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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610289393.1 (22)申请日 2016.05.04 (71)申请人 长春圣金诺生物制药有限公司 地址 130103 吉林省长春市高新区顺达路 1239A号厂房 (72)发明人 王宏燕关羽虹程立均张军 杨文魁王瀚张淑凤李傅霞 (74)专利代理机构 吉林省长春市新时代专利商 标代理有限公司 22204 代理人 孙国振 (51)Int.Cl. C07K 14/59(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1。
2、/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (54)发明名称 一种重组人促卵泡激素的纯化方法 (57)摘要 一种重组人促卵泡激素的纯化方法， 包括亲 和层析、 阴离子交换层析、 凝胶过滤层析。 首先利 用亲和层析 （偶联了骆驼源单抗的FSH亲和介 质） ， 除去大量的色素、 宿主蛋白、 外源DNA及细菌 内毒素， 一步获得较高的目的蛋白纯度， 同时实 现样品的浓缩富集； 然后阴离子交换层析可以去 除糖基化不足的偏碱性FSH蛋白， 并有效去除带 负电的外源杂质； 最后凝胶过滤可除去残留的宿 主蛋白、 外源DNA与细菌内毒素， 同时， 实现向制 剂缓冲液组分的置换。 本发明步骤。
3、少， 简便易行， 不含对目的蛋白活性影响较大的极端条件， 产品 质量稳定。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105906704 A 2016.08.31 CN 105906704 A 1.重组人促卵泡激素(r-hFSH)的纯化方法， 包括以下步骤： (1)细胞培养收液的澄清 利用孔径0.2-0.25um的中空纤维滤膜对细胞培养收液进行澄清处理， 得到培养上清 液； (2)亲和层析分离 将步骤(1)所得无以240cm/h流速上样FSH亲和层析柱， 用溶液A洗涤2柱体积， 然后用溶 液B洗涤2柱体积， 再用溶液A洗涤2柱体积， 最后用溶液C洗脱， 得到FSH亲和层析洗脱峰样 品， 其中。
4、， 溶液A为25mMTris-HCl， 150mMNaCl， pH7.2、 溶液B为25mMTris-HCl， 1MNaCl， pH7.2、 溶液C为25mMTris-HCl， 2.0MMgCl2， pH7.2； (3)分子筛层析脱盐 将步骤(2)所得物以120cm/h流速上样SephadexG25Medium层析柱， 收集洗脱峰样品； (4)阴离子交换层析分离 将步骤(3)所得物以120cm/h流速上样QSepharoseFF层析柱， 用溶液D洗涤2柱体积， 然后用溶液E洗涤2柱体积， 再用溶液F洗涤2柱体积， 最后用溶液G洗脱， 得到Q层析洗脱峰样 品， 其中， 溶液D为25mMTris，。
5、 pH7.2、 溶液E为25mMTris， pH8.0、 溶液F为25mMTris， 50mM NaCl， pH8.0、 溶液G为25mMTris， 200mMNaCl， pH8.0； (5)分子筛层析分离得产品 将步骤(4)所得物以25cm/h流速上样SephacrylS200HR层析柱， 收集洗脱峰， 将上述 S200洗脱峰进行纳米过滤， 得高纯度重组人促卵泡激素。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105906704 A 2 一种重组人促卵泡激素的纯化方法 技术领域 0001 本发明属于制药领域， 具体涉及蛋白质的纯化。 背景技术 0002 卵泡刺激素(FollicleStimulati。
