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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410087758.3 (22)申请日 2014.03.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103898056 A (43)申请公布日 2014.07.02 (73)专利权人 山东大学附属千佛山医院 地址 250014 山东省济南市历下区经十路 16766号 (72)发明人 孙青贾茹张建东岳龙涛 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 彭成 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 5/095。
2、(2010.01) 审查员 张丽玮 (54)发明名称 细胞培养基及其在培养人原代肿瘤细胞中 的应用 (57)摘要 本发明公开了一种细胞培养基， 原料配方 为： DMEM/HighGlucose （DMEM高糖培养基） 33.33ml； HAM S/F-12培养基66.67ml； 植物源重 组人血清白蛋白35mg/mL； 青霉素100U/ml； 链 霉素100 g/ml； 两性霉素B2.5 g/mL； 氢化可的松 0.20.5 g/ml； 胰岛素36 g/ml； 霍乱毒素B6 10ng/ml； 人表皮生长因子EGF912ng/ml； 腺 嘌呤2225 g/ml； Y-2763279 mol/L。。
3、 所述细 胞培养基可以用于培养人原代肿瘤细胞或肿瘤 干细胞。 本发明改进了培养基， 用于培养人原代 肿瘤细胞或肿瘤干细胞时， 能更好地促进原代肿 瘤细胞的生长， 获得更高比例的人肿瘤干细胞。 权利要求书1页 说明书8页 附图6页 CN 103898056 B 2016.09.07 CN 103898056 B 1.一种细胞培养基， 其特征在于： 原料配方为： DMEM/HighGlucose(DMEM高糖培养基) 33.33ml； HAM S/F-12培养基66.67ml； 植物源重组人血清白蛋白35mg/mL； 青霉素100U/ ml； 链霉素100 g/ml； 两性霉素B2.5 g/mL；。
4、 氢化可的松0.20.5 g/ml； 胰岛素36 g/ml； 霍乱毒素B610ng/ml； 人表皮生长因子EGF912ng/ml； 腺嘌呤2225 g/ml； Y-276327 9 mol/L。 2.根据权利要求1所述的细胞培养基， 其特征在于： 所述原料配方为： DMEM/HighGlucose(DMEM高糖培养基)33.33ml； HAM S/F-12培养基66.67ml； 植物源重 组人血清白蛋白5mg/mL； 青霉素100U/ml； 链霉素100 g/ml； 两性霉素B2.5 g/mL； 氢化可的 松0.4 g/ml； 胰岛素5 g/ml； 霍乱毒素B8.4ng/ml； 人表皮生长因子。
5、EGF10ng/ml； 腺嘌呤24 g/ml； Y-276327 mol/L。 3.权利要求1或2所述的细胞培养基在培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 具体应用方式如下： 用权利要求1或2的细 胞培养基重悬人原代肿瘤细胞后， 接种到用权利要求1或2的细胞培养基培养8小时后的细 胞饲养层上进行培养； 所述细胞饲养层的制备方法为： 采用DMEM培养基培养BALB3T3细胞， 细胞贴壁培养至铺 满培养瓶7080时， 以3000cGy作为放射剂量进行X线照射； 照射后的BALB3T3细胞若暂 时不进行原代细胞培养使用， 则用原DMEM培养基继续培养或。
