技术领域
本发明涉及4-羟基异亮氨酸的分离纯化方法，更详细而言，涉 及利用了向缩醛胺体转化的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的分离 纯化方法和分离除去方法。
背景技术
已知4-羟基异亮氨酸是非蛋白质性氨基酸的一种，从 Fenugreek(胡芦巴)(Trigonella foenum-graecum L.)种子等中提取(非专 利文献1、2、3)。
关于该4-羟基异亮氨酸，报道了血糖值依赖性的胰岛素分泌促 进活性(专利文献1、非专利文献4)、胰岛素敏感性的增强作用(专利 文献2、3、非专利文献5)、肌肉中的糖原生成促进活性(专利文献 4、非专利文献6)、皮肤或头皮的保护作用(专利文献5)、脂肪吸收 抑制作用(专利文献6)、抗肥胖作用(专利文献7)等，作为利用上述作 用的医药品、健康食品原料、化妆品(香粧品)原料等有用。进而作为 各种医药品的合成中间体也有用。
现在，作为得到4-羟基异亮氨酸的方法，已知从Fenugreek种 子中提取(专利文献8、9、非专利文献1、2、3)和化学合成(专利文 献10、11、非专利文献7)。
在提取法中，为了与皂甙类或其他氨基酸分离，需要用硅胶或 离子交换树脂进行色谱操作或重结晶等繁琐的操作。特别是 Fenugreek种子所含的4-羟基异亮氨酸，除含有基于发挥上述作用 的观点被认为较重要的立体异构体的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨 酸以外，还以约为9∶1的比例含有其他立体异构体(2R，3R，4S)- 4-羟基异亮氨酸(非专利文献2)，即使重复使用色谱或重结晶，也不 容易分离上述立体异构体。
专利文献8中，虽然通过用离子交换树脂进行的色谱和重结晶 从100g脱脂的Fenugreek种子中得到0.6g纯度为99％的(2S，3R， 4S)-4-羟基异亮氨酸，但是认为该回收率并不高。原因在于特别是 在重结晶时由于其特性而无法避免目标物向滤液中的流失，越进行 重结晶其回收率越降低。
合成法中，由于副反应等常常含有立体异构体，为了除去上述 杂质，需要HPLC或重结晶之类繁琐的操作。上述操作中伴有成本 面或设备面大型化困难、收率降低的问题。
如上所述，现有的4-羟基异亮氨酸的纯化方法中还存在着问 题，因此期待更有效且简便的方法。
[专利文献1]欧州专利第587476号说明书
[专利文献2]国际公开第2001/015689号小册子
[专利文献3]国际公开第2005/039626号小册子
[专利文献4]国际公开第2005/021596号小册子
[专利文献5]国际公开第2004/087091号小册子
[专利文献6]特开2006-89449号公报
[专利文献7]美国专利申请第2006/0223884号说明书
[专利文献8]美国专利第5470879号说明书
[专利文献9]国际公开第2005/084323号小册子
[专利文献10]国际公开第2004/099120号小册子
[专利文献11]国际公开第2006/051000号小册子
[非专利文献1]Phytochemistry，vol.12，1707-1711，1973
[非专利文献2]Phytochemistry，vol.15，325，1976
[非专利文献3]Phytochemistry，vol.28，1835-1841，1989
[非专利文献4]Diabetes，Vol.47，Issue 2206-210，1998
[非专利文献5]American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism，Vol.287，E463-E471，2004
[非专利文献6]Amino Acids，vol.28，71-76，2005
[非专利文献7]European Joumal of Organic Chemistry，vol.5，834-839， 2002
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供简便、高纯度且高收率地分离纯化(2S， 3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化学上可接受的盐(以下有时也称为 “(2S，3R，4S)-HIL”)的方法。
另外，本发明的目的还在于提供从混合物中简便地分离除去 (2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的方法。
解决课题的方法
本发明人发现通过将(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸转化为缩 醛胺体后，再进行有机溶剂提取，可以从其立体异构体、或来自于 粗提取物的皂甙类或其他氨基酸等其他化合物中简便且良好地分离 该缩醛胺体等，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
〔1〕(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化学上可接受的盐 的纯化方法，其中，所述方法包括以下的工序(a)、(b)和(c)。
工序(a)：使混合物中的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化 学上可接受的盐与式Q-CHO[式中，Q表示可以具有取代基的碳 原子数为6～14的芳基、碳原子数为1～10的烷基、碳原子数为3～ 10的环烷基或5～10元的杂环基]表示的醛化合物或其等价体反 应，转化为式(1)表示的化合物，
[式中，Q如上所定义]；
工序(b)：使用有机溶剂提取式(1)表示的化合物；以及
工序(c)：将式(1)表示的化合物转化为(2S，3R，4S)-4-羟基异 亮氨酸或其化学上可接受的盐。
〔2〕上述〔1〕所述的方法，其中，在工序(a)的反应中使用式 Q-CHO表示的醛化合物。
〔3〕上述〔1〕所述的方法，其特征在于：通过工序(b)的提取 工序，从式(1)表示的化合物中除去杂质。
〔4〕上述〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，式(1)中，Q为可 以具有取代基的苯基、环己基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基或 吡咯基。
〔5〕上述〔4〕所述的方法，其中，式(1)中，Q为可以具有取 代基的苯基。
〔6〕上述〔4〕或〔5〕所述的方法，其中，Q具有取代基时 的该取代基选自由下述基团构成的组：
(i)碳原子数为1～6的烷基、
(ii)碳原子数为1～6的烷氧基、
(iii)碳原子数为2～7的烷酰基、
(iv)碳原子数为6～10的芳基、
(v)碳原子数为6～10的芳基氧基、
(vi)卤代基、
(vii)碳原子数为1～6的卤代烷基、
(viii)硝基、
(ix)甲酰基、和
(x)氰基，
(其中，上述(i)与(vii)不成为碳原子数为1～10的烷基的取代 基)。
〔7〕上述〔1〕所述的方法，其中，工序(b)的有机溶剂为至少 一种的乙酸烷基酯。
