一种大豆高效遗传转化方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102618573 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618573 A *CN102618573A* (21)申请号 201210085463.3 (22)申请日 2012.03.28 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 2 号 (72)发明人 朱保葛 杨瑞 周国安 李素坤 潘毅 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (。

2、54) 发明名称 一种大豆高效遗传转化方法 (57) 摘要 本发明公开了一种大豆高效遗传转化方法。 本发明提供的方法， 依次包括如下步骤 ： (1) 通过 基因枪轰击法将含有目的 DNA 的质粒导入大豆外 植体 ； (2) 通过农杆菌介导法将所述含有目的 DNA 的质粒导入完成步骤 (1) 的大豆外植体。所述外 植体可为胚尖外植体。本发明还保护一种制备转 基因大豆的方法， 依次包括如下步骤 ： (I) 将出发 大豆进行以上任一所述的转化 ； (II) 依次进行共 培养、 恢复培养、 筛选培养和生根培养， 得到转基 因大豆。本发明提供的方法能够克服大豆遗传转 化效率低的难题， 为大豆分子生物学和。

3、基因工程 育种等研究提供有力工具。本发明还具有取材方 便、 周期短、 简便易行等优点， 必将为推动大豆基 因工程育种的发展奠定基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种大豆转化方法， 依次包括如下步骤 ： (1) 通过基因枪轰击法将含有目的 DNA 的质粒导入大豆外植体 ； (2) 通过农杆菌介导法将所述含有目的 DNA 的质粒导入完成步骤 (1) 的大豆外植体。 2. 如权利要求 1 所。

4、述的方法， 其特征在于 ： 所述外植体为胚尖外植体， 具体为萌动种子 胚尖外植体。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述大豆为 K06-82 大豆或科丰 28 号 大豆。 4. 权利要求 1 至 3 中任一所述方法在制备转基因大豆中的应用。 5. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述大豆为 K06-82 大豆或科丰 28 号大豆。 6. 一种制备转基因大豆的方法， 依次包括如下步骤 ： (I) 将出发大豆进行权利要求 1 至 3 中任一所述的转化 ； (II) 依次进行共培养、 恢复培养、 筛选培养和生根培养， 得到转基因大豆。 7.如权利要求6所述的。

5、方法， 其特征在于 ： 所述大豆为K06-8大豆2或科丰28号大豆。 权 利 要 求 书 CN 102618573 A 2 1/6 页 3 一种大豆高效遗传转化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种大豆高效遗传转化方法。 背景技术 0002 大豆 Glycine max(L)Merr. 是重要的经济作物和油料作物， 它的遗传转化研究 一直受到学者们的广泛关注， 而主要瓶颈问题是转化效率低。 0003 现有的大豆遗传转化方法包括农杆菌介导法、 电击法、 PEG 转化法、 基因枪法、 花粉 管通道法等， 比较成熟的是基因枪介导的体细胞胚转化法和农杆菌介导的子叶节转化法。 0004 1988 年 。

6、Christou 等首次将基因枪法应用于大豆愈伤组织的遗传转化， 但未获得 再生植株， 同年 McCabe 等利用基因枪法转化大豆芽分生组织， 获得了转基因植株， 但大都 为嵌合体。 此后， 基因枪轰击法主要应用于大豆未成熟胚或体胚悬浮细胞系， 能稳定获得转 基因植株， 但转化效率都较低， 而且存在再生植株周期长和转基因植株败育等缺点。 0005 1998 年 Hinchee 等首次报告了根癌农杆菌 (Agrobacterium tumfaciens) 介导法 成功转化大豆的事例， 后来不少学者采用这种方法进行大豆子叶节转化研究， 都获得了转 基因植株， 但转化效率都比较低， 而且嵌合体较多。。

7、 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种大豆高效遗传转化方法。 0007 本发明提供了一种大豆高效遗传转化方法， 依次包括如下步骤 ： 0008 (1) 通过基因枪轰击法将含有目的 DNA 的质粒导入大豆外植体 ； 0009 (2) 通过农杆菌介导法将所述含有目的 DNA 的质粒导入完成步骤 (1) 的大豆外植 体。 0010 所述大豆外植体可为胚尖外植体， 具体可为大豆成熟种子胚尖外植体 ( 大豆萌动 种子胚尖外植体 )。 0011 所述大豆成熟种子胚尖外植体的制备方法依次包括如下步骤 ： (1) 将灭菌后的 成熟大豆种子在无菌水中室温浸泡 24 小时 ； (2) 在无菌条件下去掉种皮，。

