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1、(10)授权公告号 CN 102796751 B (45)授权公告日 2013.06.19 CN 102796751 B *CN102796751B* (21)申请号 201210298493.2 (22)申请日 2012.08.21 C12N 15/56(2006.01) C12N 9/44(2006.01) C12P 19/16(2006.01) (73)专利权人 广西科学院 地址 530007 广西壮族自治区南宁市西乡塘 区大岭路 98 号 (72)发明人 谢能中 黄日波 王青艳 秦艳 米慧芝 朱绮霞 申乃坤 朱婧 陆艳 曹薇 黎贞崇 陈东 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务所有。
2、 限责任公司 45104 代理人 黄永校 (54) 发明名称 一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体 Pul324 及其应用 (57) 摘要 一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体 Pul324， 其获得方法是利用现代酶工程技术对来源于长野 芽孢杆菌 （Pullulanibacillusnaganoensis）普 鲁兰酶氨基酸序列进行分子改造， 通过 PCR 方法 缺失原酶上的前 108 个氨基酸残基， 获得在大肠 杆菌宿主中能够有效分泌表达的突变体 Pul324。 将其插入 pET-22b(+) 中构建重组载体， 导入大肠 杆菌宿主进行分泌表达。该突变体基因比野生型 基因小， 有利于质粒的稳定。与原酶相比，。
3、 突变体 Pul324 在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达， 发 酵液上清的酶活提高为原来的 24 倍， 胞内酶活则 提高了 40%。采用本发明能够提高宿主的普鲁兰 酶分泌表达量， 表达产物能够提高淀粉的水解效 率。 (51)Int.Cl. 审查员 张丽玮 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 (10)授权公告号 CN 102796751 B CN 102796751 B *CN102796751B* 1/1 页 2 1. 一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体基因 pul324， 其特征在于，。
4、 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的普鲁兰酶突变体基因 pul324 编码的蛋白质， 其特征在于， 其 氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 3. 根据权利要求 2 所述的普鲁兰酶突变体基因 pul324 编码的蛋白质在淀粉水解过程 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102796751 B 2 1/4 页 3 一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体 Pul324 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体是一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体 Pul324 及 其应用。 背景技术 0002 淀粉原料一般含有 60 90% 的支链淀粉，。
5、 而支链淀粉所含的 4 6% 葡萄糖残基 以 -1,6- 糖苷键连接。普鲁兰酶 （Pullulanase,EC 3.2.1.41） 是一种能够专一性切开支 链淀粉分支点的 -1,6- 糖苷键， 从而剪下整个侧枝， 形成直链淀粉的解支酶， 在改善淀粉 酶对淀粉的作用效果、 提高淀粉利用率、 降低粮耗、 提高产品质量及开发新产品方面具有相 当巨大的价值， 在食品、 医药、 纺织、 生物能源等行业中有着非常重要的用途及良好的市场 前景， 例如可利用其生产高纯度葡萄糖和果糖、 高麦芽糖浆、 燃料乙醇， 以及改性淀粉。 0003 近年来随着淀粉原料深加工工业的发展， 要求酶制剂工业不断更新和完善酶的种 。
