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1、(10)申请公布号 CN 102676597 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676597 A *CN102676597A* (21)申请号 201110062425.1 (22)申请日 2011.03.16 C12P 13/00(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 9/14(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 苏州国镝医药科技有限公司 地址 215123 江苏省苏州市工业园区星湖街 218 号 A2 楼 203-207-208 (72)发明人 韩国霞 姚亦明 徐霆 (54) 发明名称 生物酶手性合成。
2、立普妥中间体 ATS-5 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 酶 法 合 成 (R)-4- 氰 基 -3- 羟基 - 丁酸乙酯 (ATS-5， 立普妥中间体 ) 及其衍生物的制备方法， 其制备过程用以下反应 式表示 ：上式 中， R 为甲基， 乙基 (ATS-5)， 丙基， 丁基， 或苄基， 以及其它 C1-C8 任意取代烷基。其主要原理是在 缓冲溶液中， 利用基因重组的卤代醇脱卤酶催化 取代化合物 I 中的氯， 得到氰基取代的手性化合 物 II(ATS-5， R 为乙基 )。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12。
3、)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 手性酶法合成 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯 (ATS-5， 立普妥中间体 ) 及其衍生物 的制备方法， 其制备过程用以下反应式表示 ： 上式中， R为甲基， 乙基(ATS-5)， 丙基， 丁基， 或苄基， 以及其它C1-C8任意取代烷基。 其 主要原理是在缓冲溶液中， 利用基因重组的卤代醇脱卤酶催化取代化合物 I 中的氯， 通过 无机酸碱调节 pH 值， 利用有机溶剂提取， 得到氰基取代手性化合物 II(ATS-5， R 为乙基 )。 2.Agrobacterium tumefaciens 卤代醇脱卤酶变体的。
4、基因和蛋白序列。变体和野生型 的序列有 2-12 个氨基酸改变。这些变体可更高效催化反应。 3.根据权利要求1所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物， 其特 征在于 ： 利用大肠杆菌高效表达卤代醇脱卤酶。 4.根据权利要求1所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物， 其特 征在于 ： 利用这个大肠杆菌工程菌直接催化。 5.根据权利要求1所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物， 其特 征在于 ： 所述的有机溶剂选自甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 叔丁醇、 己丙醇、 四氢呋喃、 甲基叔丁 醚。 6.根据权利要求1所示的手性酶法合成(R。
5、)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物， 其特 征在于 ： 所用缓冲溶液为无机磷酸及无机磷酸盐。 7.根据权利要求1所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物， 其特 征在于 ： 保持体系温度在 25-40 摄氏度之间。 8.根据权利要求1所示的手性酶法合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯及衍生物， 其特 征在于 ： 所用的无机碱选自氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠、 碳酸钾、 碳酸氢钠、 碳酸氢钾。 权 利 要 求 书 CN 102676597 A 2 1/2 页 3 生物酶手性合成立普妥中间体 ATS-5 技术领域 0001 本发明涉及手性(R)-4-氰基-3-羟基-丁酸。
6、乙酯(ATS-5， 立普妥中间体)及其衍 生物的酶法制备， 属于酶在手性合成中的应用领域， 本方法也属于绿色化学及基因工程领 域。 背景技术 0002 (S)-4- 氰基 -3- 羟基 - 丁酸乙酯 (ATS-5) 是生产立普妥的关键手性中间体之一， 中国大多用化学法在生产。成本高， 纯度低， 污染尤其严重， 对环境的影响非常大。用生物 转化来生产这些中间体， 有明显的优势。目前， Ciba， Diverva， DSM， Codixis 等公司在 ATS-5 合成中采用酶法工艺。 在已有工艺和知识的基础上， 我们筛选得到关键酶， 包括卤代醇脱卤 酶， 在已知蛋白结构的基础上通过半随几饱和突变和。
7、定向突变等方法增加酶活性， 手性反 应选择性 ( 光学纯度 e.e 值上升 )， 热稳定性和对有机溶剂耐受能力。因此， 生物催化活性 得以大大提高， 反应的手性选择性也得到了加强， 这就使得 ATS-5 的生产成本大大降低。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是 ： 将提供一种反应步骤短、 成本较低、 产品光学纯度 高的 (R)-4- 氰基 -3- 羟基 - 丁酸乙酯 (ATS-5) 及其衍生物的制备方法。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 所述的手性 (S)-4- 氰基 -3- 羟 基 - 丁酸乙酯 (ATS-5) 及其衍生物的制备方法， 其制备过程用以下。
8、反应式表示 ： 0005 0006 上式中， R为甲基， 乙基(ATS-5， 化合物II)， 丙基， 丁基， 或苄基， 以及其它C1-C8任 意取代烷基。其主要原理是在缓冲溶液中， 利用基因重组的卤代醇脱卤酶取代化合物 I 中 的氯， 得到氰基取代的手性化合物 II(ATS-5， R 为乙基 )。 0007 所述制备方法包括如下步骤 ： 将一摩尔的化合物I溶于500毫升到2000毫升的缓 冲溶液和有机溶剂中， 及相应当量的NaCN， 在上述有机溶液中加入重量为化合物I的0.1 20的基因重组卤代醇脱卤酶， 保持体系在 15 到 45 摄氏度之间， 优先在 25 45 摄氏度， 搅拌 48-12。
9、0 小时， 停止反应， 调节 pH， 用 1000 毫升左右的有机溶剂萃取 3 次， 合并有机相， 干燥剂干燥， 减压蒸馏除去有机溶剂， 得到氰基取代的目标化合物 II。 0008 上面所述的卤代醇脱卤酶是大肠杆菌高效表达卤代醇脱卤酶。 0009 上面所述的卤代醇脱卤酶， 用于其表达的大肠杆菌工程菌直接催化。 0010 上面所述的卤代醇脱卤酶， 利用一种噬热菌的卤代醇脱卤酶。变体和野生型相比 有十个氨基酸差别。 0011 上面所述的有机溶剂选自甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 叔丁醇、 己丙醇、 四氢呋喃、 甲基 说 明 书 CN 102676597 A 3 2/2 页 4 叔丁醚。 0012 。
10、上面所述的缓冲溶液为无机磷酸及无机磷酸盐。 0013 上面所述的所用的无机碱选自氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠、 碳酸钾、 碳酸氢钠、 碳 酸氢钾。 0014 本发明的优点是 ： 产率高， 产品光学纯度高， 反应时间短， 卤代醇脱卤酶 系基因重 组产物， 制备成本较低。 具体实施方式 0015 下面通过实施例对本发明作进一步的描述， 但不以任何方式限制本发明。 0016 实施例 1 ： 0017 0018 取 50 毫升， 0.1M， pH 7.0 的 Na2H2PO4.Na2HPO4缓冲溶液加入一三角瓶中， 加入化 合物 1(0.1 摩尔 ) 及 NaCN(0.1 摩尔 ) 和卤代醇脱卤酶 (0.1 克 )， ， 于 40 摄氏度下搅拌 72 小时， 控制 pH 值在 7.5 8.5 之间， 高效液相色谱监控反应结束。乙酸乙酯提取两遍， 有机 相旋干得到 9.2 克 ATS-5( 光学纯度 99， 产率 90 ) 。 说 明 书 CN 102676597 A 4 。