〔8〕上述〔1〕所述的方法，其中，在工序(c)中，使用选自由 以下物质构成的组中的至少一种亲核试剂，所述物质为水、可以被 碳原子数为1～4的烷基取代的羟胺、氨、碳原子数为1～4的烷基 胺、碳原子数为2～8的二烷基胺、可以被选自碳原子数为1～4的 烷基、碳原子数为6～10的芳基与碳原子数为2～7的烷酰基中的取 代基取代的肼、和被碳原子数为1～6的烷基取代的卤化季铵、以及 它们的化学上可接受的盐。
〔9〕上述〔1〕所述的方法，其中，在至少一种的乙酸烷基酯 中进行工序(c)的向(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化学上可接 受的盐的转化。
〔10〕上述〔9〕所述的方法，其中，至少一种的乙酸烷基酯 为乙酸乙酯。
〔11〕(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化学上可接受的盐 的分离除去方法，其中，所述方法包括以下的工序(a)和(b)。
工序(a)：使混合物中的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化 学上可接受的盐与式Q-CHO[式中，Q表示可以具有取代基的碳 原子数为6～14的芳基、碳原子数为1～10的烷基、碳原子数为3～ 10的环烷基或5～10元的杂环基]表示的醛化合物或其等价体反 应，转化为式(1)表示的化合物，
[式中，Q如上所定义]；
工序(b)：使用有机溶剂提取式(1)表示的化合物。
〔12〕上述〔11〕所述的方法，其中，在工序(a)的反应中使用 式Q-CHO表示的醛化合物。
〔13〕上述〔11〕或〔12〕所述的方法，其中，式(1)中，Q为 可以具有取代基的苯基、环己基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基 或吡咯基。
〔14〕上述〔13〕所述的方法，其中，式(1)中，Q为可以具有 取代基的苯基。
〔15〕上述〔13〕或〔14〕所述的方法，其中，Q具有取代基 时的该取代基选自由下述基团构成的组：
(i)碳原子数为1～6的烷基、
(ii)碳原子数为1～6的烷氧基、
(iii)碳原子数为2～7的烷酰基、
(iv)碳原子数为6～10的芳基、
(v)碳原子数为6～10的芳基氧基、
(vi)卤代基、
(vii)碳原子数为1～6的卤代烷基、
(viii)硝基、
(ix)甲酰基、和
(x)氰基，
(其中，上述(i)与(vii)不用作碳原子数为1～10的烷基的取代 基)。
〔16〕上述〔11〕所述的方法，其中，工序(b)的有机溶剂为至 少一种的乙酸烷基酯。
发明效果
本发明的方法作为(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸或其化学上 可接受的盐的分离纯化方法有用，可以提供较色谱或重结晶更有效 地、高收率且高纯度的(2S，3R，4S)-HIL。
更具体而言，可以从Fenugreek提取液、来源于培养微生物得到 的发酵液等含有4-羟基异亮氨酸的混合物中有效地分离(2S，3R， 4S)-HIL。另外，可以从用化学合成得到的含有4-羟基异亮氨酸的 混合物中有效地分离(2S，3R，4S)-HIL。
另外，本发明的方法作为(2S，3R，4S)-HIL的分离除去方法也 有用，可以从化合物的混合物中有效地除去(2S，3R，4S)-HIL。结 果可以提高混合物中的其他化合物、例如其立体异构体(2R，3R，4S) -4-羟基异亮氨酸或其化学上可接受的盐(以下有时也称为“(2R， 3R，4S)-HIL”)的纯度。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的方法中，(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸可以为化学 上可接受的盐的形态。作为该“化学上可接受的盐”，只要是不给本发 明的方法带来不良影响的盐即可，没有特别限定，可以举出例如与 氨；钠、钾等碱金属；钙、镁等碱土类金属；铝；锌；三乙胺、乙 醇胺、吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、二环己胺等有机胺；精氨酸、 赖氨酸等碱性氨基酸；盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸等无机 酸；乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、 鞣酸、丁酸、羟苄基苯甲酸、扑酸、庚酸、癸酸、茶氯酸、水杨 酸、乳酸、乙二酸、扁桃酸、苹果酸等有机羧酸；甲磺酸、苯磺 酸、对甲苯磺酸等有机磺酸等的盐。
本发明的纯化方法或分离方法中，成为其对象的混合物只要是 含有(2S，3R，4S)-HIL的化学物质混合物即可，对其含有率或其他 物质的组成没有任何限定。作为成为本发明方法的对象的混合物， 可以举出植物组织提取物、动物组织提取物、培养微生物得到的发 酵液、来自于化学合成后的反应液的混合物等。
另外，本发明的纯化方法也可以适用于除去较纯的(2S，3R，4S) -HIL粗制物中的少量杂质的情况。
本发明的纯化方法中，作为其结果所得的(2S，3R，4S)-HIL的 纯度只要较纯化前的纯度提高即可，没有特别限定，但本方法的优 选方式中，提供实质上纯的、例如用1H-NMR(300MHz)测定时未 观测到杂质峰的(2S，3R，4S)-HIL。
本发明的式(1)表示的化合物为(2S，3R，4S)-HIL的缩醛胺 体，式(1)中，Q表示可以具有取代基的碳原子数为6～14的芳基、 碳原子数为1～10的烷基、碳原子数为3～10的环烷基或5～10元 的杂环基。
作为上述“可以具有取代基的碳原子数为6～14的芳基”之“碳原 子数为6～14的芳基”，可以举出例如苯基、萘基、蒽基、菲基、联 苯基等，可以优选举出碳原子数为6～10的芳基(例如苯基、萘基、 联苯基等)，更优选苯基。
作为上述“可以具有取代基的碳原子数为1～10的烷基”之“碳原 子数为1～10的烷基”，可以举出碳原子数为1～10的直链或支链烷 基，优选碳原子数为1～6的直链或支链烷基(例如甲基、乙基、正丙 基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等)。
作为上述“可以具有取代基的碳原子数为3～10的环烷基”之“碳 原子数为3～10的环烷基”，可以举出例如环丙基、环丁基、环戊 基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等，可以优选举出 碳原子数为5～8的环烷基(例如环戊基、环己基、环庚基、环辛基 等)，更优选环己基。
作为上述“可以具有取代基5～10元的杂环基”之“5～10元的杂 环基”，可以举出除碳原子以外，还含有1～4个选自氧原子、硫原子 和氮原子中的杂原子的5～10元芳香族杂环基或非芳香族杂环、及 其稠环基。
