甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物及方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103866005 A (43)申请公布日 2014.06.18 CN 103866005 A (21)申请号 201410039820.1 (22)申请日 2014.01.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号东北农业大学东北农业大学园 艺学院 (72)发明人 栾非时 高鹏 王学征 王凤娇 马鸿艳 朱子成 (54) 发明名称 甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择 的引物及方法 (57) 摘要 本发明公开一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分。

2、 子标记辅助选择的引物及方法。本发明根据甜瓜 的 A 基因 DNA 序列上的第 6045 个碱基与 a 基因 相应位点存在单基因突变， 由此设计 CAPS 引物 A-as、 A-s， 根据甜瓜 G 与 g 基因分别设计 SCAR 引 物对 G-as、 G-s 及 g-as、 g-s， 用于区分标记甜瓜 的性别基因 ； 同时根据 MR-1 与 WI998Fom-2 基因 SCOP 功能域的比对结果确定显示能够在此区域 仅第 481 个碱基能开发为 CAPS 的标记位点， 由此 设计引物对 F-s、 F-as。通过 PCR 反应进行扩增后 酶切的多态性， 可用于甜瓜枯萎病抗性与全雌系 的分子标记辅。

3、助育种。 利用本发明进行辅助育种， 具有选择目标明确， 节约成本等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103866005 A CN 103866005 A 1/1 页 2 1. 一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物， 被确定为甜瓜枯萎病抗性 与全雌系植株所需的分子标记同时含有三个， 其特征在于， 所述的三个分子标记需用四组 引物对进行扩增 ： (1) 标记甜瓜性别基因 A 基因的引物对为。

4、 ： A-as ： 如序列表 Seq No.1 所示， A-s ： 如序列表 Seq No.2 所示 ； (2) 标记甜瓜性别基因 G、 g 基因的两对引物对， 其中标记 G 基因的引物对为 ： G-as ： 如序列表 Seq No.3 所示， G-s ： 如序列表 Seq No.4 所示 ； (3) 标记 g 基因的引物对为 ： g-as ： 如序列表 Seq No.5 所示， g-s ： 如序列表 Seq No.6 所示 ； (4) 标记甜瓜枯萎病抗性的 Fom-2 基因的引物对为 ： F-s ： 如序列表 Seq No.7 所示， F-as ： 如序列表 Seq No.8 所示。 2. 。

5、根据权利要求 1 所述的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物得 出的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择方法， 其特征在于， 通过如下步骤完 成 ： (1)以全雌系感枯萎病材料WI998为母本， 雄全同株抗枯萎病材料MR-1为父本杂交， 获 得 F1代植株 ： (2) 将 F1代自交， 得到 F2代植株 ； (3) 取 F2代植株叶片提取基因组 DNA， 对甜瓜抗枯萎病和全雌系性状进行分子标记定 位， 以 A-as、 A-s 引物对标记 AA 基因， 以 G-as、 G-s 引物对及 g-as、 g-s 引物对标记 gg 基因， 以 F-s、 F-as 引物对标记抗枯萎病 F。

6、F 基因 ； (4) 以酶切 PCR 产物及田间复查甜瓜植株的方式确定分子标记定位的准确性， 确定标 记得到的甜瓜植株的基因型为 AAggFF。 3. 根据权利要求 1 所述的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物， 其 特征在于， 分子标记的反应程序为 ： 将混合液在 94预变性 8min ； 然后 94变性 30s， 51退火 30s， 72延伸 1min， 35 个 循环 ； 最后 72终延伸 10min ； 所述混合液组成如下 ： 扩增产物用质量浓度为 1琼脂糖凝胶电泳观察结果。 权 利 要 求 书 CN 103866005 A 2 1/8 页 3 甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子。

7、标记辅助选择的引物及方法 技术领域 0001 本发明涉及分子遗传学领域， 具体涉及一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅 助选择的引物及方法。 背景技术 0002 甜瓜(Cucumis melonL.)是我国重要的经济作物。 目前， 雄全同株作为商业栽培时 的主要品种。在杂交制种时必须在蕾期将完全花花冠剥除， 做去雄处理。在此期间套袋， 授 粉， 标记， 种子纯度鉴定等操作规程增大了劳动强度、 制种成本高且种子纯度难以保证。薄 皮甜瓜完全花的雄蕊相对厚皮甜瓜较小， 纯度更加难以保证， 而且薄皮甜瓜是我国甜瓜的 主要栽培品种。 0003 在传统的甜瓜制种过程中， 要按照在花蕾期将完全花花冠剥除， 。

