白蛋白、0.005％吐温20、1.5mM丙 磺舒、250μMPDE-抑制剂4-(3-丁氧基-4-甲氧基苄基)咪唑烷-2-酮和8mMCaCl2，并将pH调 节至7.40。将细胞与钙染料缓冲液一起温育1小时，随后放置在其中液体处理系统同时添加 了类似物(1000-1nM最终浓度)和异丙肾上腺素(0.05μM最终浓度)的FLIPRTetra系统 (MolecularDevices)中，随后紧接着是以30秒间隔持续360秒的荧光信号测量(Ex540/ Em590)。所有测量均一式两份进行，并且通过采用GraphPadPrismv5.02(GraphPad软 件,LaJolla,CA,USA)对S形剂量响应曲线的非线性回归分析来计算EC50值。EC50值在以下 表1中示出。
表1.体外效力
本发明的PYY化合物均显示出优良的Y2效力，而对受体Y1、Y4和Y5的效力大大降 低。
实施例32：Y1、Y2、Y4和Y5受体亚型结合
本实施例的目的在于测试PYY化合物分别与Y1、Y2、Y4和Y5受体亚型的体外结合。 受体结合亲和力是化合物分别对人Y1、Y2、Y4和Y5受体亚型的亲和力的量度。
实施例6-30的PYY化合物的体外结合在如下所述的闪烁迫近分析(SPA)中确定。 hPYY(3-36)(实施例2，SEQIDNO:2)作为参考包括在内。
闪烁迫近分析(SPA)
表达NPY受体的细胞系。所有细胞在+37℃下在具有5％CO2的加湿气氛下培养。可 诱导表达人NPY-Y1受体的BHK-482-8细胞(P25929,NPY1R_HUMAN,Uniprot)在含10％胎牛血 清(FBS)、1％青霉素-链霉素(P/S)、1mg/mlG418抗生素、1mg/ml潮霉素B抗生素和1％非必 需氨基酸的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。在收获细胞之前24小时添加1mM异丙 基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导NPY-Y1受体表达。稳定表达人NPY-Y2受体的CHO- K1细胞(P49146,NPY2R_HUMAN,Uniprot)在含10％FBS、1％P/S、150μg/ml潮霉素B和10μg/ml 嘌呤霉素抗生素的DMEMF-12中培养。稳定表达人NPY-Y4受体的CHO-K1细胞(P50391, NPY4R_HUMAN,Uniprot)在含10％FBS、1％P/S、10μg/ml嘌呤霉素的DMEMF-12中培养。稳定 表达人NPY-Y5受体的HEK-293细胞(Q15761,NPY5R_HUMAN,Uniprot)在含10％FBS、1％青霉 素-链霉素、250μg/mlG418和1μg/ml嘌呤霉素的DMEMF-12培养基中培养。
膜制备。将培养的细胞通过刮擦机械地分离，并在冰冷的PBS(137mMNaCl、2.7mM KCl、4.3mMNa2HPO4、1.47mMKH2PO4，pH调节至7.4)中洗涤并转移至管中，并在+4℃下以 1000g离心5min。将沉淀物重悬于冰冷的匀浆化缓冲液中；Y1：20mMHepes、10mMEDTA，具有 2片完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片/50ml(Roche,Mannheim,Germany)，pH7.4；Y2、 Y4：20mMHepes、5mMMgCl2、1mg/mlBacitracin，pH7.1；Y5：10mMNaCl、20mMHepes、 0.22mMKH2PO4、1.26mMCaCl2、0.81mMMgSO4，pH7.4，随后采用组织匀浆器在中速下匀浆 化30秒。采用超速离心机将匀浆在+4℃下以35000g离心10分钟，弃去上清液，并添加新鲜的 匀浆化缓冲液。沉淀物的匀浆化总共重复三次。将最终的沉淀物重悬于数毫升的匀浆化缓 冲液中，并采用Bradford法确定蛋白质浓度，并在酶标仪中在595nm处进行测量。将蛋白质 浓度调节至1mg/ml并转移至冷冻管(cryotube)中，并在-80℃下储存。在冷冻前向Y5膜中添 加250mM蔗糖。