作为该芳香族的杂环基或其稠环基，可以举出2-或3-噻吩 基，2-或3-呋喃基，1-、2-或3-吡咯基，1-、2-、4-或5 -咪唑基，2-、4-或5-噁唑基，2-、4-或5-噻唑基，1-、3 -、4-或5-吡唑基，3-、4-或5-异噁唑基，3-、4-或5-异 噻唑基，1，2，4-三唑-1-、3-、4-或5-基，1，2，3-三唑 -1-、2-或4-基，1H-四唑-1-或5-基，2H-四唑-2-或5 -基，2-、3-或4-吡啶基，2-、4-或5-嘧啶基，1-、2-、 3-、4-、5-、6-或7-吲哚基，2-、3-、4-、5-、6-或7 -苯并呋喃基，2-、3-、4-、5-、6-或7-苯并噻吩基，1-、 2-、4-、5-、6-或7-苯并咪唑基，2-、3-、4-、5-、6 -、7-或8-喹啉基，1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-异喹 啉基等。
作为该非芳香族的杂环基或其稠环基，可以举出2-或3-二氢 噻吩基，2-或3-二氢呋喃基，1-、2-或3-吡咯啉基，1-、2 -、4-或5-咪唑啉基，2-、4-或5-噁唑啉基，2-、4-或5- 噻唑啉基，1-、3-、4-或5-吡唑啉基，3-、4-或5-异噁唑啉 基，3-、4-或5-异噻唑啉基，1，2，4-三唑啉-1-、3-、4- 或5-基，1，2，3-三唑啉-1-、2-或4-基，1H-四唑啉-1- 或5-基，2H-四唑啉-2-或5-基，2-、3-或4-二氢吡啶 基，2-、4-或5-二氢嘧啶基，1-、2-、3-、4-、5-、6-或 7-二氢吲哚基，2-、3-、4-、5-、6-或7-二氢苯并呋喃基， 2-、3-、4-、5-、6-或7-二氢苯并噻吩基，1-、2-、4-、 5-、6-或7-二氢苯并咪唑基，2-、3-、4-、5-、6-、7-或 8-二氢喹啉基，1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-二氢异喹啉 基，2-或3-四氢噻吩基，2-或3-四氢呋喃基，1-、2-或3- 四氢吡喃基，1-、2-或3-吡咯烷基，1-、2-、4-或5-咪唑 啉基，2-、4-或5-噁唑啉基，2-、4-或5-噻唑啉基，1-、3 -、4-或5-吡唑啉基，3-、4-或5-异噁唑啉基，3-、4-或5 -异噻唑啉基，1，2，4-三唑啉-1-、3-、4-或5-基，1，2， 3-三唑啉-1-、2-或4-基，1H-四唑啉-1-或5-基，2H-四 唑啉-2-或5-基，2-、3-或4-哌啶基，1-或2-哌嗪基，1 -、2-或3-吗啉基，1-、2-或3-硫代吗啉基，2-、3-、4 -、5-、6-、7-或8-四氢喹啉基，1-、3-、4-、5-、6-、 7-或8-四氢异喹啉基等。
作为该“杂环基”，可以优选举出噻吩基、呋喃基、噁唑基、噻唑 基、异噁唑基、异噻唑基、吡啶基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩 基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢呋喃基、四氢吡 喃基等，可以更优选举出噻吩基、呋喃基、吡啶基等。
其他实施方式中，Q表示可以具有取代基的碳原子数为6～14 的芳基、碳原子数为1～10的烷基或5～10元的杂环基。
作为上述Q所表示的“可以具有取代基的碳原子数为6～14的芳 基、碳原子数为1～10的烷基、碳原子数为3～10的环烷基或5～10 元的杂环基”之取代基，可以举出例如下述基团：
(i)碳原子数为1～6的烷基、
(ii)碳原子数为1～6的烷氧基、
(iii)碳原子数为2～7的烷酰基、
(iv)碳原子数为6～10的芳基、
(v)碳原子数为6～10的芳基氧基、
(vi)卤代基、
(vii)碳原子数为1～6的卤代烷基、
(viii)硝基、
(ix)甲酰基、和
(x)氰基，
(其中，上述(i)与(vii)不成为碳原子数为1～10的烷基的取代 基)。
其他实施方式中，上述取代基选自下述基团：
(i)碳原子数为1～6的烷基、
(ii)碳原子数为1～6的烷氧基、
(iii)碳原子数为2～7的烷酰基、
(iv)碳原子数为6～10的芳基、
(v)碳原子数为6～10的芳基氧基、
(vi)卤代基、
(vii)碳原子数为1～6的卤代烷基、
(viii)硝基、和
(ix)甲酰基，
(其中，上述(i)与(vii)不成为碳原子数为1～10的烷基的取代 基)。
上述“(i)碳原子数为1～6的烷基”是碳原子数为1～6的直链或支 链烷基，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲 丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等，优选为甲基、乙基、正丙 基、异丙基。
上述“(ii)碳原子数为1～6的烷氧基”是上述“碳原子数为1～6的 烷基”与氧原子键合得到的基团，可以举出例如甲氧基、乙氧基、正 丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、 戊基氧基、己基氧基等，优选为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙 氧基。
上述“(iii)碳原子数为2～7的烷酰基”是上述“碳原子数为1～6的 烷基”与羰基键合得到的基团，可以举出例如乙酰基、乙基羰基、正 丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、仲丁基羰基、异丁基羰基、 叔丁基羰基、戊基羰基、己基羰基等，优选为乙酰基、乙基羰基、 正丙基羰基、异丙基羰基。
作为上述“(iv)碳原子数为6～10的芳基”，可以举出例如苯基、 萘基、联苯基等，优选为苯基。
上述“(v)碳原子数为6～10的芳基氧基”是上述“碳原子数为6～ 10的芳基”与氧原子键合得到的基团，可以举出例如苯氧基、萘氧 基、联苯基氧基等，优选为苯氧基。
作为上述“(vi)卤代基”，可以举出例如氟原子、氯原子、溴原 子、碘原子等，优选为氟原子、氯原子、溴原子。
上述“(vii)碳原子数为1～6的卤代烷基”是上述“碳原子数为1～6 的烷基”被能取代的数量的、优选为1～5个的1种或1种以上的上述 “卤代基”取代得到的基团，可以举出例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲 基、单氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氯氟甲基、1-氟乙基、1，1 -二氟乙基、1，1，1-三氟乙基、五氟乙基、五氯乙基等，优选为 三氟甲基、三氯甲基。
上述“碳原子数为6～14的芳基、碳原子数为1～10的烷基、碳 原子数为3～10的环烷基或5～10元的杂环基”具有选自上述取代基 (i)～(x)中的取代基时，只要没有特别说明，对该取代基的位置和数 量没有限定。上述取代基(i)～(x)的数量为2个以上时，上述取代基 可以相同也可以不同。但是，上述(i)与(vii)不成为“碳原子数为1～10 的烷基”的取代基。
另外，上述“碳原子数为6～14的芳基、碳原子数为1～10的烷 基或5～10元的杂环基”具有选自上述取代基(i)～(ix)中的取代基时， 只要没有特别说明，对该取代基的位置和数量没有特别限定。上述 取代基(i)～(ix)的数量为2个以上时，上述取代基可以相同也可以不 同。但是，上述(i)与(vii)不成为“碳原子数为1～10的烷基”的取代 基。
作为Q，优选具有一定程度的体积和脂溶性的基团，更具体而 言，优选可以分别具有取代基的苯基、环己基、萘基、吡啶基、噻 吩基、呋喃基和吡咯基，更优选可以具有取代基的苯基。在上述基 团中，作为具有取代基时的该“取代基”，可以举出例如选自上述(i)～ (x)中的取代基等。