6、类和性能， 以满足工业生产的要求。我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发， 但由于酶活较低而仅限于实验室研究， 目前普鲁兰酶是淀粉制糖酶系中唯一一种我国尚不 能自主生产的产品。目前应用最广、 产量最大的普鲁兰酶源自丹麦 Novo 公司， 该公司所生 产的普鲁兰酶是由嗜酸性普鲁兰芽抱杆菌 （Bacillus acidopullulyticus） 经深层发酵产 生。此外， 国外来源于产气克雷伯氏菌 （Klebsiella aerogenes） 、 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 和 Bacillus deramificans 的普鲁兰酶也得到了商业化生产。因此， 我国在。
7、普鲁 兰酶的研究上距离发达国家有很大差距， 工业普鲁兰酶完全依赖进口， 定价权掌握在少数 外国公司手中， 垄断的市场供应导致了国内普鲁兰酶高昂的销售价格， 极大的限制了国内 相关产业的发展。 0004 为了改变我国对进口产品的依赖， 寻找一条国产化的道路， 本研究使用酶工程技 术开发有自主知识产权的高性能普鲁兰酶， 并利用基因工程技术构建基因工程菌株进行分 泌表达， 为工业化大规模生产普鲁兰酶打下坚实基础。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体 Pul324 及其应用。 0006 本发明所述的新的普鲁兰酶突变体 Pul324（SEQ ID NO.2） ， 其是通。
8、过分子改造长 野芽孢杆菌普鲁兰酶基因 （GenBank 序列号 JN872757.1） 而得到的， 具体是利用现代酶工程 技术缺失野生型基因上的前 324 个碱基， 改造得到一个新的普鲁兰酶突变体 Pul324。与原 酶相比， 这个突变体在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达， 发酵液上清是原酶的 24 倍， 胞 内酶活则提高了 40%， 其性质有利于降低普鲁兰酶的生产成本， 更加适合用于工业化生产。 0007 一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体基因 pul324， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所 示。 0008 所述的普鲁兰酶突变体基因 pul324 编码的蛋白质， 由 818 个氨基酸组。
9、成， 其氨基 酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 说 明 书 CN 102796751 B 3 2/4 页 4 0009 所述的普鲁兰酶突变体基因 pul324， 该突变体是通过提取长野芽孢杆菌 （Pullulanibacillus naganoensis） ATCC 53909基因组DNA， 根据Genbank中已报道的基因 序列为依据， 设计以下引物来获得缺失前 324bp 碱基的突变体基因 pul324 ： 0010 上游引物 F1 为 ： GTAGAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC 0011 下游引物 R1 为 ： GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGC。
10、T 0012 所述的普鲁兰酶突变体基因 pul324 编码的蛋白质在淀粉水解过程中的应用。 0013 本发明还涉及含有本发明普鲁兰酶突变体 Pul324 的宿主。 0014 本发明所述的新的普鲁兰酶突变体 Pul324， 该突变体酶在淀粉水解中的具有广泛 的用途。 0015 其特殊在于与原酶相比， 突变体 Pul324 在大肠杆菌宿主中能够有效的分泌表达， 发酵液上清的酶活提高为原来的24倍， 胞内酶活则提高了40%。 突变体基因pul324比野生 型基因小， 有利于质粒的稳定。 0016 本发明所述的新的普鲁兰酶突变体 Pul324 的制备方法包括普鲁兰酶突变体基因 pul324 的获得、 。
11、普鲁兰酶突变体基因的表达、 普鲁兰酶突变体酶活的测定等步骤， 具体如 下 ： 0017 （1） 普鲁兰酶突变体基因 pul324 的获得 0018 根据普鲁兰酶基因序列信息， 从原基因 （GenBank 序列号 JN872757.1） 的 325 位碱 基开始设计引物来进行改造。 以长野芽孢杆菌基因组DNA为模版， 使用上游引物F1 ： 5 -GTA GAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC-3（SEQ ID NO.1， 包含一个 EcoR I 酶切位点） 和下游引物 R1 ： 5 -GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT-3 （SEQ ID NO.2， 包含一个 Xh。