8、去雄， 套袋， 授粉， 标记等操作流程以保证种子纯度， 而后还要对种子进行纯度鉴定确保万无一失。不仅劳动 强度大， 制种成本高， 而且种子纯度难以保证。加之薄皮甜瓜作为我国甜瓜主要栽培品种， 其完全花的雄蕊相对较小， 使得去雄难度加大， 种子纯度更加难以保证。与此同时， 枯萎病 的连年蔓延更是影响着甜瓜的品质与产量。 0004 甜瓜植株花型共有 7 种性型分别为 ： 雌雄异花同株、 雄全同株、 两性花株、 雌全同 株、 三性花株、 全雌系、 全雄系。 2005年Zalapa通过构建甜瓜遗传图谱确定了A、 G和M(gy)3 个基因控制甜瓜性别分化， 并提出存在影响三性花株与雌全同株转化的微效基因。

9、， 且能够 产生该影响的微效基因受环境因素影响。2008 年 Boualem 通过染色体步移方法， 利用甜瓜 遗传图谱上距离 a 基因 25.2cM 的 RFLP 标记， 明确了控制甜瓜性别分化雄全同株基因 a 即 为控制 ACC 合成酶基因 ACS7， 并成功克隆了该基因 ； Antoine Martin 等 (2009) 报道了在 甜瓜花芽分化第 6 阶段 a、 g 基因表达量最高， 利用雌雄异花同株和全雌系杂交， 图位克隆 得到了引起雄花向雌花过渡的基因位点， 并鉴定出全雌系与一个基因家族的转座子插入有 关， 引起 WIP1(G) 基因启动子的甲基化。WIP1 编码一个转录因子， 阻止雌。

10、性器官发育。在全 雌系中， WIP1 基因的甲基化使 WIP1 基因表达沉默， 形成雌花。另外， WIP1 抑制直接导致了 另一个基因活化， 即ACS7基因， a基因编码一个乙烯合成酶基因ACS7， 它阻止了雄性器官发 育， 形成单性的雌花。雄性器官是因为 WIP1 的抑制和一个无功能 ACS7 基因的出现而形成。 WIP1 和 ACS7 相互作用可以解释雄花、 雌花和完全花的形成机理。 0005 甜瓜枯萎病 (Fusariumoxysperium) 是一种世界性的甜瓜病害， 在国外已有 二三十年的历史。近年来， 随着甜瓜面积的不断扩大， 我国许多省市甜瓜枯萎病发生严重， 且为害程度逐年加重。。

11、 该病是典型的土传病害， 从苗期到成株期均可发病， 结瓜中期为发病 高峰， 常引起瓜秧枯萎死亡， 对瓜的品质、 产量影响很大。 0006 在枯萎病的防治中， 使用抗性品种是最有效的方法。尖孢镰刀菌甜瓜专化型的病 原菌被 Risser 划分为 4 个生理小种， 分别为 race0、 race1、 race2 和 race1， 2 ； 3 个抗病基 因， 分别为 Fom-1、 Fom-2 和 Fom-3， 其中 ： Fom-1 抗 race0 和 2， 感 race1 和 race1， 2 ； Fom-2 抗 race0 和 1， 感 race2 和 race1， 2 ； Fom-3 抗 race。

12、0， 1 和 2， 感 race1， 2， 且都是显性基因。 说 明 书 CN 103866005 A 3 2/8 页 4 Tarek 等根据文库及 Wang 等得到与 Fom-2 紧密连锁的分子标记， 通过图位克隆方法克隆了 基因 Fom-2， 这是到目前为止， 甜瓜中唯一克隆到的抗枯萎病基因。2011 年杨加付等通过 同源克隆方法从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因 Fom-2， 推定编码 1099 个氨基 酸， 所推定的蛋白质序列经Blast分析与数据库中NBS-LRR类R基因具有较高的同源性。 进 一步序列分析 FOM-2 蛋白具有典型的 R 基因的 NB-ARC 及 SCOP2 。