在其他实施方式中，作为Q，优选可以分别具有取代基的苯 基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基和吡咯基。
作为Q，特别优选硝基苯基、苯基、环己基。
在其他实施方式中，作为Q，特别优选硝基苯基、苯基。
下面，更详细地说明本发明的方法。
本发明的方法是基于下述认识完成的，即(2S，3R，4S)-HIL通 过缩醛胺化反应良好地转化为式(1)表示的化合物、即(2S，3R，4S) -HIL的缩醛胺体(1)(以下，有时也简称为“式(1)表示的化合物”或 “缩醛胺体(1)”)，并且式(1)的化合物被良好地提取到有机溶剂中。
例如，在含有(2S，3R，4S)-HIL的溶液中加入醛化合物或其等 价体时，生成(2S，3R，4S)-HIL的缩醛胺体(1)。虽然(2S，3R，4S) -HIL难以直接提取到有机溶剂中，但生成的缩醛胺体(1)脂溶性提 高，容易提取到有机溶剂中。由此，能通过提取、分液操作纯化缩 醛胺体(1)。
另一方面，作为(2S，3R，4S)-HIL的立体异构体的(2R，3R， 4S)-HIL在上述反应中几乎不形成对应的缩醛胺体。即，使用(2S， 3R，4S)-HIL和(2R，3R，4S)-HIL的混合物，在通常的条件下进 行缩醛胺化时，仅(2S，3R，4S)-HIL选择性地缩醛胺化。由此，本 发明的纯化方法甚至也能除去与(2S，3R，4S)-HIL结构上极其类似 的化合物(2R，3R，4S)-HIL。
以下，详细说明本发明的方法的各工序。
工序(a)
本发明的方法中，首先，在工序(a)中，将含有(2S，3R，4S)- HIL的混合物供给到缩醛胺化反应中。
缩醛胺化反应通过使混合物中的(2S，3R，4S)-HIL与式Q- CHO(Q如上所定义)表示的醛化合物或其等价体反应来进行。此 时，不使用其等价体，而优选使用醛化合物其本身。
此处，所谓醛化合物的等价体，是指在本缩醛胺化反应中与醛 化合物Q-CHO(Q如上所定义)同样发挥作用的合成等价体。作为 上述醛化合物的等价体，有对应于式Q-CHO表示的化合物(Q如上 所定义)的缩醛体、半缩醛体、缩醛胺体、二卤代甲基体等，特别优 选缩醛体和半缩醛体。更具体而言，可以举出式Q-CH(OR’)OR”[Q 如上所定义，R’表示氢原子、甲基或乙基，R”表示甲基或乙基，或 者R’与R”可以键合形成亚乙基]表示的缩醛或半缩醛化合物。
式Q-CHO表示的醛化合物或其等价体优选相对于混合物中的 4-羟基异亮氨酸含量添加1～5当量。此处，所谓“混合物中的4- 羟基异亮氨酸含量”，表示混合物中的(2S，3R，4S)-HIL的含量， 混合物中含有(2S，3R，4S)-HIL和其立体异构体(2S，3R，4S)- HIL时，表示它们的总含量。
上述反应根据需要可以在碱存在下进行。该碱可以为无机碱或 有机碱中的任一种，优选例如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、碳 酸钠、碳酸氢钠等无机碱，三乙胺、二异丙基乙胺、吗啉、吡咯 烷、哌啶、哌嗪、二环己胺、乙醇胺、氨水等有机碱等。
反应液中的碱浓度优选约0.1mol/L～2mol/L，相对于混合物 中的4-羟基异亮氨酸含量优选约1～10当量左右。
上述反应根据需要可以在溶剂中进行。作为该反应溶剂，优选 水、乙腈、丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙醇、异丙醇或1，4-二噁 烷、或由上述溶剂以任意比率混合而得到的混合溶剂。
上述反应的反应温度优选0℃～50℃。
工序(b)
下面，在工序(b)中，使用适当的有机溶剂提取所得的缩醛胺体 (1)。
作为提取缩醛胺体(1)的有机溶剂，可以举出例如乙酸烷基酯、 己烷、庚烷、二乙醚、叔丁基甲基醚、二氯甲烷、氯仿等不与水任 意混合的溶剂及其2种以上的混合物，优选至少一种乙酸烷基酯。 作为该“乙酸烷基酯”，可以举出例如乙酸的碳原子数为1～10的烷基 酯，更优选乙酸的碳原子数为1～4的烷基酯(例如乙酸甲酯、乙酸乙 酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔 丁酯等)。
此时，优选可以在有机溶剂提取缩醛胺体(1)之前，将反应后的 混合物根据需要加入水或碱，制成碱性的水性溶液，进行有机溶剂 洗涤。未反应而残留的醛或其等价体等可以通过将其提取在有机溶 剂(例如上述说明的乙酸烷基酯等)中来除去。
如果在洗涤后的水层中加入酸性溶液，制成弱酸性，则可以抑 制缩醛胺体(1)的羧基解离，并可以用适当的有机溶剂提取。需要说 明的是，由于此时未反应的(2R，3R，4S)-HIL残留在水层中，所 以仅(2S，3R，4S)-HIL的缩醛胺体(1)高纯度地提取到有机溶剂 中，因此可以有效地分离两者。
作为可以适应的酸性溶液，优选盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢 溴酸、乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、丁酸、 乳酸、乙二酸、苹果酸、甲磺酸等脂溶性低的酸的水溶液。
通过如上所述的操作，可以从缩醛胺体(1)中除去未反应的醛或 其等价体、(2R，3R，4S)-HIL等杂质。
被有机溶剂提取的缩醛胺体(1)在进行到下述工序(c)的脱缩醛胺 反应前，可以通过晶析、浆料洗涤、干燥等通常所用的纯化方法进 一步纯化。
工序(c)
下面，在工序(c)中，通过将缩醛胺体(1)供给到脱缩醛胺反应 中，回复到(2S，3R，4S)-HIL。
对缩醛胺体(1)的脱缩醛胺反应的方法没有特别限定，例如即使 仅将缩醛胺体(1)静置在由上述工序(b)得到的含水的提取溶剂中，脱 缩醛胺化也进行，转化为(2S，3R，4S)-HIL。
优选使用亲核试剂来进行该脱缩醛胺反应。
作为可以适合的亲核试剂，优选水、可以被碳原子数为1～4的 烷基取代的羟胺(例如羟胺)、氨、碳原子数为1～4的烷基胺(例如甲 胺)、碳原子数为2～8的二烷基胺(例如二甲胺)、可以被选自碳原子 数为1～4的烷基、碳原子数为6～10的芳基和碳原子数为2～7的 烷酰基中的取代基取代的肼(例如肼、甲肼、苯肼、乙酰肼)、被碳原 子数为1～6的烷基取代的卤化季铵(例如四丁基氟化铵、四丁基氯化 铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵)等，特别优选羟胺、甲胺和肼。
根据需要在溶剂中进行脱缩醛胺反应。作为该溶剂，只要不给 反应带来不良影响即可，可以使用任意溶剂，优选例如酯系溶剂(例 如与上述工序(b)的说明中列举的溶剂相同的乙酸烷基酯)、烃系溶剂 (例如己烷、庚烷)、醚系溶剂(例如二乙醚、叔丁基甲基醚)、卤代烃 系溶剂(例如二氯甲烷、氯仿)、醇系溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙 醇)、或上述溶剂的混合溶剂，更优选至少一种乙酸的碳原子数为 1～4的烷基酯，最优选乙酸乙酯。(2S，3R，4S)-HIL在乙酸乙酯 中的溶解度低，如果适当设定浓度等，则可以在反应后作为析出物 容易得到其结晶。