12、o I 酶切位点） ， 通过聚 合酶链式反应 （PCR） 扩增普鲁兰酶突变体基因。 0019 （2） 重组质粒的构建与验证 0020 用限制性内切酶EcoR I和Xho I对普鲁兰酶突变体基因进行双酶切， 与同样经过 双酶切的 pET-22b(+) 连接得到 pET22b-pul324， 转化宿主 E.coli DH5， 提取重组质粒进 行酶切验证， 并进一步进行 DNA 测序分析确定正确的转化子。 0021 （3） 基因工程菌株的构建 ： 0022 将验证正确的重组质粒转化 E.coli BL21(DE3) 感受态细胞 （CaCl2化学法转化） 内， 利用菌落PCR的方法验证阳性转化子E.c。
13、oli BL21(DE3)/pET22b-pul324。 经测定， 发酵 液上清的粗酶液酶活力为野生型的 24 倍， 胞内酶活则提高了 40%。 0023 本发明的突出的实质性特点和技术效果在于 ： 0024 本发明利用现代酶工程技术缺失长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因上的前 324 个碱基， 改造得到一个新的普鲁兰酶突变体 Pul324。该突变体基因比野生型基因小， 有利于质粒的 稳定。与原酶相比， 普鲁兰酶突变体 Pul324 在大肠杆菌宿主中能够有效分泌表达， 发酵液 上清的酶活提高为原来的 24 倍， 胞内酶活则提高了 40%， 其性质有利于降低普鲁兰酶的生 产成本， 更加适合用于工业化生产。。
14、 具体实施方式 0025 本发明使用的长野芽孢杆菌菌种可以从菌种保藏中心购买， 也可以通过野外采集 或者其他途径获得。 本发明采用的微生物培养、 基因克隆、 表达技术和相关的技术方案是本 说 明 书 CN 102796751 B 4 3/4 页 5 领域中常用的成熟技术， 涉及的专业术语也是本领域中常见的专业术语， 因此本发明的文 本对于本领域的专业人员来说是显而易见的。 下面结合实施例对本发明的技术内容作进一 步说明， 该实施例是说明性的， 而不是限定性的， 不能被解释为限定本发明的保护范围。 0026 下面将通过实施例对本发明作详细描述 ： 0027 （1） 普鲁兰酶突变体基因 pul23。
15、4 和 pul324 的获得 0028 长野芽孢杆菌 （Pullulanibacillus naganoensis） ATCC 53909从德国微生物菌种 保藏中心购买， 根据该菌的普鲁兰酶基因序列信息， 分别从原基因的 235、 325 位碱基开始 设计引物 ： 0029 上游引物 F2 ： 5 -GTAGAATTCCATCGATTTAAGCAAAGG-3 0030 上游引物 F1 ： 5 -GTAGAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC-3 0031 下游引物 R1 ： 5 -GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT-3 0032 其中上游引物包含一个 EcoR I 。
16、酶切位点 （下划线） ， 下游引物包含一个 Xho I 酶切 位点 （下划线） 。以 Pullulanibacillus naganoensis ATCC 53909 基因组为模版进行 PCR 扩增。反应体系为 ： ddH2O 41.5L， 10buffer 5L， dNTP（2.5mmol/L） 1L， 上下游引物 （20mol/L） 各 0.5L， DNA 模板 1L， 高保真 DNA 聚合酶 0.5L。PCR 扩增条件为 ： 94 大变性5min， 94变性20s， 61退火40s， 72延伸3min， 30个循环， 最后72延伸10min。 利用上游引物 F2 和下游引物 R1 可扩增。
17、得到 pul234 基因， 而利用上游引物 F1 和下游引物 R1 可扩增得到 pul324 基因。 0033 将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 检测到扩增产物大小与目的基因 片段大小完全吻合。PCR 产物用 DNA 纯化试剂盒 （天根公司） 进行纯化。具体步骤参考 DNA 产物纯化试剂盒说明书。用限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 对纯化的普鲁兰酶突变体基因 进行双酶切， 与同样经过双酶切的pET-22b(+)连接得到pET22b-pul234和pET22b-pul324， 转化宿主 E.coli DH5， 提取重组质粒进行酶切验证， 并进一步进行 DNA 测序分析确定正 。