8、 取下胚轴连同 刚萌动的胚尖 ； (3) 将下胚轴连同刚萌动的胚尖摆放在预培养培养基上， 胚尖垂直向上， 25 -28培养 24 小时， 然后去除原叶 ( 叶原基， 发育后形成真叶 )， 得到外植体 ( 即大豆 成熟种子胚尖外植体 ) ； 所述预培养的光照条件为 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗。 0012 所述预培养培养基具体为含 3.5mg/L 6- 苄氨基嘌呤和 30g/L 蔗糖的 MS-B5固体 培养基。 0013 所述大豆具体可为 K06-82 大豆或科丰 28 号大豆。 0014 所述基因枪轰击法中， 基因枪轰击的参数具体可为 ： 金粉直径大小。

9、为 1.0m， 真 空度 26 28 英寸汞柱， 氦气压力为 1100psi， 轰击距离为 6cm， 每皿轰击 2 次 ( 第一次轰击 后平皿旋转 90再轰击第二次 )， 每次轰击 1g 所述含有目的 DNA 的质粒。具体可采用 说 明 书 CN 102618573 A 3 2/6 页 4 Bio-Rad PDS1000/He 基因枪。 0015 所述农杆菌介导法具体可为 ： 将完成步骤 (1) 的大豆外植体在重组农杆菌菌悬液 中 28黑暗条件下振荡培养 20 小时 ； 所述重组农杆菌是将所述含有目的 DNA 的质粒导入 农杆菌得到的重组农杆菌。 所述农杆菌具体可为农杆菌GV3101。 所述重。

10、组农杆菌菌悬液具 体可为 OD600nm 0.45-0.5 的菌悬液。所述重组农杆菌菌悬液具体可通过如下方法制备 ： 将 所述重组农杆菌重悬于培养基丁， 得到重组农杆菌菌悬液。所述培养基丁为含 6mg/L6- 苄 氨基嘌呤、 200M 乙酰丁香酮、 30g/L 蔗糖和 10g/L 葡萄糖的 1/2MS-B5液体培养基。乙酰 丁香酮可以增加转染效率。 0016 以上任一所述方法均可用于制备转基因大豆。 0017 所述大豆具体可为 K06-82 大豆或科丰 28 号大豆。 0018 本发明还保护一种制备转基因大豆的方法， 依次包括如下步骤 ： 0019 (I) 将出发大豆进行以上任一所述的遗传转化。

11、 ； 0020 (II) 依次进行共培养、 恢复培养、 筛选培养和生根培养， 得到转基因大豆。 0021 所述大豆具体可为 K06-82 大豆或科丰 28 号大豆。 0022 所述共培养具体可为在共培养培养基上， 22暗培养 4 天。所述共培养培养基具 体可为含 6mg/L 6- 苄氨基嘌呤、 0.154g/L 二硫苏糖醇、 0.2g/L Na2S3O3、 1mg/L AgNO3、 1g/ LL- 半胱氨酸、 200M 乙酰丁香酮、 30g/L 蔗糖和 10g/L 葡萄糖的 1/2MS-B5固体培养基。乙 酰丁香酮可以增加转染效率。所述共培养培养基可以防止褐化和提高转化效率。 0023 所述恢。

12、复培养具体可为在恢复培养基上， 25-28培养6-7天(光照条件 ： 16小 时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 )。所述恢复培养基具体可为含 300mg/L 头 孢霉素和 30g/L 蔗糖的 1/2MS-B5固体培养基。 0024 所述筛选培养可依次包括如下步骤 ： 0025 筛选培养基甲上， 25 -28培养 14 天 ( 光照条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 ) ； 所述筛选培养基甲具体可为含 0.7mg/L 草甘膦、 300mg/L 头 孢霉素和 30g/L 蔗糖的 1/2MS-B5固体培养基 ； 0026 继。

13、代后转移到筛选培养基乙上， 25-28培养14天(光照条件 ： 16小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 ) ； 所述筛选培养基乙具体可为含 0.8mg/L 草甘膦、 300mg/L 头孢霉素和 30g/L 蔗糖的 1/2MS-B5固体培养基 ； 0027 继代后转移到筛选培养基丙上， 25 -28培养 ( 光照条件 ： 16 小时光照、 光照 强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 ) 至芽长约 3cm(14 天左右 ) ； 所述筛选培养基丙具体可为 含 0.9mg/L 草甘膦、 300mg/L 头孢霉素和 30g/L 蔗糖的 1/2MS-B5固体培养基。