需要说明的是，特别是式(1)中的Q表示可以具有取代基的碳原 子数为6～14的芳基或5～10元的杂环基时，优选通过催化加氢来 进行脱缩醛胺反应。
作为可以适应该催化加氢的金属催化剂，优选钯、铑、铂等。
作为可以适应该催化加氢的反应溶剂，优选水、甲醇、乙醇或 乙酸乙酯、或者它们的混合溶剂。
如上所述回复的(2S，3R，4S)-HIL可以通过重晶析、浆料洗 涤、干燥等通常所用的纯化方法进一步纯化。
如上所述分离纯化的(2S，3R，4S)-HIL作为医药品(糖尿病治 疗剂等)、健康食品原料、化妆品原料等有用，以及作为各种医药品 的合成中间体也有用。
例如，将(2S，3R，4S)-HIL用作糖尿病预防和/或治疗剂时， 可以直接或根据其本身公知的方法，制成与药学上可接受的载体一 起混合而得到的药物组合物，通过口服或非口服(例如静脉内、皮 下、肌肉内、栓剂、直肠注射、软膏、贴布、舌下、滴眼、吸入等 途径)来给药。用于上述目的的给药量根据作为目标的治疗效果、给 药方法、治疗时间、年龄、体重等确定，但通过口服或非口服的途 径，作为通常成人每天的给药量，在口服给药的情况下用1μg～ 10g，在非口服给药的情况下用0.01μg～1g，给药1天1次～数次。 另外，上述药物组合物中的(2S，3R，4S)-HIL的含量为组合物整体 的约0.01％(重量)～100％(重量)。
作为药物组合物中的药学上可接受的载体，作为制剂原料，可 以举出惯用的各种有机或无机载体物质，可以举出例如固形制剂中 的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、水溶性高分子、碱性无机 盐；液状制剂中的溶剂、助溶剂、混悬剂、等渗剂、缓冲剂、无痛 化剂等。另外，根据需要，也可以使用通常的防腐剂、抗氧化剂、 着色剂、甜味剂、酸味剂、发泡剂、香料等添加物。
作为上述药物组合物的剂形，可以举出例如片剂、散剂、丸 剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、液体制剂、糖衣剂、长效制剂、糖浆 剂、混悬剂、乳剂、糖片剂、舌下剂、粘贴剂、口腔内崩解剂(片)、 吸入剂、直肠注射剂、软膏剂、贴布剂、胶带剂、滴眼剂，可以使 用普通的制剂助剂根据常规方法来制造。
上述药物组合物可以根据制剂技术领域中惯用的方法、例如日 本药典记载的方法等来制造。以下，详细说明制剂的具体制造方 法。
例如，将(2S，3R，4S)-HIL调制成口服用制剂时，加入赋形 剂、以及根据需要的粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭 剂等后，通过常规方法制成例如片剂、散剂、丸剂、颗粒剂、胶囊 剂、栓剂、溶液剂、糖衣剂、长效制剂或糖浆剂等。作为赋形剂， 可以举出例如乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤 维素等，作为粘合剂，可以举出例如聚乙烯醇、聚乙烯基醚、乙基 纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、西黄蓍胶、明胶、虫胶、羟丙基 纤维素、羟丙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮等，作为崩解剂，可以举出 例如淀粉、琼脂、明胶粉末、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、柠 檬酸钙、糊精、果胶等，作为润滑剂，可以举出例如硬脂酸镁、滑 石、聚乙二醇、二氧化硅、氢化植物油等，作为着色剂，可以使用 允许添加到医药品中的着色剂，作为矫味矫臭剂，可以使用可可 粉、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、龙脑、桂皮粉等。当然可以对上述 片剂或颗粒剂包裹糖衣、明胶衣以及根据需要进行适当其他的包 衣。
调制注射剂时，根据需要添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、保 存剂等，根据常规方法制成皮下、肌肉内、静脉内注射剂。
另外，如上所述，(2S，3R，4S)-HIL可以用作糖尿病的预防和 /或治疗剂，也可以与通常使用的其他糖尿病治疗剂、糖尿病并发症 的预防和/或治疗剂联合使用。所谓通常所用的糖尿病治疗剂、糖尿 病并发症的预防和/或治疗剂，可以举出例如胰岛素制剂、胰岛素衍 生物、胰岛素样作用剂、胰岛素分泌促进剂、胰岛素抵抗性改善 剂、双胍类制剂、糖异生抑制剂、糖吸收抑制剂、肾糖再吸收抑制 剂、β3肾上腺素受体激动剂、胰高血糖素样肽-1(7-37)、胰高血 糖素样肽-1(7-37)类似物、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、二肽 基肽酶IV抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、糖化终产物生成抑制剂、糖 原合成酶激酶-3抑制药、糖原磷酸化酶抑制药、抗高脂血症药、食 欲抑制剂、脂肪酶抑制药、降血压剂、外周循环改善药、抗氧化 剂、糖尿病性神经障碍治疗药等的1种或2种以上的组合或混合 物。
与(2S，3R，4S)-HIL组合使用的药剂可以混合制成单一制剂， 或者用另外的方法将其分别制剂化，或在一个容器中将用另外方法 将其分别制剂化得到的物质进行捆包的组合制剂(组、盒、包等)。
对联合用药时的给药形态没有特别限定，可以举出例如(1)作为 单一制剂的给药、(2)不同制剂在同一给药途径下的同时给药、(3)各 制剂在同一给药途径下的有时间差的给药、(4)不同制剂在不同给药 途径下的同时给药、(5)各制剂在不同给药途径下的有时间差的给药 等。
关于组合使用的药剂的具体化合物或应处置的优选疾病，列举 如下，但本发明的内容不限定于此。
作为胰岛素制剂，可以举出NPH、Lente、Ultralente、能经肺吸 收的胰岛素等。
所谓胰岛素衍生物，是指由胰岛素衍生的蛋白质或肽，保持胰 岛素作用的物质，可以举出例如赖脯(Lispro)、B10Asp、glargine 等。
所谓胰岛素样作用剂，是指一定程度上不依赖于胰岛素地发挥 促进细胞摄取糖的作用等胰岛素的生理作用，由此发挥降血糖作用 的胰岛素衍生物以外的制剂，可以举出例如胰岛素受体激酶刺激药 (例如L-783281、TER-17411、CLX-0901、KRX-613等)、钒 等。
所谓胰岛素分泌促进剂，是指作用于胰脏β细胞，增加向血液 中的胰岛素分泌，由此发挥降血糖作用的制剂，可以举出例如磺酰 脲剂(例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、乙酰磺环己脲、格列 齐特、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲(Glyburide)等)、美格列奈类 (例如那格列奈、瑞格列奈、米格列奈等)、磺酰脲剂和/或美格列奈类 以外的ATP敏感性钾通道抑制剂(例如BTS-67-582等)等。