6、收集冻存； 若进行原代细胞培养使用， 则改用权利要求1或2的细胞培养基培养8小时后， 所得培养 物即为细胞饲养层。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述放射剂量为3000cGy。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述进行X线照射的具体方式为： 照射时仪 器从0开始加量， 达到需要的放射剂量立即停止。 7.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述采用细胞培养基进行培养的培养条件 为： 保持温度37， CO2浓度为5。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103898056 B 2 细胞培养基及其在培养人原代肿瘤细胞中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种细胞培。
7、养基， 以及在培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞中的应 用。 背景技术 0002 目前常用的人肿瘤干细胞分离培养方法多采用无血清悬浮培养法， 从细胞株中对 含量极少的干细胞进行分离培养或者直接购买干细胞株进行悬浮培养， 而通过原代肿瘤细 胞贴壁培养的方法较难成功分离培养人肿瘤干细胞。 0003 饲养层在细胞培养中的使用情况： 国外有报道使用J2 （3T3细胞的一种亚型） 细 胞作为饲养层进行肿瘤细胞的原代培养， 但未提及使用其进行肿瘤干细胞培养。 而且， J2细 胞在作为饲养层的过程中需要严格控制其浓度与状态， 不易操作， 且目前在国内购买不到。 国外报道， 使用J2细胞作为饲养层要配合F培养基进。
8、行肿瘤细胞的原代培养。 我们在将J2 细胞更换为BALB3T3细胞并使用F培养基进行肿瘤细胞的原代培养时发现， 在原代细胞贴壁 生长初期， 会有很长一段时间的适应期， 之后才会进入对数生长期。 而使用改良F培养基进 行培养， 相比于F培养基， 培养的人原代肿瘤细胞能够尽快在饲养层脱落之前进入对数生长 期， 其生长速度与饲养层的脱落速度达到了更好地平衡， 原代细胞的生长速度明显高于使 用F培养基时原代细胞的生长速度， 且可获得更高比例的肿瘤干细胞。 发明内容 0004 针对上述现有技术存在的缺陷与不足， 本发明提供了一种细胞培养基， 以及在培 养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞中的应用。 0005 本。
9、发明是通过以下技术方案实现的： 0006 一种细胞培养基 （改良F培养基） ， 其原料配方为： DMEM/HighGlucose （DMEM高糖培 养基） 33.33ml； HAM S/F-12培养基66.67ml； 植物源重组人血清白蛋白 （Oryzogen， 购自武汉 禾元生物科技有限公司） 35mg/mL； 青霉素100U/ml； 链霉素100 g/ml； 两性霉素B2.5 g/ mL； 氢化可的松0.20.5 g/ml； 胰岛素36 g/ml； 霍乱毒素B610ng/ml； 人表皮生长因子 EGF912ng/ml； 腺嘌呤2225 g/ml； Y-27632 （Rho相关的卷曲蛋白激酶。
10、抑制剂） 79 mol/ L。 如表1所示。 0007 优选的， 所述改良F培养基的原料配方为： DMEM/HighGlucose （DMEM高糖培养基） 33.33ml； HAM S/F-12培养基66.67ml； 植物源重组人血清白蛋白 （Oryzogen， 购自武汉禾元 生物科技有限公司） 5mg/mL； 青霉素100U/ml； 链霉素100 g/ml； 两性霉素B2.5 g/mL； 氢化可 的松0.4 g/ml； 胰岛素5 g/ml； 霍乱毒素B8.4ng/ml； 人表皮生长因子EGF10ng/ml； 腺嘌呤24 g/ml； Y-27632 （Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂） 7 mo。