14、。 0028 所述生根培养具体可为在生根培养基上 25 -28培养 14-20 天 ( 光照条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 )， 然后敞开瓶口练苗 3-5 天 ； 所述生根培 养基具体可为含 300mg/L 头孢霉素、 0.1mg/L 草甘膦和 30g/L 蔗糖的 1/2MS-B5固体培养基。 0029 本发明提供了一种基因枪与农杆菌共同介导的大豆胚尖复合转化方法。 本发明的 方法中， 先将含有目的基因的质粒通过基因枪对胚尖外植体的顶端分生组织进行轰击， 该 步骤不仅能导入一些质粒， 而且微弹轰击对大豆胚尖能造成众多微创伤， 利于农杆菌侵染。 。

15、微创伤能分泌一种可溶性酚类化合物， 此化合物可作为农杆菌感染的诱导信号， 激活农杆 菌增加侵染机会。然后， 再用含有质粒的农杆菌侵染， 又可将更多质粒导入受体组织中， 这 说 明 书 CN 102618573 A 4 3/6 页 5 样的复合转化能够大幅度提高转化效率。 再经过共培养、 恢复培养、 筛选培养及生根培养等 环节， 可以高效得到转基因植株。本发明提供的方法能在一定程度上解决长期困扰大豆遗 传转化中过分依赖受体基因型和转化效率低的难题， 不仅为其他不易转化的作物进行遗传 转化提供了借鉴， 也为大豆分子生物学和基因工程育种等研究提供了有力工具。本发明还 具有取材方便、 周期短、 简便易。

16、行等优点， 必将为推动大豆基因工程育种的发展奠定基础。 附图说明 0030 图 1 为实施例 1 的复合遗传转化整个流程中各步骤的照片。 0031 图 2 为实施例 1 中 PCR 鉴定 bar 基因的结果。 0032 图 3 为实施例 1 中 PCR 鉴定 gus 基因的结果。 0033 图 4 为实施例 1 中 GUS 染色的结果。 0034 图 5 为实施例 1 中用 bar 基因检测试纸条鉴定 PAT 蛋白的结果。 具体实施方式 0035 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂， 如无特。

17、殊说明， 均为 自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果 取平均值。转化率 ： 转基因植株数量占基因枪轰击和 / 或农杆菌侵染胚尖外植体总数的百 分率。K06-82( 即科豆 2 号 ) 大豆 ： 安徽同丰种业有限公司。科丰 28 号大豆 ： 安徽同丰种 业有限公司。双元载体 pCAMBIA3301( 又称 pCAMBIA3301 质粒 ) ： TRANSGEN 公司 ； 双元载体 pCAMBIA3301含有bar基因(编码PAT蛋白)和gus基因(编码GUS蛋白)。 农杆菌GV3101 ： 购自 TRANSGEN 公司。 0036 1/2MS-B5液。

18、体培养基的制备方法 ： 取 1/2MS 大量元素、 MS 微量元素、 MS 铁盐和 B5 有机元素， 溶于水并定容至 1L。 0037 1/2MS-B5固体培养基 ： 在 1/2MS-B5液体培养基的基础上， 每升添加 2g 植物凝胶 ( 购自 Sigma， 货号 P8169)。 0038 MS-B5固体培养基的制备方法 ： 取 MS 大量元素、 MS 微量元素、 MS 铁盐以及 B5有机 元素， 溶于水并定容至 1L。 0039 MS 大量元素 ： 硝酸钾 1900mg/L、 硝酸铵 1650mg/L、 磷酸二氢钾 170mg/L、 七水硫酸 镁 370mg/L 和二水氯化钙 440mg/L。

19、。 0040 1/2MS 大量元素 ： MS 大量元素各组分的浓度均减半。 0041 MS 微量元素 ： 碘化钾 0.83mg/L、 硼酸 6.2mg/L、 硫酸镁 22.3mg/L、 硫酸锌 8.6mg/L、 钼酸钠 0.25mg/L、 五水硫酸铜 0.025mg/L 和六水氯化钴 0.025mg/L。 0042 MS 铁盐 ： 乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L 和七水硫酸亚铁 27.8mg/L。 0043 B5有机元素 ： 盐酸硫胺素 ( 维生素 B1)10mg/L、 盐酸吡哆醇 ( 维生素 B6)1mg/L、 烟 酸 1mg/L 和肌醇 100mg/L。 0044 实施例 1、 K06。

