技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种四甲基吡嗪的提取纯化方法，尤其涉及一种从发酵液中分离纯化四甲基吡嗪的生产工艺。
背景技术
四甲基吡嗪，分子式为C8H12N2，分子量136.20，熔点84-86℃，沸点190℃，是一种常见的杂环含氮化合物，广泛存在于食品原料、加工食品和酒精饮料中，被认为是一类重要的香味化合物，具有烘烤、花生、榛子和可可的香气，常用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配。除了作为食品风味添加剂的用途，四甲基吡嗪作为中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分，已被证明具有治疗心脑血管疾病的药理作用，并对顺铂诱导的氧化应激、细胞凋亡和肾毒性有预防作用。随着药理研究的深入，现在已经作为一种新型的钙离子拮抗剂广泛应用于临床，是循环、中枢神经、呼吸及其它系统相关疾病的大宗用药，广泛应用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾小球疾病等的治疗。
四甲基吡嗪的生产方法可分为生物合成法、直接从植物中提取法和化学合成法三种。截止目前，已有相当量的文献及专利文件报道利用美拉德反应和Strecker降解化学法合成吡嗪类化合物，然而，化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高；虽然化学合成得到的吡嗪的价格远低于前者，但是消费者更倾向于使用“天然”或“生物合成”吡嗪。直接从中药材川芎根茎中提取四甲基吡嗪的方法经常面临川芎植物原材料供应有限的问题，而且，四甲基吡嗪在川芎根茎中的含量较低(约0.075％)导致提取工艺成本较高而很难实现大规模生产。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物工程的手段生产四甲基吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点而广受消费者关注。
中国专利文件CN101445786A(申请号：200810235366.1)公开了一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法，该菌株能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆饼粉为底物，以大量积累内源前体来提高四甲基吡嗪的产量。解决了微生物发酵生产四甲基吡嗪中产物浓度低、需外源添加前体和前体利用率低的问题。以蔗糖豆饼粉为底物时37℃条件下摇瓶培养120h可获得4.08g/L的四甲基吡嗪。
中国专利文件CN 101955980A(申请号：201010238685.5)公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，具体地说是一种微生物利用还原糖发酵积累前体乙偶姻、以及乙偶姻 和氨经非酶促反应合成四甲基吡嗪的两步法生产工艺，属于生物工程技术领域。所述微生物为枯草芽孢杆菌(CCTCCNO：M208157)、地衣芽孢杆菌(CGMCCNO：3961)地衣芽孢杆菌(CGMCCNO：3962)以及地衣芽孢杆菌(CGMCCNO：3963)中任一一株，上述菌株利用还原糖发酵获得生物量并积累内源前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应合成四甲基吡嗪。优点如下：1.获得较高的菌体量，且乙偶姻积累量得以有效提高(38-44g/L)；2.高浓度的内源前体乙偶姻和氨在适宜的条件下可快速反应生成四甲基吡嗪(16-20g/L)；3.内源乙偶姻的积累以及原位发酵环境，显著提高了前体的利用率(40.3％)。
