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1、(10)授权公告号 CN 102766663 B (45)授权公告日 2014.11.05 CN 102766663 B (21)申请号 201210245527.1 (22)申请日 2012.07.16 CCTCC NO ： M2012080 2012.03.14 201210173616.X 2012.05.30 CN C12P 19/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安南路 199 号 (72)发明人 马小魁 张红 王喆之 陈勇 崔浪军 郑鹏 刘陶 李峻志 韩葵葵 (74)专利代理机构 西安永。
2、生专利代理有限责任 公司 61201 代理人 申忠才 CN 101130756 B,2010.08.25, 说明书全文 . CN 101348803 B,2010.12.15, 说明书全文 . CN 101983955 A,2011.03.09, 说明书全文 . 杨全 等 . 药用真菌桑黄液体发酵工艺的研 究 .广东药学院学报 .2004, 第 20 卷 ( 第 3 期 ),212-216. 牛广财 等 . 响应面法优化桑黄菌产胞外 多糖液体发酵培养基的研究 .生物数学学 报 .2009, 第 24 卷 ( 第 3 期 ),523-530. 骆婷 . 桑黄的生物学特性及其发酵培养 条件的优化 。
3、.中国硕士学位论文全文数据 库 .2011,( 第 S 期 ), 全文 . 郭霞 . 桑黄发酵过程优化及其多糖代 谢调控研究 .中国博士学位论文全文数据 库 .2010,( 第 8 期 ), 全文 . 秦俊哲 等 . 桑黄菌丝的最适培养条件研 究 .食用菌 .2007,( 第 1 期 ), 第 6-9 页 . 祝明思 等 . 桑黄菌丝体液体发酵培养条件 的研究 .中国酿造 .2010,( 第 11 期 ),88-91. 雷萍 等 . 桑树桑黄液体发酵培养基优化初 报 .食用菌 .2010,( 第 6 期 ),15-16. (54) 发明名称 桑黄活性多糖的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一。
4、种桑黄活性多糖的制备方法， 对培养基进行优化， 在培养基中添加了抗氧化剂、 天门冬氨酸、 维生素等化学因子对桑黄菌丝体的 生长有显著的影响并优化了配方和工艺条件， 大 大提高了桑黄活性多糖的产率和多糖活性， 另外， 在培养基中添加了抗氧化剂， 克服或缓解了非自 然条件下真菌细胞生长和合成活性多糖的胁迫条 件， 本发明方法简单， 副产物少， 适用于工业化应 用， 为后续相关产品的开发奠定了基础。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张林 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发。
5、明专利 权利要求书1页 说明书12页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102766663 B CN 102766663 B 1/1 页 2 1. 一种桑黄活性多糖的制备方法， 其特征在于 ： 所述方法包含有以下的步骤 ： 1) 菌种活化 在改良 PDA 培养基中接种桑黄菌丝体， 25 30， 有氧避光培养至桑黄菌丝体长满斜 面 ； 上述的改良 PDA 培养基中， 以 1L 计算 ： 马铃薯 190g、 葡萄糖 15g、 琼脂 20g、 抗氧化剂 1.5g， 余量为水， 改良 PDA 培养基的 pH 为 6.5 ； 上述桑黄菌丝体的名称为 Phellinus sp.P0988， 保藏单位为中。
6、国典型培养物保藏中 心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012080， 保藏日期是 2012 年 3 月 14 日 ； 2) 一级种子液培养 按照每 50ml 的种子液培养基中接入 3 块 1cm2的斜面菌种的量， 将活化后的斜面菌种 接入装有种子液培养基的三角瓶中， 25 30， 摇床培养 120 240 小时， 摇床转速 150 180r/min ； 上述的种子液培养基中， 以 1L 计算 ： 马铃薯 230g、 葡萄糖 15g、 KH2PO41g、 MgSO40.5g、 抗 氧化剂 3g、 CaCl20.5g、 FeSO40.25g， 余量为水， 种子液培养基的 pH 为 6.。