6、ngHormone， FSH)， 也称为促卵泡激素， 是一种 由垂体嗜碱性细胞合成和分泌的促性腺激素类糖蛋白。 FSH能够促进卵巢中卵泡的发育与 成熟， 可用于诱发排卵或超排卵， 在男子可以促进精子的发育， 可用于女性和男性病人的不 孕和生殖紊乱的治疗。 目前国内己经上市的有从尿液中提取的注射用尿促卵泡刺激素， 还 有采用基因重组技术生产的重组人促卵泡激素(r-hFSH)， 其纯度更高、 避免了尿蛋白及其 他杂质的污染， 商品名为果纳芬和普丽康。 0003 促卵泡激素是一种异源二聚体糖蛋白， 由非共价结合的 和 亚基组成， 分别含有 92个和111个氨基酸。 糖基以N-糖苷键的方式连接在 和 。
7、两个亚基各自的区域， 糖在糖蛋白 中占1530， 主要包括甘露糖、 岩藻糖和半乳糖， N-乙酰葡萄糖胺， 糖链末端含唾液酸。 FSH每个亚基上有2个糖基位点( 亚基的分别位于第52位和第78位氨基酸残基上， 亚基的 分别位于第7位和第24位氨基酸残基上)， 糖链的组成直接影响着FSH的生物学活性。 0004 糖蛋白激素是一类重要的生物大分子， 概括起来包括三个方面特点:低含量、 不稳 定性及不均一性。 在糖链上的不均一性引起理化性质的较大差别， 为其色谱分离增加了难 度。 目前纯化重组人促卵泡素多使用染料亲和层析或者金属螯合层析作为捕获手段， 后期 通过疏水作用层析、 反相层析、 离子交换层析。
8、、 分子筛层析等多步处理来实现该蛋白质的纯 化。 例如， CN200580037591涉及染料亲和、 疏水作用、 反相层析； CN201080022681涉及染料亲 和、 阴离子交换、 疏水作用层析； CN201080056651涉及反相、 凝胶过滤、 疏水层析等； CN200480036591涉及阴离子交换层析、 金属螯合层析、 疏水层析及反相层析等。 0005 上述方法中， 金属螯合层析会将重金属离子引入蛋白质溶液中， 同时可能不同程 度地影响蛋白活性； 反相层析需要使用有机溶剂洗脱目的蛋白， 长时间暴露于有机溶剂中 会导致蛋白不可逆的变性， 严重影响蛋白的生物学洁性； 而疏水作用层析则普。
9、遍存在回收 率较低的问题。 因此， 开发一种保持蛋白活性且纯度收率较高的r hFSH纯化方法具有重要 意义。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种适合工业化的重组人促卵泡激素(r-hFSH)的纯化方法， 克服现有的纯化方法存在的上述不足。 0007 本发明的方法包括： 0008 1、 细胞培养收液的澄清 0009 利用孔径0.2-0.25um的中空纤维滤膜对细胞培养收液进行澄清处理， 得到培养上 清液； 0010 2、 亲和层析分离 说明书 1/3 页 3 CN 105906704 A 3 0011 将上述培养上清液样品以240cm/h流速上样FSH亲和层析柱， 用溶液A洗涤2柱体 积，。
10、 然后用溶液B洗涤2柱体积， 再用溶液A洗涤2柱体积， 最后用溶液C洗脱， 得到FSH亲和层 析洗脱峰样品， 其中， 溶液A为25mMTris-HCl， 150mMNaCl， pH7.2、 溶液B为25mMTris-HCl， 1MNaCl， pH7.2、 溶液C为25mMTris-HCl， 2.0MMgCl2， pH7.2； 0012 3、 分子筛层析脱盐 0013 将上述FSH亲和层析洗脱峰样品以120cm/h流速上样SephadexG25Medium层析柱， 收集洗脱峰样品； 0014 4、 阴离子交换层析分离 0015 将上述G25脱盐后样品以120cm/h流速上样QSepharoseF。