13、个结构功能域。 发明内容 0007 针对目前甜瓜在制种过程中存在的一系列问题， 本发明提供了一种甜瓜枯萎病抗 性与全雌系分子标记辅助选择的引物及方法， 通过 PCR 的方法， 达到在甜瓜植株早期便能 完成对甜瓜全雌系及枯萎病抗性筛选的目的。 0008 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0009 1、 一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物， 被确定为甜瓜枯萎病 抗性与全雌系植株所需的分子标记同时含有三个， 所述的三个分子标记需用四组引物对进 行扩增 ： 0010 (1) 标记甜瓜性别基因 A 基因的引物对为 ： 0011 A-as ： 如序列表 Seq No.1 所示， 0012。

14、 A-s ： 如序列表 Seq No.2 所示 ； 0013 (2) 标记甜瓜性别基因 G、 g 基因的两对引物对， 其中标记 G 基因的引物对为 ： 0014 G-as ： 如序列表 Seq No.3 所示， 0015 G-s ： 如序列表 Seq No.4 所示 ； 0016 (3) 标记 g 基因的引物对为 ： 0017 g-as ： 如序列表 Seq No.5 所示， 0018 g-s ： 如序列表 Seq No.6 所示 ； 0019 (4) 标记甜瓜枯萎病抗性的 Fom-2 基因的引物对为 ： 0020 F-s ： 如序列表 Seq No.7 所示， 0021 F-as ： 如序列。

15、表 Seq No.8 所示。 0022 2、 根据如上所述的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物得出 的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择方法， 通过如下步骤完成 ： 0023 (1) 以全雌系感枯萎病材料 WI998 为母本， 雄全同株抗枯萎病材料 MR-1 为父本杂 交， 获得 F1代植株 ； 0024 (2) 将 F1代自交， 得到 F2代植株 ； 0025 (3) 取 F2代植株叶片提取基因组 DNA， 对甜瓜抗枯萎病和全雌系性状进行分子标 记定位， 以 A-as、 A-s 引物对标记 AA 基因， 以 G-as、 G-s 引物对及 g-as、 g-s 引物对标记 。

16、gg 基因， 以 F-s、 F-as 引物对标记抗枯萎病 FF 基因 ； 0026 (4) 以酶切 PCR 产物及田间复查甜瓜植株的方式确定分子标记定位的准确性， 确 定标记得到的甜瓜植株的基因型为 AAggFF。 0027 3、 如上所述的一种甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择的引物， 分子标记 的反应程序为 ： 0028 将混合液在 94预变性 8min ； 然后 94变性 30s， 51退火 30s， 72延伸 1min， 说 明 书 CN 103866005 A 4 3/8 页 5 35 个循环 ； 最后 72终延伸 10min ； 所述混合液组成如下 ： 0029 0030 扩增。

17、产物用质量浓度为 1琼脂糖凝胶电泳观察结果。 0031 本发明具有如下优点 ： 0032 1、 利用本发明的甜瓜枯萎病抗性与全雌系分子标记辅助选择体系育种选择目标 明确， 可节约成本。 利用本发明的分子标记在瓜苗期就可以筛选出抗枯萎病全雌系甜瓜， 省 去了去雄， 套袋等一列操作， 减少工作量， 提高效率。 0033 2、 本发明利用采取传统育种方法， 以全雌系感枯萎病材料 WI998 为母本， 雄全同 株抗枯萎病材料 MR-1 为父本杂交。利用分子标记辅助选择， 筛选出基因型为 AAggFF 的 F2 代抗枯萎病全雌系群体。 0034 3、 根据 Fom-2 蛋白存在的 2 个结构功能域 ： 。

18、NB-ARC 和 SCOP 功能域， 即 NB-ARC 功 能域是植物 R 基因的典型结构功能域， SCOP 为富含 LRR 的结构功能域， 对 NBS-LRR 类 R 基 因的功能十分重要。针对 FOM-2 蛋白的 SCOP 结构功能域对应的核苷酸序列进行扩增， 比对 两亲本 ( 母本 WI998， 父本 MR-1)， 设计 CAPS 引物， 开发预期紧密连锁的分子标记。为甜瓜 枯萎病抗病育种提供新的技术基础。 附图说明 0035 图 1 为甜瓜枯萎病感病级数图。 0036 图 2 为 A、 a 基因目的片段扩增图， 0037 其中， 1 为 MR-1 的目的基因扩增结果， 2 为 WI99。