7、5 ； 3) 二级种子液培养 将步骤 2) 所得的菌种按照菌种与种子液培养基的体积比为 1 ： 10 15 的量接入装有 种子液培养基的三角瓶中， 2530摇床培养120小时， 摇床转速180r/min， 得到扩大培养 的菌种 ； 4) 定向发酵 将步骤 3) 扩大培养的菌种转接入装有定向发酵培养基的发酵罐中， 菌种与定向发酵 培养基的体积比为 1 ： 12， 保持罐温 28， 罐压 0.5-0.7kPa， 搅拌速率 350rpm， 通气量为 1 ： 0.5 0.7v/vm， 发酵 198 小时， 得到发酵液 ； 上述的定向发酵培养基中， 以 1L 计算 ： 麦芽粉 11g、 葡萄糖 60g、。
8、 FeSO40.25g、 抗氧化剂 2.5g、 天门冬氨酸 3.3g、 MgSO41g、 KH2PO41g、 复合维生素 0.025g、 吐温 80 4g， 余量为水， 定向 发酵培养基的 pH 为 6.5 ； 5) 提取桑黄活性多糖 将步骤 4) 得到的发酵液打到减压浓缩器中， 浓缩至浓缩液的体积为原发酵液体积的 0.1 0.25 倍， 转移到贮罐中， 经板框压滤， 压滤清液浓缩， 加入乙醇至乙醇在浓缩清液中 的体积浓度达到 60 80， 低温醇析 10 20 小时， 取沉淀物用去离子水溶解， 喷雾干 燥， 得到桑黄活性多糖 ； 所述的抗氧化剂是维生素 C 或维生素 P。 权 利 要 求 书。
9、 CN 102766663 B 2 1/12 页 3 桑黄活性多糖的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种定向发酵获得桑黄活性多糖的方法， 特别是一种通过培养基成分 优化配置， 利用桑黄菌丝体定向合成水溶性桑黄活性多糖的方法。 背景技术 0002 桑黄， 属担子菌亚门 (Basidiomycota)、 多孔菌科、 木层孔菌属， 是火木层孔菌 (P.igniarius)， 鲍氏针层孔菌， 裂蹄针层孔菌 (P.linteus) 的俗称， 又称桑臣、 桑耳、 胡孙 眼、 桑黄菇。桑黄主要活性成分为桑黄多糖， 桑黄活性多糖干粉逐渐或已经走向国内外市 场。在桑黄的药用价值被广泛揭示以及市场前景看好。
10、的同时， 桑黄的产量已经成为抑制桑 黄应用的主要限制因素。由于其菌物特征的特殊性和复杂性以及受生存条件的制约， 在自 然界中其很难形成子实体， 往往需要多年才能形成可用子实体。 而且室内培养条件苛刻， 人 工栽培及其困难， 且生长周期长达 3-4 年。而且， 由于桑黄价格昂贵及供不应求， 必然导致 人们对桑黄菌的无序采集， 目前存在的问题是 ： 天然桑黄资源匮乏， 面临枯竭， 不仅难以满 足市场需要， 而且有些地方的某些种质资源几近灭绝。所以利用生物工程进行液体发酵生 产菌丝体和人工栽培的研究非常重要。因此， 深层液体培养技术规模化生产桑黄菌丝体以 及其活性多糖物质是满足国内外市场对桑黄相关产。
11、品需求的有效途径之一。目前， 国内外 有关桑黄的研究多集中于深层液体发酵条件优化、 多糖分离纯化技术、 多糖分子结构解析、 抗癌、 免疫活性机理等方面。 0003 敖宗华等人公开了大规模化液体深层发酵生产桑黄水提物及多糖 ( 专利号为 ： 200410013869.6)， 其以大规模液体发酵制取桑黄多糖， 此外， 邹祥等人公开了一种用于桑 黄菌液体培养的合成培养基及发酵生产桑黄多糖的方法 （专利号为 ： 200810070224） 以及 中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法 （专利号为 ： 200710018319） ， 这些对促进桑黄多 糖产品的开发有重要的意义。 0004 但是， 调研文献发。