18、确的转化子。 0034 将验证正确的重组质粒转化 E.coli BL21(DE3) 感受态细胞 （CaCl2化学法转化） 内， 利用菌落 PCR 的方法验证阳性转化子 E.coli BL21(DE3)/pET22b-pul234 和 E.coli BL21(DE3)/pET22b-pul324。将构建成功的基因工程菌株接种于 5mL 液体 LB 培养基 （含 100g/mL 氨苄青霉素） ， 37培养 10h。取 0.5mL 的液体种子接种 50mL 液体 LB 培养基 （含 100g/mL 氨苄青霉素） ， 37培养 2-3h， 当 OD620为 0.4 左右时， 加入 1mM IPTG， 。
19、然后置于 37进行诱导， 时间 12h。 0035 本发明采用 DNS 试剂显色法测定普鲁兰酶活力。其原理为普鲁兰酶水解普鲁兰糖 底物得到还原糖， 还原糖与 DNS 试剂所含的 3,5- 二硝基水杨酸共热后产生棕红色的络合 物， 在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比。使用分光光度法测定吸光值即可计 算出普鲁兰酶的活力。 0036 酶活测定的步骤为 ： 取 1mL 发酵液 12,000r/min 离心 3min 得到上清酶液。于离心 管中加入100L浓度为1% （w/v） 普鲁兰的乙酸钠缓冲液 （100mM， pH4.75） ， 然后加入100L 上清酶液， 60水浴中保温 15min。冰。
20、浴终止反应， 然后加入过量的 DNS（300L） 试剂， 沸 水浴显色 5min， 冷却后测定 OD540， 即可计算出胞外酶活。菌体沉淀的菌体用 200L 无菌水 悬浮， 加入适量Triton X-100和溶菌酶， 37水浴30min， 12,000r/min离心3min， 取上清按 说 明 书 CN 102796751 B 5 4/4 页 6 上述方法分析胞内酶活。与原酶相比， 普鲁兰酶突变体 Pul324 在大肠杆菌宿主中能够有效 的分泌表达， 发酵液上清的酶活提高为原来的 24 倍， 胞内酶活则提高了 40%。 0037 在淀粉液化过程中， 糖化酶则主要水解直链淀粉的 -1,4- 糖苷。
21、键。而普鲁兰酶 能够专一性切开支链淀粉分支点的 -1,6- 糖苷键， 从而剪下整个侧枝， 形成直链淀粉便 于其它淀粉酶对淀粉的作用效果， 提高淀粉水解效率、 降低能耗、 提高产品质量及开发新产 品方面具有较高的价值。在淀粉糖化过程中， 适当稀释的糖化酶 Dextrozyme DX 催化反 应 0.5、 1.0、 1.5 和 2.0h， 分别产生 0.758、 1.502、 2.219 和 2.628g/L 还原糖。当辅助加入 普鲁兰酶突变体 Pul324， 其它条件不变的情况下， 产生的还原糖浓度提高至 1.071、 2.307、 3.145 和 3.902g/L， 水解效率提高幅度均大于 4。
22、0%。由此可见， 辅助加入普鲁兰酶突变体 Pul324 确实可以有效提高淀粉水解效率。 0038 该发明具有重要的经济效益， 突变体的特殊性质有利于降低普鲁兰酶的生产成 本， 更加适合用于工业化生产。应该理解的是， 对本领域技术人员来说， 可以根据上述说明 加以改进或变换， 例如， 所述的野生型普鲁兰酶除了来源于长野芽孢杆菌之外， 还可以来源 于产气克雷伯氏菌、 枯草芽孢杆菌、 巨大芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 蜡状芽孢 杆菌、 Bacillus deramificans、 Bacillus acidopullulyticus 等菌株。所述的载体适于 在枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 毕赤酵母等宿主中表达。也可通过电转化法、 原生质体转 化法等将本发明的普鲁兰酶突变体转入原核或者真核宿主中， 以实现普鲁兰酶突变体的表 达。或者通过酶工程技术对突变体的氨基酸序列进行改造。而所有这些改进和变换都应属 于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 102796751 B 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102796751 B 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102796751 B 8 。