19、8 的目的基因扩增结果， 3 为 F1的 目的基因扩增结果。 0038 图 3 为 A， a 基因片段 PCR 的酶切结果图， 0039 其中， 1 为 MR-1 目的基因 PCR 的酶切结果， 2 为 WI998 目的基因 PCR 的酶切结果， 3 为 F1目的基因 PCR 的酶切结果图。 0040 图 4 为 A 基因 F2群体的 PCR 扩增结果图 ； 0041 图 5 为 A 基因 F2群体 PCR 产物的酶切结果图， 0042 其中， 1 为基因型 AA 的植株， 2 为基因型为 aa 的植株， 3 为基因型为 Aa 的植株。 0043 图 6 为 G、 g 基因目的片段的 PCR 。

20、扩增图， 0044 其中， 1 为 WI998 的目的基因扩增结果， 引物为 g-as、 g-s ； 2 为 MR-1 的目的基因扩 增结果， 引物为 g-as、 g-s ； 3 为 F1的目的基因扩增结果， 引物为 g-as、 g-s ； 4 为 MR-1 的目的 基因扩增结果， 引物为 G-as、 G-s ； 5 为 WI998 的目的基因扩增结果， 引物为 G-as、 G-s ； 6 为 F1的目的基因扩增结果， 引物为 G-as、 G-s。 说 明 书 CN 103866005 A 5 4/8 页 6 0045 图 7 为 g 基因 F2群体的扩增结果图。 0046 图 8 为 G 基。

21、因 F2群体的扩增结果图。 0047 图 9 为 MR-1 与 WI998Fom-2 基因的 SCOP 功能域测序结果比对图。 0048 图 10 为 Fom-2 基因目的片段扩增图， 0049 其中， 1 为 MR-1 的目的基因扩增结果， 2 为 WI998 的目的基因扩增结果， 3 为 F1的 目的基因扩增结果。 0050 图 11 为 Fom-2 基因片段 PCR 的酶切结果图， 0051 其中， 1 为 MR-1 目的基因 PCR 的酶切结果， 2 为 WI998 目的基因 PCR 的酶切结果， 3 为 F1目的基因 PCR 的酶切结果。 0052 图 12 为 Fom-2 基因 F。

22、2群体的酶切结果图， 0053 其中， 1 为基因型为 FF 的植株， 2 为基因型为 ff 的植株， 3 为基因型为 Ff 的植株。 0054 图 13 为 F3代中 A 基因酶切结果图， 0055 其中， 1 为 MR-1 目的基因 PCR 的酶切结果， 2 为 WI998 目的基因 PCR 的酶切结果， 3 为 F1目的基因 PCR 的酶切结果。 0056 图 14 为 F3代中 G 基因扩增结果图， 0057 其中， 1 为 MR-1 目的基因 PCR 的酶切结果， 2 为 WI998 目的基因 PCR 的酶切结果， 3 为 F1目的基因 PCR 的酶切结果。 0058 图 15 为 。

23、F3代中 g 基因扩增结果图， 0059 其中， 1 为 MR-1 目的基因 PCR 的酶切结果， 2 为 WI998 目的基因 PCR 的酶切结果， 3 为 F1目的基因 PCR 的酶切结果。 0060 图 16 为 F3代中 Fom-2 基因酶切结果图， 0061 其中， 1 为 MR-1 目的基因 PCR 的酶切结果， 2 为 WI998 目的基因 PCR 的酶切结果， 3 为 F1目的基因 PCR 的酶切结果。 0062 图 17 为 20 个品系的 Fom-2 基因酶切验证图， 0063 其中， 从左至右的 DNA 模板依次为 BT3、 No.26、 TN、 S3、 M-021、 3。

24、-1-3、 甜帅、 PI1446928、 PI1446931、 台 甜 1-5-1、 No.30、 台 甜 3-1、 MRIL7-165、 ， 6-1-4-4、 PI508448、 PI618848、 PI1446930、 3-2-2、 台甜 2-2-4、 PI1446929。 具体实施方式 0064 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述 ： 0065 实施例 1 0066 供试甜瓜及其 DNA 提取 0067 ( 一 ) 供试甜瓜及其枯萎病抗性分析 0068 (1)供试甜瓜材料 ： WI998与MR-1、 F1代、 F2代， 抗病对照材料 ： 3-1-3， PI1446928， P。