12、现， 目前几乎所有技术文献， 只关注桑黄培养的目的是获得高的 多糖含量以及菌丝体， 但在生产阶段， 其多糖活性几乎无从考虑， 这就严重影响着此类产品 的质量和使用效果。由于复合碳氮源或这些复杂培养基的成分复杂， 批次之间存在成分上 的差异， 往往造成桑黄菌液体培养生产菌丝体产量和多糖分子量不稳定， 同时也给桑黄多 糖的下游提取分离带来困难。目前， 从现有文献分析， 就菌种制备而言， 为了保证桑黄菌株 的旺盛生长， 许多技术提到要加入桑树枝或树叶， 或者丰富的维生素或氨基酸。这些措施 虽然可以满足菌株的活化和生长， 但是， 从工业生产的角度而言， 如果以此方法制备菌种， 由于桑树枝等农副产品质量。
13、不稳定， 而且其所含营养成分受自然条件影响大， 必然对建立 规模化的稳定工艺不利。现有技术中也有这样的文献记载， 其培养方法是采用 PDA 培养基 来进行种子液甚至生产发酵液培养， 而这种及其复杂的培养基配方是不利于产品的分离纯 化， 也不能满足现代医药产品生产要求的需要。 目前， 国内外还没有有关针对桑黄水溶性胞 外活性多糖和高活性菌丝体培养的工艺和技术的文献和专利报道， 虽然有很多文献报道了 其所具有的活性的实验结果。 说 明 书 CN 102766663 B 3 2/12 页 4 0005 现有生产或发酵合成桑黄菌丝体或多糖的方法中， 多以获得高含量的菌丝体和多 糖为主要目的。 虽然， 。
14、这些技术体系所获得的菌丝体和多糖也证明有一定的抗氧化、 抗肿瘤 细胞生长、 提高免疫力等功能， 但是这些功能试验多是以体内动物或体外培养细胞试验而 证明多糖功能的， 而且对多糖的功能验证是滞后于生产过程的。 而且， 从多糖含量分析测定 而言， 多使用苯酚硫酸法进行检测， 而此种检测体系无法排除培养基中诸如葡萄糖、 蔗糖等 还原性多糖成分或含有相应和硫酸 - 苯酚试剂发生反应的基团物质的影响， 因此对生产过 程所获得的多糖的准确定量难以完成， 常常导致虽含有高浓度多糖， 但却无相应功能的假 象， 严重影响了桑黄菌丝体以及多糖产品的使用效果和市场推广。如果忽视或有意忽略液 体发酵过程中获得多糖和菌。
15、丝体活性的检测， 是难以保证规模化生产此类产品的质量的。 而且， 还应注意到， 多糖属于一类次级代谢物， 而此类物质的合成在自然界中自有其特定的 规律和条件。最近研究已经证明， 真菌合成三大类次级代谢物的基因簇在实验室标准培养 条件下， 往往处于沉默状态。 如果仅仅是满足获得高含量菌丝体或多糖， 不考虑其所含活性 物质的多少或具体活性的高低， 必然难以保证此类物质生产的有效性和实际使用过程中的 效果。 研究还证实 ： 在stress response条件下， 液体培养桑黄或其他真菌获得具有活性的 多糖和菌丝体是和自然条件下的培养条件具有很大差异的， 参与这些物质和菌丝体形成基 因的表达和翻译的。
16、条件是有很大不同的。 具体针对合成活性多糖而言， 自然界中， 真菌活性 多糖的合成是在相对温和、 并且相对平衡的状态下合成的， 一般要获得相应产物和菌丝的 时间很长， 过程复杂， 受自然条件影响大， 获得相应产品是要经过大自然多种条件的洗礼才 能完成 ； 在深层液体培养条件下， 菌丝细胞在氧气充足、 营养相对丰富等体外条件下， 细胞 合成活性多糖的基因表达和翻译的条件和桑黄菌在自然条件下相比有很大改变。 在这些变 化的基因中， 针对于合成活性多糖， 变化很明显的就是好氧环境的改变， 而此改变使得细胞 在此条件下会产生大量的自由基 ； 而细胞要在体外这种特殊条件下， 能够正常生长并合成 功能性多。
17、糖， 据推测可能就要首先清除体内的这些自由基， 典型的清除自由基的体内酶包 括 SOD（超氧化物歧化酶） 要参与这一过程。而此类酶系要参与这些过程， 需要一些特殊的 条件， 如这类酶需要 Fe、 Cu 等离子和酶分子的活性中心相结合， 从而激活这些酶的活性， 或 者其他的特殊的活性维护条件， 以保证菌丝细胞的存活和进一步的合成活性产物。 0006 而且研究还表明， 从自然界分离得到的真菌， 如果在标准实验室培养条件下， 细胞 是处于一种 Stress response 状态下， 因此， 细胞要发挥其正常的生理功能， 就需要克服细 胞处于不利环境下的各种障碍， 以完成菌丝生长和合成多糖的生理活动。