11、l/L。 0008 表1 改良的F细胞培养液成分及含量 说明书 1/8 页 3 CN 103898056 B 3 0009 0010 所述细胞培养基的制备方法为： 将各原料混合均匀， 即得。 0011 所述细胞培养基， 可以用于培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞， 具体方式为： 用本 发明的细胞培养基重悬人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞后， 接种到细胞饲养层上进行培养。 0012 所述细胞饲养层的制备方法如下： 采用DMEM培养基培养 （现有技术中已有的通用 常规培养基） BALB3T3细胞， 细胞贴壁培养至铺满培养瓶70%80%时， 选细胞生长状态好的 培养瓶进行照射 （按照30%的底面积浓度接种， 。
12、一般底面积为25cm2的培养瓶2天能够达到所 需细胞量） ,以3000cGy作为放射剂量进行X线照射 （照射时仪器从0开始加量， 达到需要的放 射剂量立即停止） ； 照射后的细胞放回培养箱中继续培养。 若进行人原代肿瘤细胞或肿瘤干 细胞培养， 需用本发明的改良F培养基进行培养 （培养条件为常规培养条件， 比如： 保持温度 37， CO2浓度为5%）（此时使用改良F培养基进行培养的目的是： 促进BALB3T3细胞释放一些 有利于人原代肿瘤细胞或者肿瘤干细胞生长所需要的物质， 使人原代肿瘤细胞能够尽快在 饲养层脱落之前进入对数生长期， 其生长速度与饲养层的脱落速度达到更好地平衡， 便于 接种之人原。
13、代肿瘤细胞或肿瘤干细胞更好地生长） 。 培养8小时后， 所得培养物可用作细胞 饲养层。 制备好的细胞饲养层在一周之内都可使用， 超过一周应同样方法重新制备。 若照射 后的BALB3T3细胞暂时不作为细胞饲养层使用， 也可收集冻存或用原DMEM培养基继续培养， 待使用前8小时左右再换成改良F培养基制备细胞饲养层。 0013 本发明改进了制备细胞饲养层的细胞类型以及培养基， 3T3细胞较J2细胞容易获 得， 且在其培养过程中细胞浓度与状态容易控制。 改良的培养基用于培养人原代肿瘤细胞 时， 能更好地促进细胞的生长， 并获得更高比例的人肿瘤干细胞 （CD44阳性细胞数提高约 80%） 。 附图说明 。
14、0014 图1： BALB3T3细胞铺满6孔板底部70%； 放大倍数： 104。 0015 图2： 照射量为2800cGy的BALB3T3细胞于照射后7天； 放大倍数： 104。 0016 图3： 照射量为2900cGy的BALB3T3细胞于照射后7天； 放大倍数： 104。 0017 图4： 照射量为3200cGy的BALB3T3细胞于照射后7天； 放大倍数： 104。 说明书 2/8 页 4 CN 103898056 B 4 0018 图5： 丝裂霉素(20ug/ml)处理2小时后的BALB3T3细胞， 接种上直肠原发癌细胞20 天后； 放大倍数： 104。 0019 图6： 去除胰岛素的。
15、F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0020 图7： 去除氢化可的松的F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0021 图8： 去除霍乱毒素B的F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0022 图9： 去除腺嘌呤的F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0023 图10： 去除人表皮生长因子EGF的F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 10 4。 0024 图11： 去除Y-27632的F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0025 图12： 改良F培养。
