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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610318802.6 (22)申请日 2016.05.12 (71)申请人 青岛大学 地址 266000 山东省青岛市宁夏路308号 (72)发明人 王春波姜启晓王龙源陈雪红 (74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理 事务所(普通合伙) 11411 代理人 郑自群 (51)Int.Cl. C07D 305/08(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 (R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(。
2、R,E)-1-羟基 十五烷-4-烯-1-基) 氧杂环-3-基)二十四烷酸 胺及其制备方法 (57)摘要 本发明公开的一种(R)-2-羟基-N-(2S, 3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂 环-3-基)二十四烷酸胺， 具有式(I)所示结构。 该 结构能够有效地调节血脂、 预防动脉粥样硬化和 防止冠心病， 并且该化合物的制备方法简单， 药 物价格低廉， 对ACAT有选择性抑制作用。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 105859658 A 2016.08.17 CN 105859658 A 1.一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十。
3、五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基) 二十四烷酸胺， 其特征在于， 具有式(I)所示结构： 2.如权利要求1所述的具有式(I)结构的(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十 五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)将牛菜置于圆底烧杯中， 加入甲醇， 收集醇提取液， 过滤， 浓缩成膏状物； 2)将步骤1)得到的膏状物加水， 得到混悬液； 3)分别将石油醚、 氯仿加入到步骤2)所述的混悬液中， 分别得到石油醚提取液和氯仿 提取液， 将所述石油醚提取液和所述氯仿提取液提取液进行浓缩成稠膏， 再加入糊精， 减压 干燥，。
4、 即得。 3.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤1)中牛菜中加入第一甲醇， 浸泡18 30h后， 加热回流46h， 收集醇提取液A； 再向剩余的药渣中加入第二甲醇， 加热回流4 6h， 收集醇提取液B； 所述第一甲醇和所述第二甲醇的质量浓度、 用量相同。 4.如权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述牛菜的质量与所述第一甲醇的体积 比为(812kg)： (3545L)。 5.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤3)中石油醚、 氯仿的提取次数均独 立地选自24次， 所述混悬液、 所述石油醚、 所述氯仿与所述第一甲醇的体积比为(5.5 6.5)： (5.56.5)：。
5、 (5.56.5)： (3545)。 6.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述牛菜与所述糊精的质量比为(30 40)： (0.20.3)。 7.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述加压干燥温度为5070。 8.化合物， 其包含具有式(I)所示结构的可药用盐。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105859658 A 2 (R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1- 基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及预防动脉粥样硬化领域， 尤其涉及一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2- (R,E)-1。
