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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310732988.6 (22)申请日 2013.12.27 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (73)专利权人 集美大学 地址 361021 福建省厦门市集美区银江路 185 号 (72)发明人 刘静雯 徐苗苗 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 ( 普通合伙 ) 35200 代理人 马应森 CN 101760531 A,2010.06.30, CN 102274494 A,2011.12.14, 秦强等 .CPA- 核酸试纸条快速检测霍乱。
2、弧菌 方法的建立与优化 .生物技术通报 .2013,( 第 7 期 ), 第 167-171 页 . P. Prompamorn et al.The development of loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for detection of Vibrio parahaemolyticus. Letters in Applied Microbiology .2011, 第 52 卷 ( 第 4 期 ), 第 344351 页 . (54) 发明名称 副溶血性弧菌的检测方法 (。
3、57) 摘要 副溶血性弧菌的检测方法， 涉及副溶血性弧 菌。用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据 副溶血性弧菌种特异性基因 tlh 的保守区域所设 计的一对外围引物、 一对交叉引物和一对特异性 检测探针 ； 副溶血性弧菌种特异性基因 tlh 是编 码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素 TLH 的毒力基 因。检测方法 ： 副溶血性弧菌模板 DNA 的提取 ； 外 围引物的验证 ； 交叉引物恒温扩增反应体系的建 立 ； 交叉引物恒温扩增程序 ； 扩增产物的检测。灵 敏度高， 是普通 PCR 的 10 倍 ； 特异性强， 只检出 副溶血性弧菌， 对其他致病菌检测结果均为阴性 ； 快速检测， 检测时间缩短到。
4、 1.5h， 明显提高检测 效率 ； 简便实用， 扩增产物通过一次性试纸条进 行检测， 10 30min 即可完成。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 蔡放 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图1页 CN 103667498 B 2016.03.30 CN 103667498 B 1/1 页 2 1.副溶血性弧菌的检测方法， 所述方法用于对近海岸的海水、 海底沉积物、 海产品及腌 制食品的检测， 不用于对有生命的人体和动物体的疾病诊断， 其特征在于所述检测方法采 用用于副溶血性弧菌检测的特异性引物， 所述用于副溶血。
5、性弧菌检测的特异性引物是根据 副溶血性弧菌种特异性基因 tlh 的保守区域所设计的一对外围引物、 一对交叉引物和一对 特异性检测探针 ； 所述副溶血性弧菌种特异性基因 tlh 是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒 素 TLH 的毒力基因， 广泛存在副溶血性弧菌中， 且具有种特异性 ； 所述一对外围引物为 ： 正向外围引物 VPOF ： TGCGAAAGTGCTTGAGAT ； 反向外围引物 VPOR ： GATGAGCGGTTGATGTCC ； 所述一对交叉引物为 ： 正向交叉引物 VPIF ： TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ； 反向交叉引物 VPIR ：。
6、 GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG ； 所述一对特异性检测探针为 ： 正向特异性检测探针 VPDF ： CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA， 3 端标记异硫氰酸荧光素 ； 反向特异性检测探针 VPDR ： GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC， 5 端标记生物素 ； 所述检测方法， 包括以下步骤 ： 1) 副溶血性弧菌模板 DNA 的提取 利用 CTAB/NaCl 法或细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取副溶血性弧菌的总 DNA 作为模 板 ； 2) 外围引物的验证 用一对外围引物 VPOF/VPOR 对模板进行扩增， 扩增后的产。