中国专利文件CN 102618587A(申请号：201210089617.6)公开了以酒糟为原料，利用微生物发酵生产生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法，属于生物工程技术领域。在经酸度调节的新鲜酒糟中补充适量葡萄糖0～100g/kg，加入枯草芽孢杆菌(CCTCCNO：M208157)或地衣芽孢杆菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株培养的种子培养物后37℃发酵1～3天，能够大量产生生物香料乙偶姻。在此基础上，还可通过向上述发酵产物中添加铵盐来转化生产另一种生物香料四甲基吡嗪。突出的优点是利用酒糟为原料，通过是否添加铵盐来有选择的控制生产生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪的方法，既可有选择的获得不同高附加值的生物香料，又防止了酒糟污染环境，提升了酒糟的利用价值。
中国专利文件CN 105002115A(申请号：201510450768.3)公开了一种地衣芽孢杆菌及用其制备的大曲和该大曲的制备方法，该菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.M2015224，并将其制备发酵菌液后，作为功能性菌液，再将功能性菌液接种在制曲原料上进行发酵处理，获得大曲产品，该工艺流程短，容易操作，并且获得的大曲与传统大曲相比，其四甲基吡嗪的含量提高至了9倍多。
尽管，上述专利文件公开的方法对于提高发酵液中四甲基吡嗪的浓度有所帮助，但是从发酵液中提纯分离得到高纯度四甲基吡嗪没有详细报道。而且在中国专利文件CN 102618587A中，描述的四甲基吡嗪从固态发酵培养物中提取，提出采用水或乙醇浸泡，超声1h，然后采离心或过滤后，进行上清液减压蒸馏，收集馏分进行冷却结晶得到湿晶体，然后进行冷冻干燥得到粉末状晶体，整个提取过程采用的超声、冷冻干燥及减压蒸馏能耗大，不适宜规模化应用，而且连续性受到限制，过程中四甲基吡嗪挥发易受损失，从而造成较低的四甲基吡嗪回收率。
发明内容
针对现有发酵生产四甲基吡嗪的提纯难点和缺陷，本发明提供一种四甲基吡嗪的提取纯化方法。
术语说明：
本发明所提取的发酵液为枯草芽孢个杆菌或地衣芽孢杆菌发酵所得含有四甲基吡嗪的发酵液；其中，枯草芽孢个杆菌或地衣芽孢杆菌为现有菌株，发酵过程均按现有技术。
本发明的技术方案如下：
一种四甲基吡嗪的提取纯化方法，包括步骤如下：
(1)将发酵液升温至70-80℃，离心分离菌体，得上清液；将上清液维持温度70-80℃进行活性碳脱色；
(2)将脱色后的上清液过滤，得到四甲基吡嗪透析液；
(3)将四甲基吡嗪透析液过滤后再经反渗透滤膜浓缩，得渗透液；
(4)将渗透液进行冷却结晶，降温至10-15℃时，离心分离四甲基吡嗪晶体，然后再将四甲基吡嗪晶体于70-90℃溶解后进行冷却重结晶，离心分离，得到高纯度四甲基吡嗪。
根据本发明，优选的，步骤(1)中将发酵液升温所用设备为管式换热器，进一步优选为内外夹套换热器，为长弯管外加套管的蛇形弯曲组合，材质为316L不锈钢，换热面积以使发酵液温度从30℃升温至80℃计算。夹套中加热用料为90-95℃的热水；
优选的，离心分离菌体所用设备为离心机，材质为316L不锈钢，进一步优选碟片式离心机，离心转速为7000-10000转/分钟，进一步优选转速为8000转/分钟；