6、-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺及其制备方法。 背景技术 0002 心血管疾病位列当前威胁人类健康的三大疾病， 即心血管疾病、 肿瘤和传染性疾 病之首， 而动脉粥样硬化又是心血管疾病的最重要的病理学基础之一， 是引起心肌梗塞、 脑 梗塞以及冠心病等心脑血管疾病死亡的主要原因， 与许多疾病的发生发展都有关系。 防治 动脉粥样硬化是防治心血管疾病的根本性措施。 研制抗动脉硬化疫苗， 将有助于抑制动脉 硬化的发生与发展， 有助于降低心肌梗塞、 脑梗塞的发病率， 减少冠心病的死亡率， 减少这 些疾病对人类的危害。 但是现有预防预防动脉动脉粥样硬化的药物价格较贵， 对于我国来 。
7、说百姓来经济负担较重。 发明内容 0003 有鉴于此， 本发明提供一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4- 烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺及其制备方法， 能够有效预防动脉动脉粥样硬化， 且 成本低。 0004 本发明的技术方案是这样实现的： 0005 一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3- 基)二十四烷酸胺， 具有式(I)所示结构： 0006 0007 本发明还提供一种具有式(I)结构的(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基 十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3。
8、-基)二十四烷酸胺的制备方法， 包括以下步骤： 0008 1)将牛菜置于圆底烧杯中， 加入甲醇， 收集醇提取液， 过滤， 浓缩成膏状物； 0009 2)将步骤1)得到的膏状物加水， 得到混悬液； 0010 3)分别将石油醚、 氯仿加入到步骤2)所述的混悬液中， 分别得到石油醚提取液和 氯仿提取液， 将所述石油醚提取液和所述氯仿提取液提取液进行浓缩成稠膏， 再加入糊精， 减压干燥， 即得。 0011 优选地， 步骤1)中牛菜中加入第一甲醇， 浸泡1830h后， 加热回流46h， 收集醇 说明书 1/6 页 3 CN 105859658 A 3 提取液A； 再向剩余的药渣中加入第二甲醇， 加热回流。
9、46h， 收集醇提取液B； 所述第一甲醇 和所述第二甲醇的质量浓度、 用量相同。 0012 优选地， 所述牛菜的质量与所述第一甲醇的体积比为(812kg)： (3545L)。 0013 优选地， 步骤3)中石油醚、 氯仿的提取次数均独立地选自24次， 所述混悬液、 所 述石油醚、 所述氯仿与所述第一甲醇的体积比为(5.56.5)： (5.56.5)： (5.56.5)： (35 45)。 0014 优选地， 所述牛菜与所述糊精的质量比为(3040)： (0.20.3)。 0015 优选地， 所述加压干燥温度为5070。 0016 本发明还提供了一种化合物， 其包含具有式(I)所示结构的可药用盐。
10、。 0017 由上述技术方案可以看出， 本发明提供的一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R, E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺能够有效地调节血脂、 预防动脉 粥样硬化和防止冠心病， 并且该化合物的制备方法简单， 药物价格低廉， 对ACAT有选择性抑 制作用。 附图说明 0018 图1为实施例1制备得到的产物的ESI-MS图谱； 0019 图2为实施例1制备得到的产物的1H-NMR图谱； 0020 图3为实施例1制备得到的产物的13C-NMR图谱； 0021 图4为实施例1制备得到的产物的HSQC图谱； 0022 图5为实施例1制备得到的产物的HMB。
11、C图谱。 具体实施方式 0023 本发明公开了一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1- 基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺及其制备方法， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改 进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所述类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及引用已经通过较佳实施例进行了 描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行 改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0024 一种(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟。
