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1、(10)申请公布号 CN 102676535 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676535 A *CN102676535A* (21)申请号 201210178793.7 (22)申请日 2012.06.02 C12N 15/28(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C07K 14/525(2006.01) C12N 15/70(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市亚东新城区文苑 路 1 号 (72)发明人 张双全 田爱英 。
2、(74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 斑马鱼肿瘤坏死因子 14 的基因及其克隆方 法和重组应用 (57) 摘要 斑马鱼肿瘤坏死因子 14（TNFSF14/LIGHT） cDNA 及其克隆方法和重组应用， 涉及生物基因 工程领域。所述斑马鱼 LIGHTcDNA 的序列如 SEQIDNO.1所示。 其克隆方法如下 ： 提取斑马鱼脾 脏总 RNA 并进行逆转录 ； 设计兼并引物进行 PCR 扩增， 获得 708bp 的全长斑马鱼 LIGHTcDNA。斑马 鱼 LIGHT 的 cDNA 可通过现有基因工程的方法， 将 该基因的胞外功能区克隆连到 pE。
3、TSUMO 质粒中并 转到大肠杆菌 BL21(DE3) 中原核表达， 得到斑马 鱼SUMO-zsLIGHT融合蛋白。 重组 LIGHT 蛋白可开 发成预防和治疗鱼类免疫疾病的免疫增强剂和免 疫佐剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 斑马鱼肿瘤坏死因子 14 的 cDNA， 其特征在于它的序列如 SEQ ID NO.1 所示。 2. 一种权利要求 1 所述斑马鱼肿瘤坏死因子 14 的 cDNA。
4、 的克隆方法， 其特征在于包括 以下步骤 ： (1) 提取斑马鱼脾脏细胞的总 RNA， Transgen cDNA 逆转录试剂盒转录为第一链 cDNA ； (2) 根据人、 鼠及斑马鱼 LIGHT 基因的预测序列设计兼并引物 ： 正义寡核苷酸引物 ： zLIGHT-F ： 5 -ATGGCTTYADGTAACGTGTCV-3 反义寡核苷酸引物 ： zLIGHT-R ： 5 -TYAAATBATAAACAACCCWAA-3 (3) 应用 RT-PCR 方法， 以上述 zLIGHT-F 及 zLIGHT-R 为引物， 扩增出一段 cDNA 序列， 克隆入 pMD19-T 载体， 并对其碱基序列进行。
5、测定。 3. 斑马鱼肿瘤坏死因子 14， 其特征在于它的序列如 SEQ ID NO.2 所示。 4. 一种重组表达载体 pSUMO-zsLIGHT， 其特征在于是通过下述方法构建得到 ： 根据权 利要求 1 所述斑马鱼肿瘤坏死因子 14 的 cDNA 序列设计引物 A1、 A2， 进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 产物是序列如 SEQ ID NO.7 所示的斑马鱼 LIGHT 基因胞外功能区， 将 PCR 产物割胶回 收， 回收产物用Stu1和Hind 酶切， pET SUMO 载体只用Hind 酶切， T4 DNA Ligase 连接 酶切后的载体和 PCR 产物， 得到 pSUMO-z。
6、sLIGHT ； 所述引物 A1、 A2 序列分别如 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 所示。 5. 一种权利要求 1 所述斑马鱼肿瘤坏死因子 14 cDNA 的重组应用， 是通过基因工程方 法， 生产重组斑马鱼肿瘤坏死因子 14， 作为鱼类免疫增强剂。 权 利 要 求 书 CN 102676535 A 2 1/4 页 3 斑马鱼肿瘤坏死因子 14 的基因及其克隆方法和重组应用 技术领域 0001 本发明涉及生物基因工程领域， 具体涉及肿瘤坏死因子 14（TNFSF14 或 LIGHT） cDNA 及其克隆、 表达及蛋白纯化技术。 背景技术 0002 肿瘤坏死因子超家族 (T。
7、NFSF) 成员具有促进细胞生长、 分化或死亡的功能， 在淋 巴器官的形成， 免疫细胞的激活及维持机体的稳态方面发挥重要的生物学作用。近年来， 很多具有重要功能的 TNFSF 被发现， LIGHT 是肿瘤坏死因子家族第 14 个成员 (TNFSF14)， LIGHT 通过与其 3 个不同的受体 TR2 HVEM、 LTBR、 及 TR6 结合可发挥不同的生物学作用。 它可诱导部分肿瘤细胞的凋亡， 并能通过 CD28 非依赖的途径共刺激 T 淋巴细胞， 促进其生 长分化和细胞因子的分泌。LIGHT 还具有活化和诱导 DC 成熟的功能。在机体的自身免疫、 肿瘤免疫及某些疾病的发生、 发展中都起到重。