18、。 但是， 由于一般人 工条件下很难满足细胞的相应生理活动的需要， 导致细胞生长速度减慢、 合成功能化合物 能力下降或消失。定向发酵是基于菌株代谢自然规律， 为了生产合成目的产物而采取一定 措施如添加特殊抑制剂、 弱化或强化相关基因的表达， 而完成在特定条件下合成特定目的 产物的生理活动。基于真菌细胞在非自然或人工培养条件下面临着诸多因素的胁迫， 而目 前最受关注的就是氧化胁迫， 这种外在的和自然界真菌所处环境不一样的条件导致真菌细 胞不能发挥相应的功能。 0007 目前的技术体系， 多采用天然或半合成培养基成分， 但由于忽略或没有注意到真 菌细胞在非自然条件下的 “氧化胁迫” 状态对其生长和。
19、合成多糖的影响。经调研， 目前所报 道或申请专利的技术体系， 在利用桑黄菌株获得菌丝体产品或多糖产品时， 大多只以获得 高比例的菌丝体或高浓度的多糖为主要或唯一目的， 而没有注意到真菌在非自然条件下所 说 明 书 CN 102766663 B 4 3/12 页 5 受环境的巨大差异对其合成活性多糖的影响。 0008 总结而言， 现有的这些制备方法主要存在有以下几个问题 ： 0009 1、 现有的桑黄液体培养方法中采用的发酵培养基多采用天然农副产品如土豆汁、 糖蜜、 黄豆饼粉、 玉米浆、 或者复杂的氨基酸组合、 植物提取物等为碳氮源， 由于复合碳氮源 或这些复杂培养基的成分复杂， 批次之间存在成。
20、分上的差异， 往往造成桑黄菌液体培养桑 黄多糖分子量不稳定， 给桑黄多糖的下游提取分离带来困难， 而且该种方法对桑黄多糖的 制取产率仍然偏低， 不能满足现有市场对桑黄的需求。 0010 2、 目前大多数的技术文献， 关注桑黄培养的目的是获得较高的桑黄多糖含量， 对 多糖活性几乎无从考虑， 严重影响到此类产品的质量和使用效果。 0011 3、 为了保证桑黄菌株的旺盛生长， 许多技术提到要加入桑树枝或树叶， 或者丰富 的维生素或氨基酸， 这些措施虽然可以满足菌株的活化和生长， 但是， 从工业生产的角度而 言， 如果以此方法制备菌种， 由于桑树枝等农副产品质量不稳定， 而且其所含营养成分受自 然条件。
21、影响大， 必然对建立规模化的稳定工艺不利， 不适于工业化生产。 0012 4、 现有技术中在利用桑黄菌株获得菌丝体产品或多糖产品时， 大多只以获得高浓 度的多糖为主要目的， 而没有注意到真菌在非自然条件下所受环境的巨大差异对其合成活 性多糖的影响。 发明内容 0013 本发明的目的是解决目前桑黄活性多糖合成技术中所存在的问题， 提供了一种桑 黄多糖产率高、 适于工业化生产、 产品质量稳定的桑黄活性多糖的制备方法。 0014 解决上述技术问题采用的技术方案是 ： 0015 本发明的桑黄活性多糖的制备方法包含有以下的步骤 ： 0016 1） 菌种活化 0017 在改良 PDA 培养基中接种桑黄菌丝。
22、体， 25 30， 有氧避光培养至桑黄菌丝体长 满斜面 ； 0018 上述的 1L 改良 PDA 培养基中 ： 马铃薯 180 200g、 葡萄糖 10 20g、 琼脂 20g、 抗 氧化剂 0.5 6g， 余量为水， 改良 PDA 培养基的 pH 为 6.5 ； 0019 2) 一级种子液培养 0020 按照每 50ml 的种子液培养基中接入 3 块 1cm2的斜面菌种的量， 将活化后的斜面 菌种接入装有种子液培养基的三角瓶中， 25 30， 摇床培养 120 240 小时， 摇床转速 150 180r/min ； 0021 上述的 1L 种子液培养基中 ： 马铃薯 200 260g、 葡萄。
23、糖 5 30g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 抗氧化剂 1 6g、 CaCl2 0.1 2g、 FeSO4 0.05 0.35g， 余量为水， 种子液培养基的 pH 为 6.5 ； 0022 3） 二级种子液培养 0023 将步骤 2） 所得的菌种按照菌种与种子液培养基的体积比为 1 ： 10 15 的量接入 装有种子液培养基的三角瓶中， 2530摇床培养120小时， 摇床转速180r/min， 得扩大培 养的菌种 ； 0024 4） 定向发酵 说 明 书 CN 102766663 B 5 4/12 页 6 0025 将步骤 3） 扩大培养的菌种转接入装有定向发酵培养基的发酵。