20、-82 大豆的复合遗传转化 0045 一、 外植体的获得 0046 1、 灭菌 说 明 书 CN 102618573 A 5 4/6 页 6 0047 取表面光滑无病斑的K06-82大豆饱满成熟种子， 在密闭容器(含氯气)中放置16 小时。 0048 2、 浸泡 0049 取完成步骤 1 的大豆， 在无菌水中室温浸泡 24 小时。 0050 3、 取完成步骤 2 的大豆， 在超净工作台上去掉种皮， 将下胚轴连同刚萌动的胚尖 与两片子叶剥离， 取下胚轴连同刚萌动的胚尖。 0051 4、 将步骤 3 获得的下胚轴连同刚萌动的胚尖摆放在预培养培养基上， 胚尖垂直向 上， 见图 1A， 25培养 24。

21、 小时 ( 光照条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时 黑暗 )， 然后去除原叶， 得到外植体。 0052 预培养培养基 ： 含 3.5mg/L 6- 苄氨基嘌呤 (6-BA) 和 30g/L 蔗糖的 MS-B5固体培 养基。 0053 二、 基因枪轰击 0054 1、 将完成步骤一的外植体摆放在新的预培养培养基上， 密集摆放成直径约 2.5cm 圆形， 见图 1B。 0055 2、 基因枪轰击 0056 在超净工作台上将完成步骤 1 的培养皿进行基因枪轰击， 按照 Bio-Rad PDS1000/ He 基因枪使用说明书进行。基因枪轰击的参数 ： 金粉直。

22、径大小为 1.0m， 真空度 26 28 英寸汞柱， 氦气压力为 1100psi， 轰击距离为 6cm， 每皿轰击 2 次 ( 第一次轰击后平皿旋转 90再轰击第二次 )， 每次轰击 1g pCAMBIA3301 质粒。 0057 三、 农杆菌侵染 0058 1、 将 pCAMBIA3301 质粒导入农杆菌 GV3101， 得到重组农杆菌。 0059 2、 将步骤1的重组农杆菌重悬于培养基丁， 使OD600nm0.45-0.5， 即为重组农杆菌 菌悬液。 0060 培养基丁 ： 含6mg/L 6-苄氨基嘌呤、 200M乙酰丁香酮、 30g/L蔗糖和10g/L葡萄 糖的 1/2MS-B5液体培养。

23、基。 0061 3、 将完成步骤二的外植体置于步骤2的重组农杆菌菌悬液中(见图1C)， 28黑暗 条件下振荡培养 20 小时。 0062 四、 共培养 0063 取完成步骤三的外植体， 用无菌滤纸吸干菌液， 然后转移到共培养培养基， 22暗 培养 4 天， 见图 1D。 0064 共培养培养基 ： 含 6mg/L 6- 苄氨基嘌呤、 0.154g/L 二硫苏糖醇、 0.2g/L Na2S3O3、 1mg/L AgNO3、 1g/L L-半胱氨酸、 200M乙酰丁香酮、 30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B5 固体培养基。 0065 共培养后的外植体的 GUS 染色图见图 4A， 胚。

24、尖显示为蓝色， 即表达了 GUS 蛋白。 0066 五、 恢复培养 0067 取完成步骤四的外植体， 用无菌水洗净， 然后转移到恢复培养基中， 25 -28培 养 6-7 天 ( 光照条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 )， 见图 1E。 0068 恢复培养基 ： 含 300mg/L 头孢霉素和 30g/L 蔗糖的 1/2MS-B5固体培养基。 0069 六、 筛选培养 说 明 书 CN 102618573 A 6 5/6 页 7 0070 1、 取完成步骤五的外植体， 转移到筛选培养基甲， 25 -28培养 14 天 ( 光照条 件 ： 16 小。

25、时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 )， 见图 1F。 0071 筛选培养基甲 ： 含0.7mg/L草甘膦、 300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS-B5固 体培养基。 0072 2、 将完成步骤1的外植体继代， 转移到筛选培养基乙， 25-28培养14天(光照 条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 )。 0073 筛选培养基乙 ： 含0.8mg/L草甘膦、 300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS-B5固 体培养基。 0074 3、 将完成步骤2的外植体继代， 转移到筛选培养基丙， 25-28培养(。

26、光照条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 ) 至芽长约 3cm(14 天左右 )。 0075 筛选培养基丙 ： 含0.9mg/L草甘膦、 300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS-B5固 体培养基。 0076 芽的 GUS 染色结果见图 4B。可以观察到表达了 GUS 蛋白。 0077 七、 生根培养 0078 切下步骤六的芽， 转移到生根培养基 ( 见图 1G)， 25 -28培养 14-20 天 ( 光照 条件 ： 16 小时光照、 光照强度 150mol m-2s-1， 8 小时黑暗 )， 见图 1H( 根长到足够健壮 )， 然 后时。