分析。在白色96孔板中以每孔200μl的总体积进行人NPY-Y受体SPA结合分析。将含 有闪烁液(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)的涂覆有麦胚凝集素的珠子在结合缓冲液—— Y1、Y2：50mMHepes、1mMCaCl2、5mMMgCl2、0.02％吐温20、0.25％卵白蛋白，pH7.4；Y4、Y5： 20mMHepes、10mMNaCl、0.22mMKH2PO4、1.26mMCaCl2、0.81mMMgSO4、0.1％杆菌肽和 0.25％卵白蛋白，pH7.4——中重建，并与膜制剂混合，以得到1mg珠子和3μgY1膜/孔、3μg Y2膜/孔、1μgY4膜/孔或20μgY5膜/孔的最终浓度。添加每孔50000cpm的放射性配体人 [125I]-PYY，这对应于在Y1、Y2和Y5结合分析中的100pM的浓度。在Y4结合分析中使用对应于 100pM浓度的每孔50000cpm的放射性配体人[125I]-胰多肽(PP)。
将冷冻干燥的类似物溶于80％二甲基亚砜(DMSO)、19％H2O和1％乙酸(CH3COOH) 中，以产生2000μM(Y1、Y4和Y5)和200μM(Y2)的储备溶液，并在结合缓冲液中进行系列稀释 (1:10)，直到最终浓度在Y1、Y4和Y5分析中为10000nM到1pM而在Y2分析中为1000nM到 0.1pM。将板密封并在设置为400rpm的平板摇床上在+25℃下温育2小时，之后在微板闪烁发 光计数器上读取发光之前将板在1500rpm下离心10分钟。在读取前，将Y1SPA板在室温下静 置16小时。放射性配体的置换作为发光的减少来测量，并且通过对S形剂量-响应曲线的非 线性回归分析来计算IC50值。通过Cheng-Prusoff等式(Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)获得结合亲和 力的Ki值，该等式包括受体特异性Kd值(Y1＝0.556；Y2＝0.275；Y4＝0.111；Y5＝0.345)、放 射性配体浓度和IC50值。
本发明的PYY化合物均显示出优良的Y2结合，但对受体Y1、Y4和Y5的结合亲和力大 大降低。
表2：Y受体结合亲和力
实施例33：在小型猪中的药代动力学研究
本研究的目的在于确定PYY化合物在向小型猪静脉内施用后的体内半衰期，即，其 在体内的时间的延长，由此其作用时间的延长。这在药代动力学(PK)研究中完成，在该研究 中确定所讨论的衍生物的终末半衰期。所谓终末半衰期通常指在初始分布期之后测量的， 使某个血浆浓度减半所需要的时间。
在小型猪中静脉内施用后的药代动力学评价的体内研究。动物。购自EllegaardMinipigs,Denmark的15-25kg的雌性小型猪。将动物安置在AnimalUnit,NovoNordiskA/S中，并根据正常程序在AnimalUnit中进行饲养和处理。
在最少2周的适应后，将两个永久的中心静脉导管植入了每只动物的尾腔静脉。手 术后，在药代动力学实验期间动物均在其正常的单独栏圈中。
体重。每周对动物称重。在给药前使动物在早上禁食，但可自由饮水；在给药期间 供应食物。
肽的施用和给药方案。通过中心短导管给予静脉内注射液，在施用后用最少10ml 的无菌盐水冲洗该导管。测试物质在0.05ml/kg体积中以15nmol/kg给药，n＝3。缓冲液： 50mM磷酸钠、70mM氯化钠、0.05％吐温80，pH7.4，或20mMHEPES、2.2％甘油、0.05％聚山梨 酯80，pH6.5。
血液样品和分析。根据以下时间表通过中心导管取得了血液样品：给药前，5、15、 30、45min，1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、192h、216h、240h、 264h和288h。在第1天，将导管联接至延伸管，该延伸管将在第1天结束时除去。通过该导管 取得样品(0.8ml)。将血液收集在含有EDTA缓冲液(8mM)和50μlVal-Pyr缓冲液(添加含有 溶解于50ml抑肽酶(Trasylol)中的3.097gK3EDTA和0.5ml20mMVal-Pyr的稳定化缓冲 液。将pH调节至7.4)的试管中。在取得每个血液样品后，用最少5ml的无菌0.9％NaCl和 10IE/ml肝素冲洗导管。要求使用无菌技术以避免导管中细菌生长，细菌生长会增加在导管 中形成凝块的风险。将样品保持在湿冰上直到离心(10min，4℃，1942g)。之后，将血浆(最少 200μl)立即转移到Micronic管中并保持在-20℃下直到分析。通过如下所述的LC/MS对血浆 样品进行了分析。