11、F层析柱， 用溶液D洗涤2 柱体积， 然后用溶液E洗涤2柱体积， 再用溶液F洗涤2柱体积， 最后用溶液G洗脱， 得到Q层析 洗脱峰样品， 其中， 溶液D为25mMTris， pH7.2、 溶液E为25mMTris， pH8.0、 溶液F为25mM Tris， 50mMNaCl， pH8.0、 溶液G为25mMTris， 200mMNaCl， pH8.0 0016 5、 分子筛层析分离得产品 0017 将上述Q层析洗脱峰样品以25cm/h流速上样SephacrylS200HR层析柱， 收集洗脱 峰。 将上述S200洗脱峰进行纳米过滤， 得高纯度重组人促卵泡激素。 0018 本发明的积极效果是： 。
12、首先利用亲和层析(偶联了骆驼源单抗的FSH亲和介质)， 除 去大量的色素、 宿主蛋白、 外源DNA及细菌内毒素， 一步获得较高的目的蛋白纯度， 同时实现 样品的浓缩富集； 然后阴离子交换层析可以去除糖基化不足的偏碱性FSH蛋白， 并有效去除 带负电的外源杂质； 最后凝胶过滤可除去残留的宿主蛋白、 外源DNA与细菌内毒素， 同时， 实 现向制剂缓冲液组分的置换。 本发明步骤少， 简便易行， 不含对目的蛋白活性影响较大的极 端条件， 产品质量稳定。 附图说明 0019 图1为SDS-PAGE电泳分析实施例1纯化后的rFSH纯度图谱， 1为Marker； 2为rFSH原 液， 纯度:99.50。 0。
13、020 图2为SEC HPLC液相分析实施例1纯化后的rFSH纯度图谱， 纯度为99.97。 具体实施方式 0021 1、 备下表中所列缓冲溶液 0022 名称缓冲液配方 溶液A25mMTris-HCl， 150mMNaCl， pH7.2 溶液B25mMTris-HCl， 1MNaCl， pH7.2 溶液C25mMTris-HCl， 2.0MMgCl2， pH7.2 溶液D25mMTris， pH7.2， 溶液E25mMTris， pH8.0， 溶液F25mMTris， 50mMNaCl， pH8.0 溶液G25mMTris， 200mMNaCl， pH8.0 溶液H20mMPB， pH7.0。
14、 说明书 2/3 页 4 CN 105906704 A 4 0023 2、 细胞培养收液的澄清 0024 利用孔径0.2um的中空纤维滤柱(GEHealthcare公司)对细胞培养收液进行澄清 处理， 得到培养上清液。 0025 3、 亲和层析分离 0026 将上述培养上清液样品以240cm/h流速上样FSH亲和层析柱(XK50/30,Vt320ml， LifeTechnology公司制造， 预先用溶液A平衡)， 用溶液A洗涤2柱体积， 然后用溶液B洗涤2 柱体积， 再用溶液A洗涤2柱体积， 最后用溶液C洗脱， 得到FSH亲和层析洗脱峰。 0027 4、 分子筛层析脱盐 0028 将上述FSH。
15、亲和层析洗脱峰样品以120cm/h流速上样SephadexG25Medium层析柱 (XK50/60,Vt1000ml,GEHealthcare公司制造， 预先用溶液D平衡)， 收集洗脱峰。 0029 5、 阴离子交换层析分离 0030 将上述G25脱盐后样品以120cm/h流速上样QSepharoseFF层析柱(XK26/20,Vt 80ml,GEHealthcare公司制造， 预先用溶液D平衡)， 用溶液D洗涤2柱体积， 然后用溶液E洗 涤2柱体积， 再用溶液F洗涤2柱体积， 最后用溶液G洗脱， 得到Q层析洗脱峰。 0031 6、 分子筛层析分离 0032 将上述Q层析洗脱峰样品以25cm/h流速上样SephacrylS200HR层析柱(XK50/100， Vt2000ml,GEHealthcare公司制造， 预先用溶液H平衡)， 收集洗脱峰。 将上述S200洗脱峰 进行纳米过滤， 得的蛋白溶液即为重组人促卵泡激素。 采用SDS-PAGE、 SEC-HPLC等方法检测 原液目的蛋白纯度。 说明书 3/3 页 5 CN 105906704 A 5 图1 图2 说明书附图 1/1 页 6 CN 105906704 A 6 。