优选的，脱色过程是采用活性炭密封脱色，进一步优选的，所述活性碳为医药级活性炭粉末，活性碳用量为上清液体积的1-1.5％；脱色过程的压力为0.1-0.2MPa，脱色时间为20-40min，脱色后调整pH为7.0-8.0。
根据本发明，优选的，步骤(2)中过滤过程为：先用板框过滤器过滤，然后进行超滤去除杂质蛋白，最后进行纳滤进一步去除杂质；
进一步优选的，板框过滤器过滤时，在板框过滤器中铺设硅藻土，所述的硅藻土为粒径在28-68μm的粗硅藻土与粒径在0.02-2μm的细硅藻土按3:1质量比的混合；铺设粗细搭配硅藻土，能够延长过滤时间，增加过滤澄清度，防止因过滤物质的粘度过高而阻塞滤布空隙；板框过滤器过滤板的材质为聚四氟乙烯；
进一步优选的，超滤过程的超滤膜截留分子量为1000Dalton；
进一步优选的，纳滤过程的纳滤膜截留分子量为200Dalton。
根据本发明，优选的，步骤(3)中浓缩的温度为60-70℃，浓缩前溶液为浓缩后溶液体积的2.5-3倍，反渗透浓缩后取浓缩相进行降温结晶，反渗透膜最大操作压力不超过0.8MPa。反渗透滤膜的主要作用为浓缩渗透液。
根据本发明，优选的，步骤(4)中降温速度以5-10℃/h降温，直至结晶析出。冷却结晶在结晶罐中进行，结晶罐为立式搅拌结晶罐，结晶罐带夹层，离心用离心机进行，所述离心机为布袋式三足离心机。
本发明从枯草芽孢个杆菌或地衣芽孢杆菌发酵所得含有四甲基吡嗪的发酵液中分离提纯四甲基吡嗪，凡是经枯草芽孢个杆菌或地衣芽孢杆菌发酵含有四甲基吡嗪的发酵液均可作为本发明方法的原料。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的分离提纯方法四甲基吡嗪的纯度高，高达99％以上，提纯效率高，高达88％以上。
2、本发明方法适应于微生物发酵制备四甲基吡嗪的产业化提取制备，本发明方法自动化程度高，设备利用率高，过程简单，损失少，杂质去除率高，制备的产品纯度和回收率都较传统的方法有很大的提高。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例中所用原料均为常规原料，所用设备均为常规设备。
其中：发酵液为参照中国专利文件CN 102618587A公开的方法得到的发酵液。
活性碳为医药级活性炭粉末。
管式换热器为内外加套换热器，为长管套管弯曲组合，材质为316L不锈钢，换热面积以使发酵液温度从30℃升温至80℃计算；
离心分离菌体所用设备为碟片式离心机，材质为316L不锈钢，离心转速为7000-10000转/分钟；
脱色罐为密封耐压发酵罐，耐受压力为0.2MPa，发酵罐带有泄压口，泄压口带有循环水冷却回流装置；
板框过滤器为铺设有硅藻土的板框过滤器，硅藻土为粒径在30-40μm的粗硅藻土与粒径在1-2μm的细硅藻土按3:1质量比的混合；板框过滤器过滤板的材质为聚四氟乙烯；
超滤系统所用超滤膜截留分子量为1000Dalton，纳滤所用纳滤膜截留分子量为200Dalton；
结晶罐为立式搅拌结晶罐，结晶罐带夹层，结晶后所用的离心机为布袋式三足离心机。
实施例1
一种四甲基吡嗪的提取纯化方法，包括步骤如下：
(1)将发酵液经过管式换热器换热后，升温至70℃，经卫生级离心泵泵入离心机，离心分离菌体后，得上清液；将上清液进入带有回流管的活性炭脱色罐，密封脱色30min，维持温度70-80℃；活性碳用量为上清液体积的1％；脱色过程的压力为0.1-0.12MPa，脱色脱色后调整pH为7.0-8.0；
(2)将步骤(1)脱色后的上清液经板框过滤器过滤后，进入缓冲罐，然后进入超滤系 统，过滤除去杂蛋白后，进一步通过纳滤去除杂质后，获得四甲基吡嗪透析液；