数据和结果。使用Phoenix(PharsightInc.,MountainView,CA,USA)，通过非房 室药代动力学分析对血浆浓度-时间曲线进行了分析。采用来自每只动物的单独的浓度-时 间值进行计算。
样品分析
血浆样品的定量测定。通过与带有后续质谱检测的液相色谱法耦合的湍流色谱法 (TFC/LC/MS)对血浆中的测试物质进行了测定。该方法的选择性使得不同化合物能在一个 样品中定量，例如，每只动物四种化合物的盒式给药(cassettedosing)。采用作为量的函 数的峰面积计算测试物质在未知样品中的浓度。通过回归分析构建基于掺有分析物的血浆 样品的校准图。该测定的典型动态范围为1-2,000nmol/l。通过在三个浓度水平下一式两份 共同测定质量控制(QC)样品来确保该方法的性能。分析物的储备溶液和工作溶液在血浆中 制备并在37℃温育1小时。
样品制备。向40.0μlEDTA-血浆中添加160μl50％甲醇、1％甲酸，然后涡旋并在4 ℃下以14300rpm(16457g)离心20分钟。将上清液转移至96孔板(该板已经在37℃下与0.4％ BSA预温育了半小时)。注射体积为25μl。
为净化样品，使用来自ThermoScientific,Franklin,MA,USA的TurboFlow Cyclone柱(0.5x50mm)，并在来自Phenomenex,Torrance,CA,USA的OnyxC18柱(2.0x 50mm)上进行LC分离。洗脱液为甲醇、乙腈、Milli-Q水和甲酸的等度和梯度组合。通过以正 模式电离运行的质谱法进行了选择性检测。
数据处理。使用Phoenix(PharsightInc.,MountainView,CA,USA)，通过非房室 药代动力学分析对血浆浓度-时间曲线进行了分析。采用来自每只动物的单独的浓度-时间 值进行计算。
表3：半衰期(t1/2)
相比于hPYY(3-36)和未衍生化的hPYY(3-36)类似物的半衰期，测试的本发明PYY 衍生物具有非常长的半衰期。
实施例34：在db/db小鼠中的药效学研究
为了确定PYY化合物对db/db小鼠的血糖和食物摄取的体内影响，将该化合物给药 至db/db小鼠，并如下所述测量对血糖和食物摄取的影响。
将雄性db/db小鼠安置在正常的昼夜节律下(下午6点到上午6点的暗周期)，并提供自由获取的Altromin饮食。在11-13周龄时，针对血糖以及体重对小鼠进行匹配，并将小鼠分成各9只小鼠的匹配组，且每个笼子容纳3只。在下午4点(时间＝0)对小鼠皮下给予指定剂量、体积为2.5ml/kg的指定化合物或载体(50mMNa2HPO4，pH7.4，70mMNaCl，0.05％吐温80)，并且在一些实验中，在时间＝23小时时给予第二次注射。在注射后指定的时间点，例如，在注射后4h、16h、23h和40h测量血糖和食物摄取。从尾静脉取得用于血糖测量的血液样品，将样品放入5μl肝素涂覆的毛细管中，将该毛细管放置在具有体系溶液(250μl)的eppendorf管中。立即在仪器上分析样品。
血糖(BG)测量值报告为相对于治疗前载体校正的％BG的平均值±SEM，并如下计 算：
100-[％BG(载体，平均值)-％BG]，其中，
％BG＝100*[BG(时间＝t)/BG(治疗前)]
且％BG(载体，平均值)＝相对于处理前的载体，在时间＝t时载体组的％BG值的平 均值。
食物摄取报告为每个笼子的食物摄取平均值±SEM，其为对于指定的时间间隔，每 个笼子的食物摄取与载体组的平均食物摄取相比的百分比。
表4：在db/db小鼠中对血糖的影响
表5：在db/db小鼠中对食物摄取的影响
这些数据强有力地支持了本发明的PYY化合物的血糖降低效果和对食物摄取的抑 制。
虽然本文中已阐明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会 想到许多修改、替换、变化和等同变换。因此，应理解，所附权利要求书旨在涵盖所有这些落 入本发明的真实范围内的修改和变化。