12、基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3- 基)二十四烷酸胺， 具有式(I)所示结构： 0025 0026 本发明提供的上述结构的化合物， 能够有效地调节血脂、 预防动脉粥样硬化和防 止冠心病， 对ACAT有选择性抑制作用。 说明书 2/6 页 4 CN 105859658 A 4 0027 本发明还提供了一种具有式(I)所示结构的化合物的制备方法， 包括以下步骤： 0028 1)将牛菜置于圆底烧杯中， 加入甲醇， 收集醇提取液， 过滤， 浓缩成膏状物； 0029 2)将步骤1)得到的膏状物加水， 得到混悬液； 0030 3)分别将石油醚、 氯仿加入到步骤2)所述的混悬液中， 分别得到石油醚提取液。
13、和 氯仿提取液， 将所述石油醚提取液和所述氯仿提取液提取液进行浓缩成稠膏， 再加入糊精， 减压干燥， 即得。 0031 在本发明中， 向牛菜中加入甲醇， 收集醇提取液， 过滤浓缩成膏状物。 在本发明的 实施例中， 为了重复提取牛菜中的醇提取液， 牛菜中加入第一甲醇， 浸泡1830h后， 加热回 流46h， 收集醇提取液A； 再向剩余的药渣中加入第二甲醇， 加热回流46h， 收集醇提取液 B。 0032 需要说明的是， 第一甲醇和第二甲醇的质量浓度、 用量相同。 0033 在本发明中， 膏状物中加入水， 得到混悬液； 在本发明的实施例中， 混悬液的体积 一定， 加水量受混悬液体积的限制。 003。
14、4 在本发明中， 将石油醚、 氯仿加入到混悬液中， 分别得到石油醚提取液和氯仿提取 液， 将提取液浓缩成稠膏， 再加入糊精， 减压干燥， 即得具有式(I)结构的(R)-2-羟基-N- (2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺。 在本发明的 实施例中， 石油醚、 氯仿的提取次数均独立地选自24次， 混悬液、 石油醚、 氯仿与第一甲醇 的体积比为(5.56.5)： (5.56.5)： (5.56.5)： (3545)。 0035 牛菜的质量与第一甲醇的体积比为(812kg)： (3545L)。 0036 牛菜与糊精的质量比为(3040)： (0.。
15、20.3)。 0037 加压干燥温度为5070。 0038 本发明还提供了一种化合物， 其包含具有式(I)所示结构的可药用盐。 0039 本发明提供的(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧 杂环-3-基)二十四烷酸胺的制备方法， 制备得到的(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R,E)-1- 羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺的收率高， 纯度高， 且该结构的化合物 能够有效地调节血脂、 预防动脉粥样硬化和防止冠心病， 对ACAT有选择性抑制作用， 并且该 化合物的制备方法简单， 药物价格低廉， 制备成本低。 0040。
16、 为了进一步说明本发明， 以下结合实施例对本发明提供的一种(R)-2-羟基-N- (2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺及其制备方法 进行详细描述。 0041 以下实施例中所用的原料均为市售。 0042 实施例1 0043 取10kg牛菜， 置圆底烧瓶中， 加40000mL甲醇， 浸泡24h， 加热回流提取5小时， 收集 醇提液； 在剩余的药渣中再加入40000mL甲醇， 加热回流提取5小时， 取出醇提液， 合并两次 醇提液， 滤过， 回收甲醇并继续浓缩成膏状； 加入适量水， 使得混悬液的体积为6000mL； 再分 别加入石油醚、 氯仿对混。
17、悬液进行提取， 石油醚、 氯仿的萃取次数均3次， 每次石油醚和氯仿 的用量均为6000mL， 将萃取得到的提取物浓缩成稠膏， 加入0.069g糊精， 60减压干燥， 得 到产物。 0044 实施例2 说明书 3/6 页 5 CN 105859658 A 5 0045 取8kg牛菜， 置圆底烧瓶中， 加35000mL甲醇， 浸泡18h， 加热回流提取4小时， 收集醇 提液； 在剩余的药渣中再加入35000mL甲醇， 加热回流提取5小时， 取出醇提液， 合并两次醇 提液， 滤过， 回收甲醇并继续浓缩成膏状； 加入适量水， 使得混悬液的体积为5500mL； 再分别 加入石油醚、 氯仿对混悬液进行提取。