27、敞开瓶口练苗 3-5 天 ( 见图 1I)。 0079 生根培养基 ： 含300mg/L头孢霉素、 0.1mg/L草甘膦和30g/L蔗糖的1/2MS-B5固体 培养基。 0080 八、 获得转基因植株 0081 将完成步骤七的苗转移至营养土， 温室中正常培养(温度25-28， 自然光照)， 温室培养 14 天的照片见图 1J。 0082 九、 转基因植株的鉴定 0083 取温室培养 14 天的植株叶片， 分别进行如下鉴定 ： 0084 1、 提取基因组 DNA， 用 F1 和 R1 组成的引物对 PCR 鉴定 bar 基因。 0085 F1( 序列表的序列 1) ： 5 -GCACCATCGT。

28、CAACCACTAC-3 ； 0086 R1( 序列表的序列 2) ： 5 -TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3 。 0087 F1 和 R1 的靶序列为约 440bp 的 bar 基因片段。 0088 鉴定结果见图 2。图 2 中， M 为 Marker， 1 为正对照 ( 双元载体 pCAMBIA3301)， 2 为 负对照 ( 未进行遗传转化的 K06-82 大豆 )， 3 为空白对照 ( 水 )， 4 至 17 为进行遗传转化后 得到的植株 ) ； 箭头标注目的片段。 0089 2、 提取基因组 DNA， 用 F2 和 R2 组成的引物对 PCR 鉴定 CaMV35S 启动。

29、子和 gus 基 因。 0090 F2 ： 5 -AAGGAAGGTGGCTCCTACAA-3 ； 0091 R2 ： 5 -AATATCTGCATCGGCGAACT-3 。 0092 F2 和 R2 的靶序列为约 669bp 的 CaMV35S 启动子和 GUS 基因片段。 0093 鉴定结果见图 3。图 3 中， M 为 Marker， 1 为正对照 ( 双元载体 pCAMBIA3301)， 2 为 负对照 ( 未进行遗传转化的 K06-82 大豆 )， 3 为空白对照 ( 水 )， 4 至 17 为进行遗传转化后 得到的植株 ) ； 箭头标注目的片段。 说 明 书 CN 10261857。

30、3 A 7 6/6 页 8 0094 3、 GUS 染色。 0095 结果见图 4C， 显示蓝色斑点， 即表达了 GUS 蛋白。 0096 4、 提取总蛋白， 用 bar 基因检测试纸条 ( 购自 EnviroLogix， 货号 AS013LS) 鉴定 PAT 蛋白， 结果见图 5。图 5 中， 1 为正对照 (PAT 蛋白 )， 2 为负对照 ( 水 )， 3 为未进行遗传 转化的 K06-82 大豆， 4 为进行遗传转化后得到的植株 )。 0097 如果待测植株步骤 1 和步骤 2 均鉴定为阳性， 则待测植株为遗传转化成功的转基 因植株。步骤 3 和步骤 4 仅为抽样验证， 且阳性判断结果。

31、均与步骤 1 和步骤 2 一致。 0098 进行三次重复试验， 转化率分别高达 21.68、 24.15和 20.88， 平均值为 22.24 1.70。 0099 对比例 1、 基因枪轰击法转化对比例 0100 除了中间跳过步骤三， 其它均同实施例 1。 0101 三次试验的平均转化率为 8.78 1.22。 0102 对比例 2、 农杆菌介导法转化对比例 0103 除了中间跳过步骤二， 其它均同实施例 1。 0104 三次试验的平均转化率为 7.94 1.27。 0105 实施例 2、 科丰 28 号大豆的遗传转化 0106 用科丰 28 号大豆代替 K06-82 大豆， 其它同实施例 1。

32、。 0107 三次试验的平均转化率为 18.48 1.50。 0108 对比例 3、 基因枪轰击法转化对比例 0109 除了中间跳过步骤三， 其它均同实施例 2。 0110 三次试验的平均转化率为 13.86 1.31。 0111 对比例 4、 农杆菌介导法转化对比例 0112 除了中间跳过步骤二， 其它均同实施例 2。 0113 三次试验的平均转化率为 9.78 1.25。 说 明 书 CN 102618573 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 102618573 A 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102618573 A 10 2/3 页 11 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618573 A 11 3/3 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 102618573 A 12 。