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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610083711.9 (22)申请日 2016.02.06 (71)申请人 厦门大学附属中山医院 地址 361004 福建省厦门市思明区湖滨南 路201-209号 申请人 张忠英 (72)发明人 方宜臻林华月张忠英 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 (普通合伙) 35200 代理人 马应森 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂 盒及其分型方法 (57)摘要 基于Al。
2、lGlo探针的Glu504lys检测分型试剂 盒及其分型方法， 涉及单核苷酸多态性。 试剂盒 包括实时荧光定量PCR试剂、 阳性对照及阴性对 照； 所述Glu504lys为NCBI所提供人12号染色体 ALDH2基因中的SNP位点； 分型方法： 1)采用常规 方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA； 2)采用所 述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒 提供的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧 光定量PCR扩增； 3)根据检测到的荧光信号对人 ALDH2基因Glu504lys进行分型。 AllGlo探针在保 持高特异性和敏感性的前提下， 检测价格比直接 测序法更低廉， 并。
3、且过程更简易耗时更短。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 CN 105969842 A 2016.09.28 CN 105969842 A 1.基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒， 其特征在于包括实时荧光定量PCR试 剂、 阳性对照及阴性对照； 所述Glu504lys为美国国家生物技术信息中心所提供人12号染色体ALDH2基因中的SNP 位点。 2.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒， 其特征在于所述实 时荧光定量PCR试剂包括以下组份： 10Taq缓冲液、 10mmol的MgCl2、 5u/L的Taq HotstartDNA聚合酶。
4、、 10mmoldNTPs混合液、 50LowROX、 100mL无核酶水、 10 mol/L Glu504lys的特异正向引物、 10 mol/LGlu504lys的特异反向引物和AllGlo探针； 所述10 Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl和500mmolKCl。 3.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒， 其特征在于所述 Glu504lys的特异正向引物的核苷酸序列为： SEQIDNO.1： 5 -GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3 ； 所述Glu504lys的特异反向引物的核苷酸序列为： SEQIDNO.2： 5 -GCCACC。
5、AGCAGACCCTCA-3 ； 所述AllGlo探针为Glu504lys的特异探针， 其核苷酸序列为： SEQIDNO.3： Glu504lys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR； SEQIDNO.4： Glu504lys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP。 4.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒， 其特征在于所述阳 性对照包括： 阳性纯合对照品1、 阳性纯合对照品2、 阳性杂合对照品， 所述阳性纯合对照品1 为Glu504lys分型为AA的DNA样品， 所述阳性纯合对照品2为Glu504lys分型为GG的DNA样品。
6、， 所述阳性杂合对照品为Glu504lys分型为AG的DNA样品。 5.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒， 其特征在于所述阴 性对照为1mL的无核酶水。 6.基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型方法， 其特征在于包括以下步骤： 1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA； 2)采用如权利要求15中任一所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒提供 的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增； 3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因Glu504lys进行分型。 7.如权利要求6所述基于AllGlo探针的。
7、Glu504lys检测分型方法， 其特征在于所述 AllGlo探针采用美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司的荧光定量探针。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105969842 A 2 基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法 技术领域 0001 本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)， 尤其是涉及一种基于AllGlo探针的Glu504lys 检测分型试剂盒及其分型方法。 背景技术 0002 单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism， SNP),主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多。