25、I1446931， PI1446930， PI1446929， PI618848， PI508448， 台甜 2-2-4， 台甜 3-1， No.30， 感病 对照材料 ： 甜帅、 BT3、 MRIL7-165、 No.26、 台甜 1-5-1、 TN、 6-1-4-4、 S3、 M-021、 3-2-2。 0069 (2) 苗期枯萎病抗性分析 ： 抗病性鉴定采用苗期伤根法接种枯萎病病菌， 当供试 甜瓜幼苗长至 1 片真叶时， 挖出， 经清水洗净后， 于孢子悬浮液 ( 孢子悬浮液中含孢子数一 般为 5.5105个 /mL) 中浸泡 15min， 再植回营养杯培养， 培养条件 ： 温度为 28，。

26、 光照时长 说 明 书 CN 103866005 A 6 5/8 页 7 为 14 16h， 相对湿度为 70 80， 潜育发病， 接菌后 7 天， 叶片病情分级及反应型划分标 准各类病害的病情分级及反应型参照 中华人民共和国农业行业标准 中的相关规程， 具体 如下 ： 0 级， 无病症 ； 1 级， 子叶萎蔫或部分子叶与真叶轻微萎蔫 ； 2 级， 1 片真叶萎蔫或子叶 较重萎蔫 ； 3级， 子叶及部分真叶萎蔫 ； 4级， 整株轻度萎蔫， 部分枯死， 但是心叶仍然成活 ； 5 级， 整株严重萎蔫并枯死。苗期具体表现形式如图 1 所示。依据上述分级标准调查病情， 并 计算病情指数 (DI)， 抗。

27、性分级标准为 ： 高抗 (HR) ： DI 10 ； 抗病 (R) ： 10 DI 30 ； 中抗 (MR) ： 30 DI 50 ； 感病 (S) ： DI 50。之后每两天观察一次感病情况， 共观察 3 次。 0070 ( 二 ) 供试甜瓜基因组 DNA 的提取 0071 (1) 叶片采集 ： 将 WI998、 MR-1、 F1代、 F2代、 对照材料播种于培养钵中， 待三叶一心 时期， 取植株顶部较为幼嫩的叶片， 每份 0.2g， 在 -80下保存备用。 0072 (2)DNA 提取 ： 采用改进的 CTAB 法提取甜瓜基因组 DNA。称取 0.2g 叶片， 液氮中 研磨后加入 800L。

28、2 CTAB 混匀， 65水浴 1h， 13000r/m 离心 10min， 吸取 750L 上清 液， 加入等体积 24 ： 1 氯仿异戊醇， 振荡均匀后静 10min， 13000r/m 离心 10min， 吸取 650L 上清液， 加入等体积 24 ： 1 氯仿异戊醇， 振荡均匀后静置 10min， 13000r/m 离心 10min， 吸取 550L 上清液， 加入 3L RNA 酶， 水浴 1h， 加入 550L24 ： 1 氯仿异戊醇， 振荡均匀后静 置 10min， 13000r/m 离心 10min， 吸取 450L 上清液， 加入冰浴的异丙醇， -20静置 1h， 13000。

29、r/m 离心 10min， 弃上清， 沉淀用 70无水乙醇清洗两次， 吹干后加入 150L H2O 溶 解， 于 -80保存备用。 0073 实施例 2 0074 目的基因分子标记筛选 0075 ( 一 ) 目的基因分子标记筛选的引物设计 ： 采取传统育种方法， 以全雌系感枯萎病 材料 WI998 为母本， 雄全同株抗枯萎病材料 MR-1 为父本杂交。根据 A 与 a 基因所转录蛋白 序列在第56个氨基酸上存在的差异， 即在A基因DNA序列上的第6045个碱基与a基因相应 位点存在单基因突变， 并发现此碱基位点为 Alu I 酶切位点， 由此设计 CAPS 引物。在 G 基 因的 ORF2 与。

30、 ORF3 之间， 据 ORF31.3kb 的区域插入一段名为 Gyno-hAT 的转座子， 使得 G 基 因不能正常表达进而失活。因此， 分别在 G 与 g 基因上分别设计 SCAR 引物， 用于区分显隐 性基因。分别扩增 MR-1 与 WI998Fom-2 基因在 SCOP 功能域， 比对结果显示两品种在此功能 域中共存在 37 个 SNP 位点， 但能够开发为 CAPS 标记的位点仅为在此区域的第 481 个碱基。 0076 根据 NCBI(National Center for Biotechnology Information， 美国国家生物技 术信息中心 ) 公布的甜瓜性别基因 A。