8、要的参与作用， 越来越多的研究表明， LIGHT 在自身免疫病、 移植物抗宿主病及抗肿瘤免疫中发挥重要的调节作用。自 1997 年 LIGHT 基 因被发现以来， 对于 LIGHT 基因克隆表达以及功能的研究主要集中在人和鼠， 目前还没有 关于此基因在低等脊椎动物中的研究。 0003 鉴于鱼类所处的进化地位以及水产养殖业的高速发展， 鱼类免疫系统日益为人所 关注。对鱼类免疫系统的研究不仅为高等生物免疫演化途径提供重要的参考， 同时也为日 趋严重的养殖鱼类的病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。 鱼类与哺乳动物在免疫器 官组成上不同， 鱼类没有骨髓和淋巴结， 肾脏和脾脏是其主要的免疫器官， 因此。
9、， 我们推测 与免疫相关的细胞因子 TNF 家族的成员在鱼类免疫中有重要作用。 0004 斑马鱼 （zebrafish） 是国际标准化组织认可的 5 种鱼类实验动物之一， 已经成为 发育生物学、 遗传学、 毒理学等研究常用的模式生物。根据 GenBank、 EMBL 和 DDBJ 国际三大 主要核酸序列数据库搜索结果得知， 目前人、 鼠 LIGHT cDNA 已被克隆， 并分别已在 GenBank 数据库中申请了序列号， 而至今模式生物斑马鱼 LIGHT 的 cDNA 还未被克隆出来， 关于斑马 鱼 LIGHT基因 （zebrafish LIGHT， 简称zLIGHT） 的研究在整个国内外还处。
10、于完全空白状态。 因此， 我们对于斑马鱼基因的研究有重要意义。 发明内容 0005 本发明针对现有技术的不足， 提供一种从斑马鱼中获得肿瘤坏死因子 14（LIGHT） cDNA， 并提供斑马鱼 LIGHT（zLIGHT） cDNA 的克隆方法及重组技术。 0006 本发明所述斑马鱼肿瘤坏死因子 14 （LIGHT） cDNA， 序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0007 本发明的斑马鱼 LIGHT cDNA 的克隆方法如下 ： (1) 提取斑马鱼脾脏细胞的总 RNA， Transgen cDNA 逆转录试剂盒转录为第一链 cDNA ； (2) 根据人、 鼠及斑马鱼 LIGHT 基因的预测。
11、序列设计兼并引物 ： 正义寡核苷酸引物 ： zLIGHT-F ： 5 -ATGGCTTYADGTAACGTGTCV-3 （SEQ ID NO.3） 反义寡核苷酸引物 ： zLIGHT-R ： 5 -TYAAATBATAAACAACCCWAA-3 （SEQ ID NO.4） 说 明 书 CN 102676535 A 3 2/4 页 4 (3) 应用 RT-PCR 方法， 以上述 zLIGHT-F 及 zLIGHT-R 为引物， 扩增出一段 cDNA 序列， 克隆入 pMD19-T 载体， 并对其碱基序列进行测定。 0008 本发明还公开了斑马鱼肿瘤坏死因子 14， 它的氨基酸序列如 SEQ ID。
12、 NO.2 所示。 0009 斑马鱼肿瘤坏死因子LIGHT的cDNA可通过现有基因工程的方法， 将该基因的胞外 功能区克隆连到 pETSUMO 质粒中并转到大肠杆菌 BL21(DE3) 中原核表达， 本发明通过多次 预表达摸索出了合适的表达条件， 超声破碎后收集上清 Ni+亲和纯化， 梯度洗脱之后我们得 到斑马鱼 SUMO-zsLIGHT 融合蛋白。并进行 Western-blot 鉴定。 0010 进一步地， 公开了一种重组表达载体 pSUMO-zsLIGHT， 是通过下述方法构建得到 ： 根据所述斑马鱼肿瘤坏死因子 14 的 cDNA 序列设计引物 A1、 A2， 进行 PCR 扩增， 得。
13、到的 PCR 产物是序列如 SEQ ID NO.7 所示的斑马鱼 LIGHT 基因胞外功能区， 将 PCR 产物割胶回收， 回 收产物用Stu1和Hind 酶切， pET SUMO 载体只用Hind 酶切， T4 DNA Ligase 连接酶切 后的载体和 PCR 产物， 得到 pSUMO-zsLIGHT ； 所述引物 A1、 A2 序列分别如 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.5 所示。 0011 在克隆出斑马鱼肿瘤坏死因子 14 （LIGHT） cDNA 后， 可通过基因工程方法， 生产重 组斑马鱼肿瘤坏死因子 14， 作为鱼类免疫增强剂。 0012 本发明中得到的斑马鱼 L。
14、IGHT cDNA 序列为 708bp， 比预测序列多出了 75 个碱基， 与已知的 LIGHT 序列比对， 本发明得到的斑马鱼 LIGHT 核苷酸序列与人的 LIGHT 序列相似 率为 44.76， 预测序列与人的 LIGHT 相似率为 37.87， 将该序列放到斑马鱼的基因组序 列比对， 与人和鼠相同， 都含有四个外显子三个内含子， 因此确定我们的序列是正确的。 0013 多次实验结果比对之后我们确定了斑马鱼全长LIGHT cDNA （708bp， SEQ ID NO.1） 序列， 其开放阅读框如图1所示。 对该基因的进一步研究表明 ： 该基因主要表达在鱼类免疫 器官中， 包括脾脏、 肾脏。