(3)将步骤(2)中四甲基吡嗪透析液于60-65℃浓缩后再经反渗透滤膜浓缩后，得渗透液，取渗透后浓相，浓缩倍数为2.5倍
(4)将步骤(3)中渗透液进入冷却结晶罐中进行冷却结晶，以10℃/h的速率降温至15℃时，离心分离四甲基吡嗪晶体，然后再将四甲基吡嗪晶体于80℃溶解后进行冷却重结晶，离心分离，得到高纯度四甲基吡嗪。
本实施例得到的四甲基吡嗪纯度为99.1％，提纯效率为89.4％，达到医药级纯度要求。
实施例2
一种四甲基吡嗪的提取纯化方法，包括步骤如下：
(1)将发酵液经过管式换热器换热后，升温至80℃，经卫生级离心泵泵入离心机，离心分离菌体后，得上清液；将上清液进入带有回流管的活性炭脱色罐，密封脱色40min，维持温度80℃；活性碳用量为上清液体积的1.5％；脱色过程的压力为0.12-0.15MPa，脱色脱色后调整pH为7.0-8.0；
(2)将步骤(1)脱色后的上清液经板框过滤器过滤后，进入缓冲罐，然后进入超滤系统，过滤除去杂蛋白后，进一步通过纳滤去除杂质后，获得四甲基吡嗪透析液；
(3)将步骤(2)中四甲基吡嗪透析液于70-75℃浓缩后再经反渗透滤膜浓缩后，得渗透液；浓缩液浓相浓缩倍数达到3倍
(4)将步骤(3)中渗透液进入冷却结晶罐中进行冷却结晶，以5℃/h的速率降温至10℃时，离心分离四甲基吡嗪晶体，然后再将四甲基吡嗪晶体于70℃溶解后进行冷却重结晶，离心分离，得到高纯度四甲基吡嗪。
本实施例得到的四甲基吡嗪纯度为99.2％，提纯效率为88.2％，纯度达到医药级产品要求。
实施例3
一种四甲基吡嗪的提取纯化方法，包括步骤如下：
(1)将发酵液经过管式换热器换热后，升温至75℃，经卫生级离心泵泵入离心机，离心分离菌体后，得上清液；将上清液进入带有回流管的活性炭脱色罐，密封脱色20min，维持温度75℃；活性碳用量为上清液体积的1.2％；脱色过程的压力为0.15-0.19MPa，脱色脱色后调整pH为7.0-8.0；
(2)将步骤(1)脱色后的上清液经板框过滤器过滤后，进入缓冲罐，然后进入超滤系统，过滤除去杂蛋白后，进一步通过纳滤去除杂质后，获得四甲基吡嗪透析液；
(3)将步骤(2)中四甲基吡嗪透析液于55-60℃浓缩后再经反渗透滤膜浓缩后，得渗透 液；浓缩液浓相浓缩倍数达到2倍；
(4)将步骤(3)中渗透液进入冷却结晶罐中进行冷却结晶，以8℃/h的速率降温至12℃时，离心分离四甲基吡嗪晶体，然后再将四甲基吡嗪晶体于90℃溶解后进行冷却重结晶，离心分离，得到高纯度四甲基吡嗪。
本实施例得到的四甲基吡嗪纯度为99.05％，提纯效率为88.67％，达到医药级产品要求。
对比例
一种四甲基吡嗪的提取纯化方法，包括步骤如下：
(1)将发酵液经过管式换热器换热后，升温至75℃，经卫生级离心泵泵入离心机，离心分离菌体后，得上清液；将上清液进入带有回流管的活性炭脱色罐，密封脱色20min，维持温度75℃；活性碳用量为上清液体积的1.2％；脱色过程的压力为0.1MPa，脱色脱色后调整pH为5.0-6.0；
(2)将步骤(1)脱色后的上清液经板框过滤器过滤后，进入缓冲罐，然后进入超滤系统，过滤除去杂蛋白后，进一步通过纳滤去除杂质后，获得四甲基吡嗪透析液；
(3)将步骤(2)中四甲基吡嗪透析液于50-55℃浓缩后再经反渗透滤膜浓缩后，得渗透液；浓缩液浓相浓缩倍数达到2.5倍；
(4)将步骤(3)中渗透液进入冷却结晶罐中进行冷却结晶，以8℃/h的速率降温至12℃时，离心分离四甲基吡嗪晶体，然后再将四甲基吡嗪晶体于90℃溶解后进行冷却重结晶，离心分离，得到高纯度四甲基吡嗪。
本实施例得到的四甲基吡嗪纯度为97％，提纯效率为65.8％，达到化学纯产品要求。