24、罐中， 菌种与定向发 酵培养基的体积比为1 ： 1015， 保持罐温2829， 罐压0.50.7kPa， 搅拌速率300 400rpm， 通气量为 1 ： 0.5 0.7v/v.m， 发酵 180 220 小时， 得到发酵液 ； 0026 上述的 1L 定向发酵培养基中 ： 麦芽粉 5 20g、 葡萄糖 15 100g、 FeSO4 0.1 0.6g、 抗氧化剂16g、 天门冬氨酸0.58g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 12g、 复合维生素0.001 0.05g、 吐温 80 1 10g， 余量为水， 定向发酵培养基的 pH 为 6.5 ； 0027 5） 提取桑黄活性多糖 0028 。
25、将步骤 4） 得到的发酵液打到减压浓缩器中， 浓缩至浓缩液的体积为原发酵液体积 的 0.1 0.25 倍， 转移到贮罐中， 经板框压滤， 压滤清液浓缩， 加入乙醇至乙醇在浓缩清液 中的体积浓度达到 60% 80， 低温醇析 10 20 小时， 取沉淀物用去离子水溶解， 喷雾干 燥， 得到桑黄活性多糖。 0029 上述步骤 4）的定向发酵培养基中 ： 麦芽粉 8 15g、 葡萄糖 20 100g、 FeSO4 0.2 0.5g、 抗氧化剂 1 6g、 天门冬氨酸 0.5 8g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 1g、 复合维生素 0.001 0.05g、 吐温 80 1 10g， 余量为水， 。
26、定向发酵培养基的 pH 为 6.5。 0030 上述步骤1） 的改良PDA培养基中 ： 马铃薯185195g、 葡萄糖1318g、 琼脂20g、 抗氧化剂 1 2g， 余量为水。 0031 上述步骤 2） 中的种子液培养基中 ： 马铃薯 220 240g、 葡萄糖 10 20g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 抗氧化剂 2 5g、 CaCl2 0.1 1g、 FeSO4 0.1 0.25g， 余量为水， 种子液 的 PH 为 6.5。 0032 上述抗氧化剂是维生素 C 或维生素 P 或芦丁。 0033 上述步骤 1） 所述桑黄菌丝体的名称为桑黄 P0988 （Phellinu。
27、s sp.P0988） ， 保藏单 位为中国典型培养物保藏中心， 保藏单位地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012080， 保藏日期是 2012 年 3 月 14 日。 0034 本发明主要在桑黄活性多糖的制备方法中对培养基进行优化， 在培养基中添加了 抗氧化剂、 天门冬氨酸、 维生素等化学因子对桑黄菌丝体的生长有显著的影响并优化了配 方和工艺条件， 大大提高了桑黄活性多糖的产率和多糖活性， 另外， 在培养基中添加了抗氧 化剂， 克服或缓解了非自然条件下真菌细胞生长和合成活性多糖的胁迫条件， 本发明方法 简单， 副产物少， 适用于工业化应用， 为后续相关产品的开。
28、发奠定了基础。 附图说明 0035 图 1 为本发明的影响多糖含量因素的标准化效应 pareto 图。 0036 图 2 为本发明的影响总抗氧化活性因素的标准化效应 pareto 图。 具体实施方式 0037 现结合附图和试验对本发明的桑黄活性多糖的制备方法进行进一步说明， 但是本 发明不仅限于下述的实施例。 0038 实施例 1 0039 本实施例的桑黄活性多糖的制备方法包括以下步骤 ： 0040 步骤 1 ： 菌种活化 说 明 书 CN 102766663 B 6 5/12 页 7 0041 取出 1 块 1cm2的桑黄菌丝体接入配制好的 20ml 的改良 PDA 培养基中， 28， 有氧。
29、 避光培养 240 小时至桑黄菌丝体长满斜面后取出， 4冰箱中保存 ； 0042 上述的改良 PDA 培养基的组成为 ： 马铃薯 190g， 葡萄糖 15g， 琼脂 20g， 维生素 P 1.5g， 水添加至 1L， 培养基的 pH 值为 6.5。 0043 步骤 2 ： 一级种子液培养 0044 取 3 块步骤 1 中 1cm2大小的斜面菌种转接入装有 50ml 种子液培养基的 250ml 容 量的三角瓶中， 28， 转速为 150 180r/min， 144 小时， 进行扩大培养， 以此作为一级种子 液培养。 0045 种子液培养基的组成为 ： 马铃薯 230g， 葡萄糖 15g、 KH2。