7、物进行质粒克隆得到所需的 质粒， 通过对质粒进行测序证明 ： 外围引物扩增的片段即为副溶血性弧菌 tlh 的保守区域 核酸序列， 说明该外围引物合适， 可用于后续交叉引物恒温扩增法实验 ； 3) 交叉引物恒温扩增反应体系的建立 20L 的恒温反应体系包括 ： 外围引物 0.1mol/L、 交叉引物 0.4mol/L、 特异性检测 探针 0.3mol/L， dNTPs 0.4mol/L， MgSO4 6mmol/L， 10Thermopol buffer 2L， Bst DNA 聚合酶 8U/L， 甜菜碱 0.5mol/L， DNA 1L ； 4) 交叉引物恒温扩增程序 将待反应 PCR 管放置。
8、于微量恒温器中 63恒温扩增 60min， 得到扩增产物 ； 5) 扩增产物的检测 扩增产物通过商品化的一次性核酸检测试纸条 3 号进行判读， 通过观察试纸条检测线 和质控线的颜色变化来判断反应是否发生 ； 若结果为阳性， 则样本中含有检测的核酸， 试纸 条出现两条红色条带， 一条位于质控区， 一条位于检测区 ； 若结果是阴性， 则只有质控区出 现一条红色条带， 检测区没有条带。 权 利 要 求 书 CN 103667498 B 2 1/4 页 3 副溶血性弧菌的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及副溶血性弧菌， 尤其是涉及一种副溶血性弧菌的检测方法。 背景技术 0002 副溶血性弧菌又称。
9、嗜盐菌， 隶属弧菌科的弧菌属， 是一种革兰氏阴性人畜共患菌， 广泛分布在近海岸的海水、 海底沉积物、 海产品及腌制食品中。由该菌引起的食物中毒临 床症状多为急性肠炎， 表现为腹痛、 腹泻、 呕吐， 其潜伏期一般为 8 20h， 平均为 12h， 正常 2 3 天即可痊愈， 愈后良好， 少数严重患者可因抢救不及时而死亡。副溶血性弧菌食物中 毒与进食含有该菌的食物有关， 生食或食入未煮熟的受到污染的海产品或腌制食品是其主 要传播途径。已知的重要的传染源有螃蟹、 虾、 扇贝、 牡蛎、 蛤类、 海蜇、 墨鱼、 咸菜、 腌肉等。 副溶血性弧菌的最适生长温度为 37， 因此夏秋季成为副溶血性弧菌食物中毒的。
10、高发期， 8 月为高峰期。近年来由该菌引起的食物中毒事件已跃居我国食物中毒之首， 快速简便的检 测方法的建立是预防副溶血性弧菌食物中毒的有效途径。 0003 已建立的副溶血性弧菌的检测方法有传统方法 ： 增菌培养法、 最大可能计数法 ； 免疫学方法 ： 酶联免疫吸附法、 芯片法、 胶体金、 免疫传感器、 免疫磁珠法 ； 分子生物学方 法 ： 常规 PCR、 多重 PCR、 荧光定量 PCR、 纳米 PCR、 EMA-PCR 法、 核酸探针、 LAMP 法等 (1 王国 玲， 栾玉明， 刘达雄， 陆家海 . 副溶血性弧菌检测方法的研究进展 J. 中国卫生检验杂志， 2010,20(6):1574。
11、-1576)。 0004 交叉引物恒温扩增技术 (CPA) 是一种新颖的恒温扩增技术， 具有较高的特异 性和灵敏度， 因该方法在恒温下就能发生反应， 所以对设备的要求比较低， 操作简单， 反 应 只 需 60min(2Fang RD,Li X,Hu L,et al.Cross-priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimensJ.Journal of C linical Microbiology,2009,47(3):847-847 ； 3Xu GL,Hu L,Z。
12、hong HY,et al.Cross priming amplification ： mechanism and optimization for isothermal DNA amplificationJ.Scientific Reports,2012,2:246.doi ： 10.1038/srep00246)。 较 传 统的 PCR 技术具有高效、 快速等优点， 尤其适用在基层对副溶血性弧菌进行检测。目前 该方法结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、 肠出血性大肠杆菌、 结核分歧杆菌、 恶性疟疾、 霍乱弧菌、 志贺氏菌、 瓜果类斑病菌的检测 (4 祁军， 左峰， 刘 国红。