所谓胰岛素抵抗性改善剂，是指通过增强胰岛素的目标组织中 的胰岛素作用来发挥降血糖作用的制剂，可以举出例如过氧物酶体 增殖药活化受体(PPAR)γ激动剂(例如吡格列酮、罗格列酮、曲格列 酮、环格列酮等噻唑烷二酮系化合物、或GI-262570、GW- 1929、JTT-501、YM-440等非噻唑烷二酮系化合物等)、PPARγ 拮抗剂(例如bisphenol A diglycidyl ether、LG-100641等)、PPARα 激动剂(氯贝特、苯扎贝特、克利贝特等Fibrate系化合物、或非 Fibrate系化合物等)、PPARα/γ激动剂(例如KRP-297等)、类视色 素X受体激动剂(例如LG-100268等)、类视色素X受体拮抗剂(例 如HX531等)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B抑制剂(例如PTP-112等) 等。
所谓双胍剂，是指通过肝脏中的糖异生抑制作用或组织中厌氧 的解糖促进作用或外周中的胰岛素抵抗性改善作用等，发挥降血糖 作用的制剂，可以举出例如二甲双胍、苯乙双胍、丁双胍等。
所谓糖异生抑制剂，是指主要通过抑制糖异生发挥降血糖作用 的制剂，可以举出例如胰高血糖素分泌抑制剂(例如M&B 39890A 等)、胰高血糖素受体拮抗剂(例如CP-99711、NNC-92-1687、L -168049、BAY27-9955等)、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂等。
所谓糖吸收抑制剂，是指通过抑制食物中所含的碳水化物在消 化道中的酶消化来抑制或延迟糖吸收到体内，由此发挥降血糖作用 的制剂，可以举出例如α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、伏格 列波糖、米格列醇等)、α-淀粉酶抑制剂(例如AZM-127等)等。
所谓肾糖再吸收抑制剂，是指抑制肾小管中糖的再吸收，由此 发挥降血糖作用的制剂，可以举出例如钠依赖性葡萄糖转运体抑制 剂(例如T-1095、根皮苷等)等。
所谓β3肾上腺素受体激动剂，是指刺激脂肪细胞中的β3肾上 腺素受体使脂肪酸氧化亢进，消耗能量，由此发挥肥胖症、高胰岛 素血症的改善作用的制剂，可以举出例如CL-316243、TAK-677 等。
作为胰高血糖素样肽-1(7-37)类似物，可以举出例如醋酸艾塞 那肽(exendin-4)、NN-2211等，作为胰高血糖素样肽-1受体激动 剂，可以举出例如AZM-134等，作为二肽基肽酶IV抑制剂，可以 举出例如NVP-DPP-728等。胰高血糖素样肽-1类似体、胰高血 糖素样肽-1受体激动剂、二肽基肽酶IV抑制剂和胰高血糖素样肽 -1是通过模拟或增强细胞中的胰高血糖素样肽-1的作用，发挥糖 尿病改善作用的制剂。
所谓醛糖还原酶抑制剂，是指优选用于处理糖尿病性并发症的 物质中、通过抑制醛糖还原酶来降低发生糖尿病性并发症的组织中 所确认的起因于持续高血糖状态的多元醇代谢途径亢进而过量蓄积 的细胞内山梨糖醇，可以举出例如依帕司他、托瑞司他、非达司 他、折那司他等。
所谓糖化终产物生成抑制剂，是指优选用于处置糖尿病性并发 症的物质中、通过抑制糖尿病状态中的因持续高血糖状态而大量生 成的糖化终产物来减轻细胞障碍的物质，上述糖尿病并发症预防和/ 或治疗剂也包括在该范畴内，与上述糖尿病并发症预防和/或治疗剂 联合使用时，除上述糖尿病并发症预防和/或治疗剂以外，可以举出 例如NNC-39-0028、OPB-9195等。
作为糖原合成酶激酶-3抑制药，可以举出例如SB-216763、 CHIR-98014等，作为糖原磷酸化酶抑制药，可以举出例如CP- 91149等。
作为抗高脂血症药，可以举出例如羟基甲基戊二酰辅酶A还原 酶抑制剂(例如普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀等)、 Fibrate系药剂(例如氯贝特、苯扎贝特、安妥明丙二醇酯等)、胆汁酸 排泄促进药等。
作为食欲抑制药，可以举出例如西布曲明、马吲哚等，作为脂 肪酶抑制药，可以举出奥利司他等。
作为降血压剂，可以举出例如血管紧张素转化酶抑制药(例如卡 托普利、阿拉普利等)、血管紧张素II受体拮抗药(例如坎地沙坦西 酯、缬沙坦等)、钙拮抗药(例如西尼地平、氨氯地平、尼卡地平 等)、利尿药(例如三氯噻嗪、安体舒通等)、交感神经阻断药(例如可 乐定、利血平等)等。
作为外周循环改善药，可以举出例如二十碳五烯酸乙酯等。
作为抗氧化剂，可以举出多元酸、丙丁酚等。
作为糖尿病性神经障碍治疗药，可以举出例如甲钴胺、盐酸美 西律等。
另外，(2S，3R，4S)-HIL作为食品添加物也是有用的。
含有(2S，3R，4S)-HIL的食品组合物作为糖尿病的预防和/或 治疗用食品有用。
本说明书中所用的“食品”是指所有食品，除包括所谓的健康食品 之外，也包括厚生劳动省的保健功能食品制度所规定的特定保健用 食品或营养功能食品，还包括膳食补充剂。
对本说明书中所记载的食品组合物的形态没有特别限定，只要 是能口服摄取的形态，可以为任一种形态。
例如，可以举出粉末、颗粒、片剂、硬胶囊、软胶囊、液体(饮 料、胶状饮料等)、糖果、巧克力等，均可以在该技术领域中通过自 体公知的方法来制造。
食品组合物中的(2S，3R，4S)-HIL的含量适当确定为所指示范 围的适当用量。
上述食品组合物可以根据需要使用其他食品添加剂。作为上述 食品添加剂，可以举出调整改良味道的果汁、糊精、环状寡糖、糖 类(果糖、葡萄糖等单糖类和多糖类)、酸味料、香料、抹茶粉末等， 以及改善质地的乳化剂、胶原、奶粉、增稠多糖类或琼脂等，以及 维生素类、蛋壳钙、泛酸钙、其他矿物类、王浆、蜂胶、蜂蜜、食 物纤维、落叶松蕈、壳多糖、壳聚糖、黄酮类、类胡萝卜素类、叶 黄素、中草药、软骨素、各种氨基酸等用作通常健康食品等的成分 的物质。
[实施例]
以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限 定于这些实施例。
(试验例)
[分析条件]
(1)1H-NMR：用Varian Mercury 300VX(300MHz)进行测定。
(2)LCMS：
(HPLC)：Hewlett Packard series 1100
柱：Symmetry(注册商标)C183.5μm 4.6×50mm
流动相：含有0.05％TFA的水和含有0.04％TFA的乙腈
梯度：含有0.04％TFA的乙腈以5分钟从5％直线增加到98％ 的条件
流速：2ml/分钟
柱温：30℃
检测：UV检测器(210nm～300nm)
(质谱)：使用Waters公司Micromass platform检测ESI与PDA。
实施例1：从Fenugreek种子中纯化(2S，3R，4S)-HIL
(工序1)4-羟基异亮氨酸粗制物(HIL粗制物)的提取
用研磨将5g Fenugreek种子磨碎，用50ml己烷脱脂。然后，用 50ml 70％乙醇水溶液浸渍一夜后，滤出残渣，用60ml 70％乙醇洗 涤。减压馏去滤液，得到HIL粗制物。
(工序2)用对硝基苯甲醛进行的缩醛胺化和有机溶剂提取
将上述得到的HIL粗制物和10ml 5％碳酸氢钠水溶液混合，加 入0.2g对硝基苯甲醛的3ml乙腈溶液，在25℃下搅拌一夜。减压馏 去乙腈后，用50ml乙酸乙酯(关东化学株式会社1级99％以上)洗涤 过量的醛。将所得的水层用1M柠檬酸水溶液中和，用乙酸乙酯提 取。将乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥，滤出 该干燥剂，得到缩醛胺体、(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2- (4-硝基苯基)-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的乙酸乙酯溶液。