15、。 其中脾脏表达水平较高， 肾脏次之 ； 因此我们推测LIGHT基因是斑 马鱼体内重要的免疫因子。本发明将推动 LIGHT 基因或经修饰过的 LIGHT 基因表达的蛋白 在相关鱼类免疫疾病机理中的研究， 以斑马鱼作为人类疾病模型研究该蛋白在免疫疾病中 的作用。重组 LIGHT 蛋白有望开发成预防和治疗鱼类免疫疾病的免疫增强剂和免疫佐剂。 附图说明 0014 图 1 zLIGHT 的 cDNA 序列及对应的蛋白序列。 0015 图 2 pSUMO-zsLIGHT 表达载体的构建。 0016 图 3 是 SDS-PAGE 分析 SUMO-zsLIGHT 在大肠杆菌中的表达 ： 其中 1 重组蛋白非。
16、 诱导 ； 2 重组蛋白诱导 20h ； 3 纯化后蛋白 SUMO-zsLIGHT ； 4 western blotting 鉴定结果。 具体实施方式 0017 在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。 0018 下面结合具体的制备实施例和应用实施例， 并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解， 这些实施例只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0019 在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物， 均在首次出现时标明， 其后所用相同引物， 均以首次标明的内容相同。 说 明 书 C。
17、N 102676535 A 4 3/4 页 5 0020 实施例 1 斑马鱼购自南京大学模式动物遗传中心。 0021 （1） 引物设计 ： 根据人、 鼠及斑马鱼 LIGHT 基因的预测序列设计兼并引物 ； zLIGHT-F ： 5 -ATGGCTTYADGTAACGTGTCV-3 （SEQ ID NO.3） ， zLIGHT-R ： 5 -TYAAATBATAAACAACCCWAA-3 （SEQ ID NO.4） 。 0022 （2） 提取总 RNA ： 应用 RNA 抽提试剂 （TIANGEN） 按照其操作手册提取斑马鱼脾脏细 胞的总 RNA， 并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，。
18、 紫外分光光度计测定其浓 度。Transgen cDNA 逆转录试剂盒转录为第一链 cDNA。 0023 （3） RT-PCR ： 以上述 zLIGHT-F 及 zLIGHT-R 为引物进行 PCR 扩增， 得到 708bp 的片 段。 0024 逆转录 在 DEPC 处理的 1.5ml Eppendorf 管中依次加入总 RNA 抽提物 3l， Oligo d(T)18 (0.5g/l) 1l， 2TS Reaction Mix 10l， DEPC 水 5l,TransScript RT/RI Enzyme Mix 1l ； 42 C 孵育 30min,85 C 加热 5min 失活 Tra。
19、nsScript RT。将得到的 cDNA 分装后 -20 C 保存。 0025 PCR 利用逆转录所得模板进行 PCR， 体系为 25l， 10mol/L 上、 下游引物各 1l， 2.5mmol/L dNTP 2l， 10DreamTaq buffer 2.5l， cDNA 模板 1.5l， DreamTaq酶 0.3l， 加 ddH2O 16.7l。反应程序为 ： 94 C 5min，（94 C 30s， 58 C 30s， 72 C 1min） ， 30 个循环， 最后 72 C 延伸 10min。反应完成后将产物于 1% 琼脂糖凝胶中电泳分 离， 用胶回收试剂盒回收得到约 708bp。
20、 的 DNA 条带， 克隆入 pMD19-T 载体 (TaKaRa,Japan)， 经含 Amp 抗生素 （50mg/ml） 的琼脂糖平板筛选转化子， 挑出阳性克隆送往上海英骏测序公 司进行碱基序列测定， 其开放阅读框如 SEQ ID NO.1 所示， 编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0026 实施例 2 ： 斑马鱼 LIGHT 重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达 ： 根据实施例 1 中获得的斑马鱼 LIGHT 基因设计引物 A1、 A2。其中 Al 的 5 端具有Stu1 酶切位点， A2 的 5 端具有Hind 酶切位点， 以斑马鱼脾脏组织提取的 RNA。
21、 逆转录到得的第 一链 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， PCR 产物为斑马鱼 LIGHT 基因胞外功能区， 序列如 SEQ ID NO.7所示， 它是斑马鱼LIGHT基因 （SEQ ID NO.1） 3 端的 501个碱基 ； 之后将PCR产物割胶 回收， 回收产物用Stu1和Hind 酶切， pET SUMO 载体 （Novagen,USA） 只用Hind 酶切， T4 DNA Ligase 连接， 得到图 2 所示的重组质粒 pETSUMO-zsLIGHT（z 代表 zebrafish ； s 代表 该基因胞外可溶功能区 soluble） ， 连接产物转化E.coliDH5a 中， 。