18、， 石油醚、 氯仿的萃取次数均2次， 每次石油醚和氯仿的 用量均为5500mL， 将萃取得到的提取物浓缩成稠膏， 加入0.06g糊精， 50减压干燥， 得到产 物。 0046 实施例3 0047 取12kg牛菜， 置圆底烧瓶中， 加45000mL甲醇， 浸泡30h， 加热回流提取6小时， 收集 醇提液； 在剩余的药渣中再加入45000mL甲醇， 加热回流提取6小时， 取出醇提液， 合并两次 醇提液， 滤过， 回收甲醇并继续浓缩成膏状； 加入适量水， 使得混悬液的体积为6500mL； 再分 别加入石油醚、 氯仿对混悬液进行提取， 石油醚、 氯仿的萃取次数均4次， 每次石油醚和氯仿 的用量均为65。
19、00mL， 将萃取得到的提取物浓缩成稠膏， 加入0.06g糊精， 70减压干燥， 得到 产物。 0048 实施例4 0049 取10kg牛菜， 置圆底烧瓶中， 加40000mL甲醇， 浸泡30h， 加热回流提取6小时， 收集 醇提液； 在剩余的药渣中再加入40000mL甲醇， 加热回流提取6小时， 取出醇提液， 合并两次 醇提液， 滤过， 回收甲醇并继续浓缩成膏状； 加入适量水， 使得混悬液的体积为6000mL； 再分 别加入石油醚、 氯仿对混悬液进行提取， 石油醚萃取3次， 氯仿的萃取2次， 每次石油醚的用 量为6000mL， 氯仿的用量为5500mL， 将萃取得到的提取物浓缩成稠膏， 加入。
20、0.09g糊精， 60 减压干燥， 得到产物。 0050 实施例5 0051 取10kg牛菜， 置圆底烧瓶中， 加40000mL甲醇， 浸泡24h， 加热回流提取6小时， 收集 醇提液； 在剩余的药渣中再加入40000mL甲醇， 加热回流提取6小时， 取出醇提液， 合并两次 醇提液， 滤过， 回收甲醇并继续浓缩成膏状； 加入适量水， 使得混悬液的体积为6000mL； 再分 别加入石油醚、 氯仿对混悬液进行提取， 石油醚萃取2次， 氯仿的萃取4次， 每次石油醚的用 量为6500mL， 氯仿的用量为6000mL， 将萃取得到的提取物浓缩成稠膏， 加入0.08g糊精， 60 减压干燥， 得到产物。 。
21、0052 1、 化合物结构的确定 0053 对实施例1得到的产物进行检测， 结果如下： 0054 采用ESI-MS、 1H-NMR、13C-NMR、 HSQC、 HMBC对实施例1得到的产物进行检测， 检测结 果为： 参见图1可以看出， 该化合物中存在664.6M+H+、 686.6M+H+、 664.6M+Na+、 662.5 M-H-、 698.6M+Cl-的准分子离子峰。 再结合图3、 4， 1HNMR和13CNMR图谱可以看出， 在1H NMR(C5D5N,600MHz)图谱中， :8.50(1H,d,J7.2Hz,N-H),5.44(2H,m,H-7,8),4.77(1H,m, H-。
22、2),4.64(1H,dd,J7.8,4.2Hz,H-2 ),4.51(1H,t,J8.4Hz,Ha-1),4.31(1H,m,H-4), 4.13(1H,m,H-3),3.91(1H,t,J8.4Hz,Hb-1),2.22(1H,m,Ha-3 ),2.04(2H,m,H-9),2.01 (2H,m,H-10),2.00(1H,m,Hb-3 ),1.75(2H,m,H-4 ),1.72(2H,m,H-6),1.67(1H,m,Ha-5), 1.56(1H,m,Hb-5),1.29(m,长链CH2),0.84(6H,t,J7.2,CH32)。 13C-NMR(C5D5N,150MHz) :175。
23、.4(C-1 ),130.9(C-7),130.2(C-8),85.9(C-3),74.5(C-4),72.4(C-2 ),71.5(C-1), 51.7(C-2),35.5(C-3 ),33.7(C-6),32.8(C-9),32.8(C-10),26.3(C-5),25.7(C-4 ),14.2 说明书 4/6 页 6 CN 105859658 A 6 (CH3)。 1HNMR谱中 1.211.32的强的质子信号、 0.84处的2个端甲基质子信号以及13C NMR谱中 22.832.0的碳信号提示含两个长链脂肪烷基； 信号 8.50(1H,d,J7.2Hz,N- H)、 175.4(CON。