MS(ESI)m/z 281[M+H]+
(工序3)脱缩醛胺化
在上述工序得到的(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4- 硝基苯基)-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的乙酸乙酯溶液中加入 0.1ml 50％羟胺水溶液，静置3天，滤取析出的结晶，得到30mg (2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸。本结晶中，用LCMS确认为单 峰，进而即使用1H-NMR也未看到杂质峰，确认为高纯度的(2S， 3R，4S)-HIL。
1H-NMR(300MHz，D2O)δ＝0.83(3H，d，J＝7.2Hz)，1.12(3H， d，J＝6.3Hz)，1.75-1.83(1H，m)，3.70(1H，m)，3.76(1H，d， J＝7.8Hz)
MS(ESI)m/z 148[M+H]+
实施例2：4-羟基异亮氨酸立体异构体混合物的用对硝基苯甲醛进行的缩醛胺化((2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-硝基苯基)-四氧-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的合成)
将0.4g(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸与(2R，3R，4S)-4- 羟基异亮氨酸的约1∶1混合物和10ml 5％碳酸氢钠水溶液混合，加 入0.41g对硝基苯甲醛的20ml乙腈溶液，搅拌一夜。减压馏去乙腈 后，用乙酸乙酯洗涤过量的醛。将所得的水层用1M盐酸水溶液中 和，用乙酸乙酯提取。将乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤后，用无水 硫酸镁干燥。滤出该干燥剂后，迅速减压馏去溶剂，得到0.3g(2R， 4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-硝基苯基)-四氢-2H-1，3 -噁嗪-4-甲酸(对应于(2S，3R，4S)-HIL的立体异构体)。所得的 固体中，用LCMS确认为单峰，进而即使用1H-NMR也未看到来 自对应于(2R，3R，4S)-HIL的立体异构体的峰。另外，所得的化 合物的绝对构型也由其NOESY光谱支持。
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ＝1.00(3H，d，J＝6.6Hz)，1.34 (3H，d，J＝6.0Hz)，1.45-1.58(1H，m)，3.47(1H，d，J＝ 10.5Hz)，3.60-3.70(1H，m)，5.39(1H，s)，7.76(2H，d，J＝ 8.7Hz)，8.23(2H，d，J＝8.7Hz)
MS(ESI)m/z 281[M+H]+
测定NOESY光谱的结果，观测到下述交叉峰。
即，确认所得的化合物是具有以下立体构型的(2R，4S，5R，6S) -5，6-二甲基-2-(4-硝基苯基)-四氢-2H-1，3-噁嗪-4- 甲酸。
实施例3：用羟胺进行的脱缩醛胺反应
将与实施例2进行相同操作得到的50mg(0.18mmol)(2R，4S， 5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-硝基苯基)-四氢-2H-1，3-噁 嗪-4-甲酸溶解在2ml乙酸乙酯中，加入0.01ml 50％羟胺水溶液， 搅拌2小时。滤取析出的结晶，得到7mg(2S，3R，4S)-4-羟基异 亮氨酸。所得的结晶中，用LCMS确认为单峰，进而即使用1H- NMR也未看到杂质峰，确认为高纯度的(2S，3R，4S)-4-羟基异 亮氨酸。
1H-NMR(300MHz，D2O)δ＝0.83(3H，d，J＝7.2Hz)，1.12(3H， d，J＝6.3Hz)，1.75-1.83(1H，m)，3.70(1H，m)，3.76(1H，d，J ＝7.8Hz)
MS(ESI)m/z 148[M+H]+
实施例4：用甲胺甲醇溶液进行的脱缩醛胺反应
使用0.014ml 40％甲胺甲醇溶液代替50％羟胺水溶液，基于实 施例3进行操作，由此可以得到4mg(2S，3R，4S)-HIL。所得的结 晶用LCMS确认为单峰，进而即使用1H-NMR也未看到杂质峰， 确认为高纯度的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸。
实施例5：用肼一水合物进行的脱缩醛胺反应
使用0.01ml肼一水合物代替50％羟胺水溶液，基于实施例3进 行操作，可以得到20mg(2S，3R，4S)-HIL。所得的结晶中，用 LCMS确认为单峰，进而即使用1H-NMR也未看到杂质峰，确认为 高纯度的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸。
实施例6：4-羟基异亮氨酸立体异构体混合物的用环己基醛进行的缩醛胺化((2R，4S，5R，6S)-2-环己基-5，6-二甲基-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的合成)
将0.1g(0.68mmol)(2S，3R，4S)-HIL和(2R，3R，4S)-HIL 的约3∶2混合物溶解在2.3ml 5％碳酸氢钠水溶液中，加入0.076g (0.68mmol)环己基醛的2.3ml乙腈溶液，搅拌一夜。减压馏去乙腈 后，用乙酸乙酯洗涤过量的醛。将所得的水层用2M柠檬酸水溶液中 和，用乙酸乙酯提取。将乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤后，用无水 硫酸镁干燥。滤出干燥剂后，迅速减压馏去溶剂，得到0.067g(2R， 4S，5R，6S)-2-环己基-5，6-二甲基-四氢-2H-1，3-噁嗪 -4-甲酸。
1H-NMR(300MHz，D2O)δ＝1.06(3H，d，J＝6.6Hz)，1.07-1.40 (6H，m)，1.60-2.00(9H，m)，3.34(1H，d，J＝11.4Hz)，3.42- 3.50(1H，m)，4.24(1H，d，J＝6.6Hz)
MS(ESI)m/z 242[M+H]+
实施例7：用羟胺进行的(2R，4S，5R，6S)-2-环己基-5，6-二甲基-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的脱缩醛胺反应