22、获得含 pETSUMO-zsLIGHT 重组菌株。挑选阳性重组菌株， 扩大培养提取 pETSUMO-zsLIGHT 重组质粒， 转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 挑选阳性菌株诱导表达。引物序列如下 ： A1: TTACCGTCTGTACTCAGTCAAAG （SEQ ID NO.5） A2: CCCAAGCTTTTAAATCATAAACAACCCAAAG （SEQ ID NO.6） 经 SDS-PAGE 检测 ( 图 3) 显示， 在大约 37 kDa 处为目的蛋白， 经 IPTG 诱导 20 h 达到 最大表达量。 说 明 书 CN 102676535 A 5 4/4 页 6 002。
23、7 重组目的蛋白的 Ni+ 亲和纯化 ： IPTG 浓度 0.2 mmol/ L 低温 （16） 诱导含有重组载体 pETSUMO-zsLIGHT 的大肠杆菌 表达菌株 BL21（DE3） 20 小时后， 4收菌， 冰上超声破碎 （160W， 工作 4s， 暂停 8s， 共 99 次） 表达菌体， 4， 13， 000g， 20min 离心超声破碎液后， 弃沉淀， 留上清过 Ni+-NTA 柱。简要过 程是 ： Binding Buffer （20 mmol/L Imidazole， 0.5 mol/L NaCl， 20 mmol/L Tris HCl， pH 8.0） 平衡 Ni+-NTA 。
24、柱后， 上样含可溶性重组蛋白的上清， 先用 Washing buffer（20 mmol/ L Imidazole， 0.5 mol/L NaCl， 20 mmol/L Tris HCl， pH 8.0） 洗去杂蛋白， 再用不同浓度 的咪唑 Tis HCl 洗脱， 目的蛋白在洗脱浓度为 250 mmol/L Imidazole， 0.5 mol/L NaCl， 20 mmol/L Tris HCl， pH 8.0 洗脱下来。分管收集洗脱目的蛋白， PBS 透析除盐。SDS-PAGE 检 测各收集管蛋白纯度和紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图 3（条带 3） 所示， 表达得到的 目的蛋白经 Ni+。
25、柱亲和纯化得到纯度达 95% 的活性目的蛋白。 0028 Western 印记分析 ： Western-blot 中所用一抗为鼠抗 His6单抗， 二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠 IgG。 其简要步骤是 ： 将样品先进行 SGS-PAGE， 然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜 （NC 膜） 上， 用记号笔标记蛋白 marker 各条带， 然而依次经 5脱脂奶粉室温封闭 1h， 与一 抗孵育 1h， 与 HRP 标记的二抗 IgG 孵育 1h， 每步完成后均严格洗膜， 最后加 TMB 避光显色。 结果如图 3（条带 4） 所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。 0029 实施例 3 将实施例。
26、 1 获得的斑马鱼 LIGHT cDNA 通过现有基因工程方法， 生产重组斑马鱼 LIGHT 蛋白， 将该蛋白注射到斑马鱼体内， 作为人类相关免疫疾病模型的研究， 例如， 往成鱼体内 注射细菌和胚胎浸没感染的方法均可使斑马鱼感染细菌， 有效建立相应的细菌发病机理研 究模型， 海分枝杆菌感染的斑马鱼体内的肺结核肉芽肿和人类一样出现干酪样坏死， 该模 型可能在肺结核研究中发挥重要作用。 0030 按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术， 修饰斑马鱼 LIGHT 基因并用于所 述研究和生产。 说 明 书 CN 102676535 A 6 1/5 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102676535 A 7 2/5 页 8 0003 序 列 表 CN 102676535 A 8 3/5 页 9 0004 序 列 表 CN 102676535 A 9 4/5 页 10 0005 序 列 表 CN 102676535 A 10 5/5 页 11 序 列 表 CN 102676535 A 11 1/2 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102676535 A 12 2/2 页 13 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102676535 A 13 。