8、态性。 它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。 SNPs在人类基因组中广泛存在， 平均每5001000个碱基对中就有1个， 估计其总数可达 300万个甚至更多。 作为第三代遗传标志， SNP与人体许多表型差异、 药物易感性与疾病易感 性密切相关。 SNP在基因组中的大量存在， 使其成为一个强有力的工具， 在疾病定位与克隆、 药物的设计和测试以及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。 0003 个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。 将个体化的靶点定位于某个基因， 甚 至是单个核苷酸， 发现疾病的遗传标志物， 将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展 疾病预防、 诊断和治疗。 基因的SNP是形成。
9、个体间差异的重要遗传学基础,通过SNP与疾病和 药物治疗的关联性分析， 使得医生不仅可以通过所检测出的SNP预测、 确定与疾病有关的基 因， 同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点， 并根据这一特点选择治疗 效果最好， 不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。 0004 SNP在疾病的预防、 诊断、 治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色， 因此准确 快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。 0005 目前， SNP分型的方法主要有直接测序技术法、 限制性片段长度多态性技术 (RFLP)、 Tagman荧光探针法、 扩增阻滞突变系统(ARMS)、 高分辨熔解曲线分析法(HRM。
10、)等。 其 中， 直接测序法是目前最直观， 准确性相对而言最高的SNP分型方法， 但其步骤多而分散， 成 本较高， 工作量大， 周期长， 价格昂贵， 不适合大样本多位点检测； 限制性片段长度多态性技 术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术， 对仪器要求低， 只需要一台PCR仪以及电泳仪器即 可进行实验， 但其实验操作繁琐， 检测周期长， 不适合大样本检测； Tagman荧光探针法准确 度较好， 但其设计合成程序复杂， 并且不适合多位点少量样本的分型， 尤其是频率偏低的位 点； 扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、 简便， 但是不能闭管操作， 对基因多态性分析难以实 现高通量、 自动化； 高。
11、分辨熔解曲线分析法(HRM)具有简单、 快速等优点， 但该方法特异性不 足， 仪器选择少。 0006 AllGlo探针作为新一代的荧光探针， 在具备TaqMan-MGB探针优点的基础上， 大大 提高信噪比， 减少背景荧光信号。 目前， AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、 乙型肝 炎病毒基因突变(Feng ,Z.L.Yu,X .Y.Lu,Z.M.Geng ,D.Y.Zhang ,L.Chen,S.J .Rapid detectionofthehepatitisBvirusYMDDmutantusingAllGloTMprobesJ.Clin ChimActa,2011， 412(11-。
12、12)： 1018-1021)、 侵袭性曲霉菌病(Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou, X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.Theestablishmentandevaluationofdiagnosticaccuracy ofAllGlo(TM)probe-basedtechniquesforinvasiveaspergillosisJ.Zhonghua 说明书 1/6 页 3 CN 105969842 A 3 NeiKeZaZhi,2010,49(2):142-145)。 0007 硝酸甘油是临床上广泛用于治疗及预防冠心病心绞痛的常用药， 在治疗心绞痛方 面已有100多年的历史。。
13、 虽然硝酸甘油是治疗心绞痛的一线药物， 但其临床的治疗效果在不 同个体间却有很大的差异， 尤其在中国汉族人群中含服硝酸甘油无效的比例可高达25以 上。 乙醛脱氢酶(ALDH2)是体内催化硝酸甘油生物转化的关键酶， 其酯酶活性可以通过将硝 酸甘油脱硝形成一氧化氮， 进而发挥作用。 ALDH2第12外显子存在一个SNP位点 Glu504lys， 该SNP位点会导致ALDH2活性发生改变， 进而造成硝酸甘油无法产生一氧化氮， 丧失药效。 Glu504lys在白种人中少见， 但是在东亚黄种人中却高达30-50(GoeddeHW, etal.Populationgeneticstudiesofaldeh。
14、ydedehydrogenaseisozymedeficiency andalcoholsensitivity.Am.J.Hum.Genet.1983； 35:769772)， 因此在用药前对患者进 行Glu504lys的检测分型， 能够为患者选择更为合适的治疗药物， 避免无效用药， 为临床治 疗用药提供重要的参考依据。 在个体化诊断与治疗快速发展的背景下,Glu504lys与硝酸甘 油的紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位点， 因此急需一种更快速高效的SNP分 型方法来满足精准医学的发展。 发明内容 0008 本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的 。