31、CS7(A)、 WIP(G)、 Fom-2(F) 序列信息自行设计合成引 物。 用于甜瓜枯萎病抗性与全雌辅助选择系分子标记中扩增引物具有如下所示的核苷酸序 列 ： 0077 A-as ： 5 -ACCCAGGATAGTAAGGAGTG-3 0078 A-s ： 5 -GAATCGGAACATCAGAAACA-3 0079 G-as ： 5 -TAGGTCCAACCAACAACAAT-3 0080 G-s ： 5 -AAAATAGAGTCAGCCAACC-3 0081 g-as ： 5 -AACACGCAACTGAAACGA-3 0082 g-s ： 5 -ATGATAATAAGGAGAAAGG。

32、GAC-3 0083 F-s ： 5 -TGTGGATGGCACAAGGT-3 说 明 书 CN 103866005 A 7 6/8 页 8 0084 F-as ： 5 -CAATGGTCCCAATTCAATAA-3 0085 ( 二 ) 目的基因分子标记筛选及分析 0086 (1) 目的基因分子标记筛选体系 0087 将混合液在 94预变性 8min ； 然后 94变性 30s， 51退火 30s， 72延伸 1min， 35 个循环 ； 最后 72终延伸 10min。所述混合液组成如下 ： 0088 0089 扩增产物用 1琼脂糖凝胶电泳观察结果。 0090 (2) 酶切 PCR 产物分析。

33、其基因型 0091 将上述 PCR 产物进行酶切分析， 以鉴定其基因型。 0092 (A) 用 ALuI 进行酶切反应。将混合液在 37反应 12h， 然后用 1琼脂糖凝胶电 泳观察结果。混合液的体系如下 ： 0093 0094 (B) 用 BcLI 进行酶切反应。将混合液在 55反应 12h， 然后用 1琼脂糖凝胶电 泳观察结果。混合液的体系如下 ： 0095 0096 (3) 具体操作步骤 0097 分别以 MR-1、 WI998、 F1代的基因组 DNA 为模板， 以 A-as 与 A-s 为引物， 进行 PCR 扩增， 反应体系及反应条件如上所述， 结果如图 2 所示。用 ALuI 进。

34、行酶切分析， 反应体系及 反应条件如上所述， 区分亲本及 F1代中 A 基因的多态性， 即验证基因型为纯和还是杂合， 结 果如图 3 所示。在图 3 中 1、 2、 3 的基因型分别为 aa、 AA、 Aa。将 F1代进行杂交， 如上所述方 法进行 F2代基因组 DNA 的 PCR 扩增， 反应体系及反应条件如上所述， PCR 结果如图 4 所示。 将 F2代基因组 DNA 的 PCR 产物进行酶切， 反应体系及反应条件如上所述， 筛选出 F2代基因 说 明 书 CN 103866005 A 8 7/8 页 9 型为 AA 的群体， 酶切结果如图 5 所示。 0098 分别以 MR-1、 WI。

35、998、 F1代的基因组 DNA 为模板， 分别以 G-as、 G-s 和 g-as、 g-s 两 对引物进行 PCR 扩增， 反应体系及反应条件如上所述， 得到的扩增产物多态性区分基因型 的纯杂合， 结果如图 6 所示。确定 MR-1 基因型为 gg， WI998 基因型为 GG， F1代基因型为 Gg。 将 F1代进行自交得到 F2代植株， 并提取基因组 DNA。以 F2代基因组 DNA 为模板， 分别用 G-as、 G-s 和 g-as、 g-s 两对引物如上所述方法对 F2代基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 反应体系 及反应条件如上所述， 结果如图 7、 8 所示。对比两图可筛选出。

36、 F2代中基因型为 gg 的群体。 0099 图9所示为抗枯萎病基因的筛选， 图为MR-1与WI998(即父母本)在Fom-2基因的 SCOP 功能域扩增片段比对结果， 其中在此功能域中存在 37 个 SNP 位点， 本实验利用第 481 个碱基的 SNP 开发 CAPS 引物用于区分 Fom-2 基因的纯杂合。 0100 分别以 MR-1、 WI998、 F1代的基因组 DNA 为模板， 以 F-as、 F-s 为引物进行 PCR 扩 增， 反应体系及反应条件如上所述， 结果如图 10 所示。用内切酶 BcLI 进行分析， 酶切体系 及条件如上所述， 区分亲本及 F1代中 Fom-2 基因的。