16、液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0026 图13： 普通F培养液培养BALB3T3细胞72小时； 放大倍数： 104。 0027 图14： 接种于DMEM培养液的细胞饲养层上的原代结肠癌细胞培养8天； 放大倍数： 104。 0028 图15： 接种于本发明的改良F培养液的细胞饲养层上的原代结肠癌细胞培养8天； 放大倍数： 104。 0029 图16： 接种于改良F培养基BALB3T3饲养层上的原代结肠癌细胞传代4天； 放大倍 数： 104。 0030 图17： 接种于无饲养层上的原代结肠癌细胞传代4天。 放大倍数： 104。 0031 图18： 结肠癌细胞培养前流式细。
17、胞学检测结果 （CD133PE、 CD44FITC） ， 其中， A： 通过 前向角散射光和侧向角散射光选定需要研究的细胞群体； B： 图中P3所示为CD133PE阳性细 胞； C： 图中P5所示为CD44FITC阳性细胞。 0032 图19： 结肠癌细胞培养后流式细胞学检测结果 （CD133PE、 CD44FITC） ， 其中， A： 通过 前向角散射和侧向角散射选定需要研究的细胞群体； B： 图中P3所示为CD133PE阳性细胞； C： 图中P5所示为CD44FITC阳性细胞。 0033 图20： 免疫组化广谱CK标记； 放大倍数： 4010。 图中可见， 阳性标记表现为细胞浆 呈棕色。 。
18、0034 图21： 免疫组化CK20标记； 放大倍数： 4010。 图中可见， 阳性标记表现为细胞浆呈 棕色。 0035 图22： 使用F培养基培养接种到BALB3T3饲养层上的结肠癌原代细胞仍能继续生长 传代； 放大倍数： 104。 0036 图23： 使用改良F培养基培养接种到BALB3T3饲养层上的结肠癌原代细胞仍能继续 生长传代； 放大倍数： 104。 0037 图24： 使用F培养基培养接种到J2饲养层上的结肠癌原代细胞死亡； 放大倍数： 10 4。 0038 图25： 使用改良F培养基培养接种到J2饲养层上的结肠癌原代细胞死亡； 放大倍 数： 104。 具体实施方式 0039 下面。
19、结合实施例对本发明作进一步的说明。 说明书 3/8 页 5 CN 103898056 B 5 0040 实施例一细胞饲养层的制备 0041 （一） X线剂量的确定： 0042 （1） 6孔板使用1%明胶包被， 置于37， 二氧化碳含量为5%的二氧化碳恒温培养箱 中过夜后， 吸去明胶， 使用PBS冲洗3遍以上。 0043 （2） 向6孔板中接种相同浓度的BALB3T3细胞 （购于上海细胞库） 使用DMEM细胞培养 液进行培养， 待其铺满6孔板底部70% （图1） ， 每孔加入培养液至8ml， 置于6MV低能X线下进行 梯度照射 （源皮距100cm） ， 照射强度分别是2200cGy、 2400c。
20、Gy、 2600cGy、 2800cGy、 2900cGy、 3000cGy、 3100cGy、 3200cGy、 3300cGy。 0044 （3） 密切观察经过照射的BALB3T3细胞的生长情况， 以确定最佳放射剂量。 如图2 图4所示： 其中， 照射量为2200cGy、 2400cGy、 2600cGy、 2800cGy的BALB3T3细胞于后7天均逐 渐长满 （图2） ； 照射量为2900cGy、 3000cGy、 3100cGy的BALB3T3细胞照射后进行培养细胞量 无变化 （图3） ； 照射量为3200cGy、 3300cGy的BALB3T3细胞逐渐死亡并脱落 （图4） ， 故2。
21、900 3100cGy为使用BALB3T3细胞作为饲养层时的最佳放射剂量范围。 0045 （4） 选择3000cGy作为最佳放射剂量于6孔板中制备BALB3T3细胞饲养层， 备用。 0046 （二） 丝裂霉素处理BALB3T3饲养层的缺点： 0047 丝裂霉素处理BALB3T3饲养层时， 浓度不易掌握， 浓度低了不能完全抑制 BALB3T3细胞的分裂， 浓度高了又会造成BALB3T3细胞的死亡。 0048 使用丝裂霉素处理BALB3T3细胞可出现细胞耐药现象， 即处理后部分细胞停止 分裂， 还有部分细胞会继续分裂增殖。 0049 丝裂霉素处理后的BALB3T3细胞接种上肿瘤细胞后， 部分出现肉。