15、上述缺陷， 提供基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒。 0009 本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型方法。 0010 所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒， 包括实时荧光定量PCR试剂、 阳性对照及阴性对照； 0011 所述Glu504lys为美国国家生物技术信息中心(NCBI)所提供人12号染色体ALDH2 基因中的SNP位点； 0012 所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份： 10Taq缓冲液、 10mmol的MgCl2、 5u/ L的TaqHotstartDNA聚合酶、 10mmoldNTPs混合液、 50L。
16、owROX、 100mL无核酶水、 10 mol/LGlu504lys的特异正向引物、 10 mol/LGlu504lys的特异反向引物和AllGlo探针； 所 述10Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl和500mmolKCl。 0013 所述Glu504lys的特异正向引物的核苷酸序列为： 0014 SEQIDNO.1： 5 -GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3 ； 0015 所述Glu504lys的特异反向引物的核苷酸序列为： 0016 SEQIDNO.2： 5 -GCCACCAGCAGACCCTCA-3 。 0017 所述AllGlo探针为Glu504lys的特异探针。
17、， 其核苷酸序列为： 0018 SEQIDNO.3： Glu504lys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR； 0019 SEQIDNO.4： Glu504lys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP； 0020 所述阳性对照包括： 阳性纯合对照品1、 阳性纯合对照品2、 阳性杂合对照品。 所述 阳性纯合对照品1为Glu504lys分型为AA的DNA样品， 所述阳性纯合对照品2为Glu504lys分 型为GG的DNA样品， 所述阳性杂合对照品为Glu504lys分型为AG的DNA样品。 0021 所述阴性对照为1mL的无核酶水。 0022 所述基于AllGlo。
18、探针的Glu504lys检测分型方法， 包括以下步骤： 说明书 2/6 页 4 CN 105969842 A 4 0023 1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA； 0024 2)采用所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒提供的实时荧光定量 PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增； 0025 3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因Glu504lys进行分型。 0026 所述AllGlo探针可采用美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司的荧光定 量探针， 它拥有普通Taqman， Taqman-MGB及分子信标(molecu。
19、larbeacon)探针所有优点， 克 服了目前这几种探针的最大弊端， 它打破了传统Taqman一端报告基团一端淬灭基团的限 制， 利用了美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司研制的几种常见波长的特制荧 光染料， 标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团， 而且上面含有特殊的可以提高Tm 值(退火温度)的化学基团， 提高探针特异性， 杂交特异性大大提高， 在杂交水解之后两端标 记的染料又全部变为报告基团， 提高荧光增量。 0027 所述AllGlo探针具有以下优势： 提高Tm值(可达10以上)， 探针更短可以达到 1516个碱基， 可以适用A,T含量比较高的序列。
20、设计探针； 加大了多重荧光定量的选择， 因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团， 打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困 难， 不受淬灭基团波长限制； 大大提高信噪比， 无背景信号， 空间距离近， 更好的淬灭效 果； 成本较低， 价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半， 具有MGB探针所有优势。 0028 本发明采用了AllGlo探针技术， 设计了特异性引物和相应的AllGlo探针， 探针分 别标记2种特殊荧光基团(MAR、 JUP),并对该技术反应条件进行优化， 建立了一种AllGlo探 针SNP检测分型方法， 应用前景广阔。 0029 本发明的有益效果如下： 0030 本发明提供了。
21、一种基于AllGlo探针的SNP检测分型试剂盒和检测方法， 其特异性 和敏感性高， 可快速准确进行SNP分型， 与现有的常见技术相比具有以下优势： 0031 1.与直接测序法相比， AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下， 检测价格 比直接测序法更低廉， 并且过程更简易耗时更短。 0032 2.与taqman-MGB探针相比， AllGlo探针采用相同的荧光基团， 互为报告基团和淬 灭基团， 一方面释放的荧光信号更强， 另一方面本底信号更低； 而且合成程序简单， 价格仅 相当于Taqman-MGB的一半。 0033 3.与限制性片段长度多态性技术(RFLP)相比， 基于AllGlo探针。