37、多态性， 即验证基因型为纯和还是杂合， 结果如图 11 所示。在图 11 中 1、 2、 3 的基因型分别为 FF、 ff、 Ff。将 F1代进行杂交， 如上 所述方法进行 F2代基因组 DNA 的 PCR 扩增， 将 F2代基因组 DNA 的 PCR 产物进行酶切， 酶切 体系及条件如上所述， 筛选出 F2代基因型为 FF 的群体。酶切结果如图 12 所示。 0101 ( 三 ) 种子纯度的检测及 Fom-2 基因引物的多态性与感抗病一致性的检测 0102 (1) 种子纯度的检测 0103 根据酶切结果， 找到在双亲及 F1代具有多态性的引物， 在 F2代群体中筛选出抗枯 萎病全雌系植株， 。

38、观察植株花型， 授粉， 所得即为 F3代。在 F3代群体中的每个群体分别随机 挑选 20 粒种子播种， 在苗期提取 DNA， 并将同一群体的 DNA 混合， 分别用上述 4 对引物验证 种子纯度。 结果如图13-16所示。 图13为F3代中A基因酶切结果， 其中1、 2、 3分别为MR-1、 WI998、 F1的酶切结果 ； 图 14 为 F3代中 G 基因扩增结果， 其中 1、 2、 3 分别为 MR-1、 WI998、 F1 的酶切结果 ； 图 15 为 F3代中 g 基因扩增结果， 其中 1、 2、 3 分别为 MR-1、 WI998、 F1 的酶切结 果 ； 图 16 为 F3代中 F。

39、om-2 基因酶切结果， 其中 1、 2、 3 分别为 MR-1、 WI998、 F1 的酶切结果。 结果证实 F2代所得抗枯萎病全雌系植株种子合格。 0104 (2)Fom-2 基因引物的多态性与感抗病一致性的检测 0105 在本实验室现有的甜瓜品系中挑选出 10 个抗枯萎病品种， 10 个感枯萎病品种用 于验证 Fom-2 基因引物的多态性与感抗病一致性。将 20 个品种基因组 DNA 的 PCR 扩增， 将 20 个品种基因组 DNA 的 PCR 产物进行酶切， 酶切体系及条件如上所述， 酶切结果如图 17 所 示。证明 Fom-2 基因的引物多态性与感抗病一致。 0106 ( 四 ) 。

40、研究结果的田间复查 0107 (1) 基因型的鉴定 ： 0108 在 F2群体、 获得的 F2代果实 F3种子的每个群体中随机挑选 20 粒种子中利用所设 计的3对用于区分性别基因A、 G的引物PCR扩增产物及酶切后获得多态性片段与亲本、 F1代 扩增酶切片段相比较。在 F2群体中基因型 A_G_ ： aaG_ ： aagg ： A_gg 为 1044 ： 352 ： 124 ： 336， 同时田间调查结果显示， 雌雄异花同株 (A_G_) ： 雄全同株 (aaG_) ： 两性花株 (aagg) ： 雌全 同株、 三性花株、 全雌系 (A_gg) 为 1086 ： 276 ： 97 ： 404。

41、。 0109 由此可见分子标记选择结果与田间调查结果基本符合。 说 明 书 CN 103866005 A 9 8/8 页 10 0110 (2) 抗枯萎病的鉴定 ： 0111 表 1 ： 甜瓜品系枯萎病抗性情况调查结果 0112 0113 由表 1 及图 17 可以得出标记 Fom-2 能够有效区分甜瓜材料枯萎病感抗性， 由此可 认定图 16 中所筛选出的 6 个 F3群体即为抗甜瓜枯萎病群体。在此之前， 已鉴定在图 16 中 的 24 个群体均为全雌系， 因此通过本实验的分子标记辅助选择体系在 F2代群体的 1863 株 植株中筛选出基因型为 AAggFF 植株 35 株， 获得符合该基因型。

42、植株果实 6 个。 说 明 书 CN 103866005 A 10 1/2 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103866005 A 11 2/2 页 12 序 列 表 CN 103866005 A 12 1/5 页 13 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103866005 A 13 2/5 页 14 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103866005 A 14 3/5 页 15 图 9 说 明 书 附 图 CN 103866005 A 15 4/5 页 16 图 10图 11 图 12 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 103866005 A 16 5/5 页 17 图 15 图 16 图 17 说 明 书 附 图 CN 103866005 A 17 。