24、H2)、 51.7(CH-NH)和 4.77(1H,m)以及四个连氧碳信号 85.9、 74.5、 72.4、 71.5显示有酰胺键和四个连氧碳的存在。 以上数据表明， 该化合物为梢氨醇类的神经酰胺， 相对分子质量为663， 分子式为C42H81O4N， 不饱和度为3。 0055 参见图4、 图5可知， 在HSQC谱上， 质子信号 4.64(1H,dd,J7.8,4.2Hz,H-2 )与碳 信号 72.4(C-2 )相关， 其在HMBC谱上与羰基碳信号 175.4(C-1 )和 35.5(C-3 )有远程相 关， 表明酰基部分为 -OH脂肪酰链。 综合分析HSQC、 HMBC谱， 发现除了碳链。
25、的长度有差别外， 两者长链酸部分的氢谱和碳谱数据基本相同， 但长链碱部分差别较大。 C-1由61.9变为 71.5， 向低场位移了9.6ppm； C-3由72.8变为 85.9， 向低场位移了13.1ppm。 结合分子式的3 个不饱和度， 确定该化合物长链碱的1， 3位脱去一分子水环合成环氧丙烷的结构。 考虑到生 源途径和神经酰胺类化合物的立体位阻， 确定其中手性碳的绝对构型为2S,3S,4R,2 R。 在 HMBC谱中， 观测到质子信号 4.13(1H,m,H-3)与碳信号 26.3(C-5)相关， 4.31(1H,m,H-4)与 碳信号33.7(C-6)相关， 结合HSQC图谱， 确定1.。
26、72(2H,m,H-6)、 1.67(1H,m,Ha-5)和1.56(1H, m,Hb-5)的归属。 1.72(2H,m,H-6)、 1.67(1H,m,Ha-5)和1.56(1H,m,Hb-5)均与双键烯碳有远 程相关， 故双键的位置应该在长链碱的78位上。 根据双键质子的峰型为多重峰和邻双键 的碳信号 值为33.7(C-6),32.8(C-9)， 可以确定双键的构型为E型。 0056 长链碱和长链酸长度的确定： 化合物2mg溶于8ml甲醇中， 加入1g盐酸， 85水浴回 流8h。 在水浴上将甲醇挥干， 加入5ml水， 滴加5氢氧化钠溶液至水溶液呈碱性， 用石油醚 (3ml)萃取3次， 合并。
27、萃取液， 减压除去石油醚， 用ESI-MS检测， 显示水解后碎片的分子离子 加氢峰m/z298.1(M+1)。 0057 水解过程如下： 0058 0059 综合以上分析和化学反应结果， 可知， 实施例1制备得到的化合物为(R)-2-羟基- N-(2S,3S)-2-(R,E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺， 结构为 0060 按照上述测试过程对实施例25的产物进行检测， 检测结果与实施例1相同。 0061 2、 对实施例1得到的式(I)的化合物进行提取率(提取率产物的质量/牛菜的质 说明书 5/6 页 7 CN 105859658 A 7 量100)的测定， 提。
28、取率为0.48。 0062 3、 对ACAT的影响 0063 胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一合成胆固醇酯的酶， 在细胞和生物体胆固 醇代谢平衡中起非常重要的作用， ACAT合成的胆固醇酯主要以脂滴形式储存于胞浆中。 0064 RAW264.7细胞以细胞数2105/孔铺于24孔板， 于37、 5CO2条件下过夜培养后， 换为无血清DMEM培养基(100 L/孔)。 将细胞分为空白对照组(不加Ox-LDL和待测样品)、 模 型组(加入80 gmL-1的Ox-LDL和100 gmL-1的Ac-LDL)， 加药组(加入80 gmL-1的Ox-LDL 和100 gmL-1的Ac-LDL以及5 。
29、g/ml实施例1制备得到的化合物)， 细胞贴壁后， 加入终浓度 为80 gmL-1的ox-LDL100 gmL-1的Ac-LDL到模型组和加药组， 作用24h后， 裂解细胞， 收 集蛋白。 BCA试剂盒进行蛋白定量。 ACAT检测试剂盒测定ACAT含量。 ACAT含量实测ACAT浓 度/总蛋白含量； ACAT抑制率(模型组含量-加药组含量)/(模型组含量-空白组含量) 100， 结果为： 细胞活性为92.78， ACAT抑制率为95.32。 0065 由上述结果可以看出， 本发明具有式(I)结构的(R)-2-羟基-N-(2S,3S)-2-(R, E)-1-羟基十五烷-4-烯-1-基)氧杂环-3-基)二十四烷酸胺， 能够对ACAT选择性抑制作用， 能够预防动脉粥样硬化。 0066 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 105859658 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 105859658 A 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 105859658 A 10 图5 说明书附图 3/3 页 11 CN 105859658 A 11 。