将实施例6所得的0.067g(0.42mmol)(2R，4S，5R，6S)-2-环 己基-5，6-二甲基-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸溶解在3ml 甲醇中，加入0.017ml 50％羟胺水溶液，搅拌2小时。减压馏去溶剂 后，在所得的残渣中加入乙酸乙酯，滤取不溶的结晶，得到28mg (2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸。所得的结晶中，用LCMS确认为 单峰，即使用1H-NMR也未看到杂质峰，确认是高纯度的(2S， 3R，4S)-4-羟基异亮氨酸。
实施例8：HIL的立体异构体混合物的用苯甲醛进行的缩醛胺化((2R ，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-苯基-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的合成)
(工序1)用苯甲醛进行的缩醛胺化和有机溶剂提取
将0.1g(2S，3R，4S)-HIL和(2R，3R，4S)-HIL的约1∶1混 合物溶解在2.7ml 5％碳酸氢钠水溶液中，加入0.084g苯甲醛的 2.7ml乙腈溶液，搅拌一夜。减压馏去乙腈后，用乙酸乙酯(关东化学 株式会社1级99％以上)洗涤过量的醛。将所得的水层用1M柠檬酸 水溶液中和，用乙酸乙酯提取。将乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤 后，用无水硫酸镁干燥。滤出干燥剂，得到(2R，4S，5R，6S)-5， 6-二甲基-2-苯基-四氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸的乙酸乙酯 溶液。
(工序2)用催化加氢进行的脱缩醛胺反应
将乙酸乙酯层静置在室温下、开放体系中，以析出结晶的形式 得到12mg高纯度(1H-NMR和LCMS)的(2S，3R，4S)-HIL。进 而，通过滤取除去该结晶后，将滤液中的缩醛胺体按照以下所示的 操作，转化为(2S，3R，4S)-HIL。
减压馏去滤液中的溶剂，在残渣中加入水和甲醇的1∶2混合溶 剂、催化剂量的10％钯碳，用氢置换体系，搅拌一夜。滤出钯碳 后，通过减压浓缩和冻干，得到40mg(2S，3R，4S)-HIL。本冻干 品用LCMS确认为单峰。
实施例9：用各种醛进行的缩醛胺化
按照与实施例6所记载相同的方法得到以下的化合物。
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-苯基-四氢-2H-1，3 -噁嗪-4-甲酸
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ＝1.09(3H，d，J＝6.6Hz)，1.35 (3H，d，J＝6.3Hz)，1.63-1.78(1H，m)，3.53(1H，d，J＝ 10.8Hz)，3.68-3.74(1H，m)，5.47(1H，s)，7.40-7.44(3H，m)， 7.54-7.60(2H，m)
MS(ESI)m/z 236[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-吡啶基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ＝0.98(3H，d，J＝6.6Hz)，1.34 (3H，d，J＝6.3Hz)，1.42-1.58(1H，m)，3.45(1H，d，J＝ 10.8Hz)，3.60-3.68(1H，m)，5.31(1H，s)，7.59(2H，d，J＝ 4.8Hz)，8.54(2H，d，J＝4.8Hz)
MS(ESI)m/z 237[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-2-(4-氯苯基)-5，6-二甲基-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 270[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)-四氢 -2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 266[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-甲基苯基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 250[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-三氟甲基苯基)-四 氢-2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 304[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(4-氟苯基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 254[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-2-(4-氰基苯基)-5，6-二甲基-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 261[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-2-(2-氯苯基)-5，6-二甲基-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 270[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(2-硝基苯基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 281[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(3-硝基苯基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 281[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(2-噻吩基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 242[M+H]+
(2R，4S，5R，6S)-5，6-二甲基-2-(2-呋喃基)-四氢- 2H-1，3-噁嗪-4-甲酸
MS(ESI)m/z 226[M+H]+
产业上的可利用性
根据本发明的方法，可以有效且高收率地得到高纯度的(2S， 3R，4S)-4-HIL。所得的(2S，3R，4S)-4-HIL作为例如医药品 (糖尿病治疗剂等)、健康食品原料、化妆品原料等有用，进而作为各 种医药品的合成中间体也有用。
另外，本发明的方法作为(2S，3R，4S)-HIL的分离除去方法也 有用，可以从化合物的混合物中有效地除去(2S，3R，4S)-HIL。
本申请以在日本提出的日本专利申请2007-042711和日本专利 申请2007-144578为基础，其内容全部包含在本说明书中。另外， 本说明书中引用的专利文献和非专利文献通过引用的方式公开其全 部内容，并同程度地加入到本说明书中。