13、， 刘红梅， 徐高连， 张霞 . 交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌 J. 食品研究开发， 2013,34(2):67-70 ； 5 祁军， 于智睿， 詹曦菁， 黄吉城， 李智慧 . 交叉引物等温扩增技术在 恶性疟疾快速检测中的应用 J. 中国媒介生物学及控制杂志， 2013,24(3):204-207)， 尚 未有用于检测副溶血性弧菌的报道。 发明内容 0005 本发明的第一目的是提供用于副溶血性弧菌检测的特异性引物。 0006 本发明的第二目的是提供副溶血性弧菌的检测方法。 说 明 书 CN 103667498 B 3 2/4 页 4 0007 所述用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶。
14、血性弧菌种特异性基因 tlh 的保守区域所设计的一对外围引物、 一对交叉引物和一对特异性检测探针 ； 所述副溶血性 弧菌种特异性基因 tlh 是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素 TLH 的毒力基因， 广泛存在副 溶血性弧菌中， 且具有种特异性 ； 0008 所述一对外围引物为 ： 0009 正向外围引物 VPOF ： TGCGAAAGTGCTTGAGAT ； 0010 反向外围引物 VPOR ： GATGAGCGGTTGATGTCC。 0011 所述一对交叉引物为 ： 0012 正向交叉引物 VPIF ： TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ； 0013 反。
15、向交叉引物 VPIR ： GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG。 0014 所述一对特异性检测探针为 ： 0015 正向特异性检测探针 VPDF ： CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA， 3 端标记异硫氰酸荧光 素 (Fitc) ； 0016 反向特异性检测探针 VPDR ： GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC， 5端标记生物素 (Biotin)。 0017 所述副溶血性弧菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0018 1) 副溶血性弧菌模板 DNA 的提取 0019 利用 CTAB/NaCl 法 ( 参考微生物学实验 ( 第四版 )。
16、 主编沈萍陈向东 ) 或者细菌基 因组 DNA 提取试剂盒 ( 购于 TIANGEN 厦门泰京生物技术有限公司 ) 提取副溶血性弧菌的总 DNA 作为模板 ； 0020 2) 外围引物的验证 0021 用一对外围引物 VPOF/VPOR 对模板进行扩增， 扩增后的产物进行质粒克隆得到所 需的质粒， 通过对质粒进行测序证明 ： 外围引物扩增的片段即为副溶血性弧菌 tlh 的保守 区域核酸序列， 说明该外围引物合适， 可用于后续交叉引物恒温扩增法实验 ； 0022 3) 交叉引物恒温扩增反应体系的建立 0023 20L 的恒温反应体系包括 ： 外围引物 0.1mol/L、 交叉引物 0.4mol/。
17、L、 特异性 检测探针0.3mol/L， dNTPs 0.4mol/L， MgSO46mmol/L， 10Thermopol buffer 2L， Bst DNA 聚合酶 (U/L)8U， 甜菜碱 0.5mol/L， DNA 1L ； 0024 4) 交叉引物恒温扩增程序 0025 将待反应 PCR 管放置于微量恒温器中 63恒温扩增 60min， 得到扩增产物 ； 0026 5) 扩增产物的检测 0027 扩增产物通过商品化的一次性核酸检测试纸条(3号)(购自杭州优思达生物技术 有限公司 ) 进行判读， 通过观察试纸条检测线和质控线的颜色变化来判断反应是否发生 ； 若结果为阳性， 则样本中含。
18、有检测的核酸， 试纸条出现两条红色条带， 一条位于质控区， 一 条位于检测区 ； 若结果是阴性， 则只有质控区出现一条红色条带， 检测区没有条带。 0028 与现有技术相比， 本发明具有以下突出的优点和实用性 ： 0029 灵敏度高， 本发明的灵敏度是普通 PCR 的 10 倍 ； 0030 特异性强， 本发明只检出副溶血性弧菌， 对其他致病菌检测结果均为阴性 ； 0031 快速检测， 与传统的检测方法相比， 本发明将检测时间缩短到 1.5h， 明显提高了 说 明 书 CN 103667498 B 4 3/4 页 5 检测效率 ； 0032 简便实用， 扩增产物通过一次性试纸条进行检测， 10。