22、的SNP分型方法将 反应时间大大缩短， 通量更大， 并且敏感性与特异性要明显高于基于限制性酶切位点的SNP 分型方法。 0034 4.与扩增阻滞突变系统(ARMS)相比， 基于AllGlo探针SNP分型方法检测灵敏度更 强， 可以实现 “闭管操作” ， 有效防止外界污染， 具有良好的特异性和准确性。 0035 5.与高分辨熔解曲线分析法(HRM)相比， 基于AllGlo探针SNP分型方法特异性更 高， 并且多种仪器可应用AllGlo探针进行SNP检测分型， 可用仪器选择多， 不需要特定技术 人员操作， 应用范围更广阔。 0036 6.本发明建立了基于AllGlo探针进行Glu504lys的检测。
23、分型方法， 适合人群进行 个体化的SNP检测分型， 推动了SNP在临床药物研究及个体化用药的发展。 具体实施方式 说明书 3/6 页 5 CN 105969842 A 5 0037 实施例1 0038 本发明基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒包括以下组份： 0039 实时荧光定量PCR试剂、 阳性对照及阴性对照。 0040 实时荧光定量PCR试剂包括以下组份： 10Taq缓冲液(10Taq缓冲液包括100m molTris-HCl和500mmolKCl)、 10mmol的MgCl2、 5u/ L的TaqHotstartDNA聚合酶、 10m moldNTPs混合液、 50L。
24、owROX、 100mL无核酶水、 10 mol/LGlu504lys的特异正向引物、 10 mol/LGlu504lys的特异反向引物和AllGlo探针。 0041 阳性对照包括： 阳性纯合对照品1、 阳性纯合对照品2、 阳性杂合对照品。 所述阳 性纯合对照品1为Glu504lys分型为AA的DNA样品， 所述阳性纯合对照品2为Glu504lys分型 为GG的DNA样品， 所述阳性杂合对照品为Glu504lys分型为AG的DNA样品。 0042 阴性对照为1mL的无核酶水。 0043 实施例2 0044 外周血Glu504lys的检测分型， 包括以下步骤： 0045 1.收集EDTA抗凝外周。
25、血： 0046 抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管并分装多管， 每管分装400500 L， 取200 L用于DNA提取， 其余全血标本置于-80冻存。 0047 2.提取DNA： 0048 采用天根生物科技有限公司的生产的血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)， 按照操 作说明书进行样本(全血)DNA提取， 200 LEDTA抗凝全血按照说明书操作进行， 最后用50 L 的洗脱缓冲液TB溶解DNA， 于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度， 取 纯度A260/A280比值在1.71.9之间， 取浓度1050ng/ L的已提取的DNA用于SNP分型检 测， 其余的。
26、DNA均于-80冻存。 0049 3.实时荧光定量PCR扩增： 0050 3.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解， 混匀后置于冰上。 0051 3.2配制PCR反应混合液如表1。 0052 表1 说明书 4/6 页 6 CN 105969842 A 6 0053 0054 3.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液， 每管加入1 L的DNA， 充分混匀， 整个过 程在冰上进行， 避免气泡的产生。 每次实验设置一个阴性对照， 设置一个阳性纯合对照品1， 一个阳性纯合对照品2和一个阳性杂合对照品。 0055 3.4检测在实时荧光定量PCR仪器上进行， 可使用ABI7300， 7500(美国Ap。
27、plied Biosystems公司)等多种仪器。 0056 3.5设置荧光定量PCR反应条件如表2。 0057 表2 0058 0059 4.结果分析与处理： 应用ABI仪器自带软件进行结果分析。 根据对照扩增结果， 分 型产生三种基因型： 0060 第一种基因型： AA， 与阳性纯合对照品1在同一轴上； 0061 第二种基因型： AG， 与阳性杂合对照品在同一轴上； 0062 第三种基因型： GG， 与阳性纯合对照品2在同一轴上。 0063 实施例3.组织样本SNP检测分型 0064 1.组织样本处理： 0065 组织(脾组织用量应少10mg)应打碎处理为细胞悬液， 然后10000rpm(。
28、11200g) 离心1min， 倒尽上清， 加200 L缓冲液GA(天根DNA提取试剂盒DP304)， 震荡至彻底悬浮； 说明书 5/6 页 7 CN 105969842 A 7 0066 2.组织样本DNA提取和富集： 0067 采用天根生物科技有限公司的生产的DNA提取试剂盒(DP304),按照操作说明书进 行组织样本的DNA提取， 最后用50 L的洗脱缓冲液TE溶解DNA， 于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度； 0068 3.组织样本的SNP检测分型。 0069 后续步骤参照实施例2的步骤34。 0070 可应用范围： 0071 基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其检测方法可应用于人类组织样 本和血细胞Glu504lys的检测分型， 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发 明的优点。 说明书 6/6 页 8 CN 105969842 A 8 0001 序列表 1/2 页 9 CN 105969842 A 9 0002 序列表 2/2 页 10 CN 105969842 A 10 。