22、瘤样改变， 即原 来停止分裂的BALB3T3细胞增大、 异型， 且重新开始分裂生长， 表现出肉瘤的形态和生长特 征 （图5） 。 0050 （三） 改良细胞培养液： 0051 （1） 细胞培养液的配置： 常规F细胞培养液的成分及含量如表2所示。 本发明改良的 F细胞培养液的成分及含量如表3所示。 0052 表2 F细胞培养液的成分及含量 0053 说明书 4/8 页 6 CN 103898056 B 6 0054 表3 改良的F细胞培养液成分及含量 0055 0056 （2） F培养液各成分改变对培养细胞生长影响的检测： 以表2所示的F培养液培养 BALB3T3细胞， 每组做三个平行对照， 调。
23、整细胞接种浓度为0.22108/L， 依次使用去除下列 成分 （表4） 的F培养基进行培养， 72小时后使用血细胞计数板计数， 结果如表4以及图6图 11所示。 接种的细胞为未经X线照射的细胞， 接种于无饲养层的细胞培养瓶中培养。 通过表4 的数据可得出F培养基中的胰岛素、 氢化可的松、 霍乱毒素B、 腺嘌呤、 EGF和Y-27632均在细 胞的生长中起到重要的作用， 不可省略。 0057 表4 改良F培养液成分后的检测 0058 0059 （3） 使用植物源重组人血清白蛋白 （OsrHSA） 替代血清改良F培养液 0060 向6孔板中接种相同浓度的Love结肠癌细胞， 分别使用含OsrHSA。
24、浓度为1.25mg/ mL、 2.5mg/mL、 3.75mg/mL、 5mg/mL、 6.25mg/mL7.5mg/mL的改良F培养液 （相对于表2中的F培 养液而言， 其它物质的浓度不变） 进行培养， 72小时后细胞浓度出现明显差别， 使用血细胞 计数板计数如表5所示。 由表可知， 5mg/mL为OsrHSA比较适宜的浓度。 0061 （4） 改良F培养液 （表3所示） 与普通F培养液 （表2所示） 的对比： 如表6、 图12、 如13所 示。 0062 表5 不同OsrHSA浓度对Love结肠癌细胞生长的影响 （接种浓度0.22108） 说明书 5/8 页 7 CN 103898056 。
25、B 7 0063 0064 表6 改良F培养液与普通F培养液对Love结肠癌细胞生长的影响 （初始浓度0.1 108/L） 0065 0066 （5） 改良F培养液与DMEM培养液的对比： 0067 接种于BALB3T3饲养层上的原代结肠癌细胞于接种34d后开始逐渐沿饲养层细 胞间隙贴壁生长， 同时BALB3T3饲养层细胞逐渐死亡脱落； 接种于无饲养层的6孔板中的原 代结肠癌细胞均未生长。 78d后培养于改良F培养基BALB3T3饲养层上的原代结肠癌细胞 随着饲养层细胞的大量死亡， 生长速度开始下降； 培养于DMEM培养液中的BALB3T3饲养层细 胞脱落较少， 原代结肠癌细胞在饲养层细胞间隙。
26、中生长形成肿瘤细胞团并推挤饲养层细 胞， 且细胞生长明显较低 （图14、 15所示） 。 0068 实施例二细胞饲养层培养原代结肠癌细胞 0069 （1） 用DMEM培养基 （表7所示） ， 于6孔板中培养BALB3T3细胞， 以3000cGy作为放射剂 量进行照射。 照射后的BALB3T3细胞换成改良F培养基， 培养8小时后作为细胞饲养层使用。 具体如下： 0070 采用DMEM培养基于6孔板中培养BALB3T3细胞， 细胞贴壁培养至铺满培养瓶70% 80%时， 选细胞生长状态好的培养瓶进行照射 （按照30%的底面积浓度接种， 一般底面积为 25cm2的培养瓶2天能够达到所需细胞量） ,以3。
27、000cGy作为放射剂量进行X线照射 （照射时仪 器从0开始加量， 剂量达到需要的放射剂量立即停止） ； 照射后的细胞放回培养箱中， 添加改 良F培养基 （表3所示） 进行培养， 保持温度37， CO2浓度为5%； 使用改良F培养基培养8小时 后， 所得培养物可用作细胞饲养层， 制备好的饲养层在一周之内都可使用， 超过一周应该重 新制备新的细胞饲养层。 0071 表7 DMEM细胞培养液的配置 说明书 6/8 页 8 CN 103898056 B 8 0072 0073 （2） 将取下的黄豆粒大小的新鲜结肠癌组织标本放入小瓶中， 加入75%的酒精浸泡 30秒后取出， 使用PBS缓冲液反复冲洗以。