19、 30min 即可完成检测结 果的判读， 尤其适用在基层实用。 附图说明 0033 图 1 为交叉引物恒温扩增产物电泳图。在图 1 中， 各标记为， M ： 100bp ladder marker ； 1 ： 副溶血性弧菌 CPA 扩增产物 ； 2 ： 阴性对照。 0034 图 2 为交叉引物法扩增产物的核酸试纸条检测结果图。在图 2 中， 各标记为， 1 ： 副 溶血性弧菌 CPA 扩增产物 ； 2 ： 阴性对照 0035 图 3 为交叉引物恒温扩增检测副溶血性弧菌特异性电泳图。在图 3 中， 各标记为， M:100bp ladder marker ； 1 ： 阴性对照 ； 2 ： 副溶血性。
20、弧菌 ； 3 ： 霍乱弧菌 ； 4 ： 溶藻弧菌 ； 5 ： 创 伤弧菌 ； 6 ： 金黄色葡萄球菌 ； 7 ： 大肠杆菌 ； 8 ： 沙门氏菌。 0036 图 4 为交叉引物恒温扩增结合核酸试纸条检测副溶血性弧菌的特异性图。在图 4 中， 各标记为， 1 ： 阴性对照 ； 2 ： 副溶血性弧菌 ； 3 ： 霍乱弧菌 ； 4 ： 溶藻弧菌 ； 5 ： 创伤弧菌 ； 6 ： 金黄色葡萄球菌 ； 7 ： 大肠杆菌 ； 8 ： 沙门氏菌。 具体实施方式 0037 以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明， 但不用来限制本发明的范围。 0038 实施例 1 引物的设计与合成 0039 根据副溶血性弧菌。
21、不耐热溶血毒素基因 tlh 的保守区域设计了两对引物和一对 特异性检测探针， 序列如下 ： 0040 所述一对外围引物为 ： 0041 正向外围引物 VPOF ： TGCGAAAGTGCTTGAGAT ； 0042 反向外围引物 VPOR ： GATGAGCGGTTGATGTCC。 0043 所述一对交叉引物为 ： 0044 正向交叉引物 VPIF ： TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ； 0045 反向交叉引物 VPIR ： GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG。 0046 所述一对特异性检测探针为 ： 0047 正。
22、向特异性检测探针 VPDF ： CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA， 3 端标记异硫氰酸荧光 素 (Fitc) ； 0048 反向特异性检测探针 VPDR ： GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC， 5端标记生物素 (Biotin)。 0049 实施例 2 CPA 方法的建立 0050 20L 的恒温反应体系包括 ： 外围引物 0.1mol/L、 交叉引物 0.4mol/L、 特异性 检测探针0.3mol/L， dNTPs 0.4mol/L， MgSO46mmol/L， 10Thermopol buffer 2L， Bst DNA 聚合酶 (U/L)8U， 甜菜碱 0。
23、.5mol/L， DNA 1L。 0051 CPA 反应程序 ： 63恒温扩增 60min。 0052 扩增产物的检测 ： 扩增结束后取810L扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。 将试纸条放入含有 100L 缓冲液的微孔板中。15 30min 后即可通过试纸条的显色进行 说 明 书 CN 103667498 B 5 4/4 页 6 判读。 0053 实施例 3 CPA- 核酸试纸条法检测特异性 0054 分别对 10 株不同的副溶血性弧菌进行检测， 结果均为阳性。为了进一步验证其特 异性， 分别选取霍乱弧菌、 创伤弧菌、 溶藻弧菌、 沙门氏菌、 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌作为 对照菌进行测试，。
24、 结果显示， 对照菌结果均为阴性。 证明本发明对副溶血性弧菌具有较好的 特异性。 0055 CPA-核酸试纸条检测副溶血性弧菌的灵敏性。 通过就平板菌落计数计算出纯培养 物的浓度并对其进行 10 倍梯度稀释， 稀释后的培养物用细菌基因组提取试剂盒进行基因 组的提取， 将提取后的基因组取 1L 用于 CPA 反应检测该方法的灵敏性。经检测， 本发明 的最低检测限为 5.6102CFU/mL， 其灵敏度是普通 PCR 的 10 倍。 说 明 书 CN 103667498 B 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103667498 B 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 103667498 B 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 103667498 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103667498 B 10 。