28、去除残余酒精。 0074 （3） 剪掉标本表面被酒精固定的一层细胞， 依次使用洗液 (含1000U/ml青霉素、 1000 g/ml链霉素、 25 g/mL两性霉素B的生理盐水） 、 洗液 （含160 g/ml庆大霉素的生理盐 水） 冲洗组织块各三遍。 0075 （4） 使用研磨法获取细胞悬液后放入标记好的15mL离心管中， 1000rpm离心5min去 除上清， 收集细胞沉淀。 0076 （5） 使用改良F培养基 （表3所示） 重悬细胞后， 接种到步骤 （1） 中制备好的BALB3T3 饲养层上进行原代细胞培养。 以接种到无饲养层细胞的改良F培养基中为空白对照， 以接种 到J2细胞 （美国G。
29、eorgetownUniversity肿瘤遗传实验室赠送） 饲养层为对照。 0077 （一） 使用BALB3T3饲养层和不使用饲养层原代培养的差异： 0078 接种于改良F培养基BALB3T3饲养层上的原代结肠癌细胞培养7天后进行传代， 继 续接种于饲养层上的细胞可以继续进行传代培养 （图16） ， 而接种于无饲养层6孔板中的细 胞， 逐渐死亡 （图17） 。 接种于改良F培养基BALB3T3饲养层上的原代结肠癌细胞经免疫组化 染色显示广谱CK （+） 、 CK20 （+） ， 证明此细胞为结肠癌细胞 （图20、 21） 。 0079 （二） 使用BALB3T3作为饲养层， 联合使用改良F培养。
30、基培养原代结肠癌细胞前后 CD44(+)和CD133(+)肿瘤干细胞 （CSC） 含量的差异： 如图18、 19所示， 对比培养前后流式细胞 学检测结果， 使用BALB3T3细胞作为饲养层， 同时使用改良F培养基能够成功对原代结肠癌 组织中的CSC进行培养， 且经过一次传代后CD44 （+） CD133 （-） 细胞比例由培养前的0.3%上升 到83.4%， CD44 （+） CD133 （+） 细胞比例由0.1%上升到30.5%， 而CD44 （-） CD133 （+） 细胞在培养 前为1.2%， 培养后为1.8%， 变化不明显。 结论： 应用BALB3T3细胞作为饲养层同时使用改良F 培养。
31、基能够显著提高原代结肠癌细胞中CD44 （+） 和CD44 （+） CD133 （+） CSC细胞的比例。 0080 （三） BALB3T3和J2作为饲养层的差异 0081 （1） 使用BALB3T3作为饲养层成功通过原代培养技术培养出上述结肠癌细胞并进 行流式细胞分选。 在BALB3T3饲养层上生长良好的结肠癌原代细胞传代时分别接种到 BALB3T3和J2饲养层 （同样接受低能X线处理的） 上后， 接种到BALB3T3饲养层上的结肠癌原 代细胞仍能继续生长传代 （图22、 23） ， 接种到J2饲养层上的结肠癌原代细胞死亡 （图24、 25） 。 0082 （2） 使用J2细胞作为饲养层细胞。
32、相比BALB3T3细胞存在以下缺点： 0083 J2细胞在国内资源很少， 几大知名细胞库几乎都很难找到资源， 即便有， 价格也 比较昂贵； BALB3T3细胞则很容易得到， 且价格便宜。 0084 J2细胞作为饲养层使用时， 对细胞的密度要求很高， 一般不能超过培养皿面积 说明书 7/8 页 9 CN 103898056 B 9 的70%， 更不能让细胞连成片， 一旦细胞出现细胞簇后便不能作为饲养层使用。 BALB3T3的培 养则不需要如此严格， 细胞的浓度对其作为饲养层的影响不大。 说明书 8/8 页 10 CN 103898056 B 10 图1 图2 图3图4 图5 图6 说明书附图 1/6 页 11 CN 103898056 B 11 图7 图8 图9 图10 图11 图12 说明书附图 2/6 页 12 CN 103898056 B 12 图13 图14 图15图16 图17 说明书附图 3/6 页 13 CN 103898056 B 13 图18 说明书附图 4/6 页 14 CN 103898056 B 14 图19 图20图21 说明书附图 5/6 页 15 CN 103898056 B 15 图22图23 图24图25 说明书附图 6/6 页 16 CN 103898056 B 16 。