30、PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 维生素 P 3g、 CaCl2 0.5g、 FeSO4 0.25g， 加水至 1L， 种子液培养基的 pH 值为 6.5， 颜色为墨黑色。 0046 步骤 3 ： 二级种子液培养 0047 取步骤 2 所培养的菌种 8.3ml 接入装有 100ml 种子液培养基的容量为 300ml 的三 角瓶中进行二次扩大培养， 菌种与种子液培养基中的体积比为 1 ： 12， 28培养， 转速 150 180r/min， 培养120小时后接入三角瓶中进行扩大培养， 直至直径为0.5-2mm的菌丝球长满 三角瓶， 即培养液中长满大小、 分布比较均匀的菌丝球。 0048 步。
31、骤 4 ： 定向发酵 0049 将 0.58L 步骤 3 中扩大培养的菌种转接入装有 7L 定向发酵培养基的容积为 10L 的发酵罐中， 菌种与定向发酵培养基的体积比为 1 ： 12， 保持罐温 28， 罐压 0.5-0.7kPa， 搅 拌速率 350rpm， 通气量 1 ： 0.5-0.7v/v.m， 发酵 198 小时。 0050 上述的定向发酵培养基的组成为 ： 麦芽粉 11g、 葡萄糖 60g、 FeSO4 0.25g、 维生素 P 2.5g、 天门冬氨酸 3.3g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 1g、 复合维生素 0.025g、 吐温 80 4g， 加水定容至 1L， 该培养基。
32、的 pH 为 6.5。 0051 依照 GB/T 15672-2009， 对本步骤发酵后的发酵液中桑黄活性多糖的含量进行 检测， 检测结果中桑黄活性多糖的含量为 7.998g/L， 桑黄活性多糖的总抗氧化活性为 ： 2.960mmol/g 0052 步骤 5 ： 桑黄活性多糖提取 0053 对步骤 4） 所得到的发酵液打到减压浓缩器中， 浓缩至浓缩液的体积为原发酵液的 0.14 倍， 转移到贮罐中， 经板框压滤， 得清液， 清液浓缩， 加入适量乙醇， 使乙醇在浓缩清液 中的体积浓度达到 70， 低温醇析 15 小时， 取沉淀用去离子水溶解， 喷雾干燥即得到桑黄 活性多糖。 0054 取上述制取。
33、的粗桑黄活性多糖用总抗氧化活性试剂盒 （ABTS法） 测定其活性， 检测 粗桑黄活性多糖的产率为 54%， 其总抗氧化活性为 2.532mmol/g。 0055 上述的桑黄菌丝体名称为桑黄P0988 （Phellinus sp.P0988） ， 保藏单位 ： 中国典型 培养物保藏中心 ； 保藏单位地址 ： 中国 武汉 武汉大学 ； 保藏编号 ： CCTCC NO ： M 2012080， 其是作为获得桑黄高活性多糖的生产菌株， 保藏日期 ： 2012 年 3 月 14 日。该桑黄菌丝体是 在野外采集桑黄子实体， 利用孢子弹射法培养获得。 0056 上述的孢子弹射法具体是由以下步骤实现 ： 00。
34、57 A、 选择个体健壮、 朵形圆正， 无病虫害、 出菇均匀、 高产稳产， 适应性强的八九分成 熟的桑黄子实体， 切去大部分， 菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、 滤纸 说 明 书 CN 102766663 B 7 6/12 页 8 吸干表面水分。 0058 B、 在接种箱或无菌室内， 把桑黄子实体的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面， 漏斗倒盖在培养皿上面 ； 上端小孔用棉花塞住， 培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上， 静置 12 20 小时， 菌褶上的孢子就会散落在培养皿内， 形成一层粉末状孢子印， 用接种针沾取 少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种， 待孢子萌发， 生成。
35、菌落时， 选孢子萌发 早、 长势好的菌落进行试管培养， 试管培养温度为 28， 静置避光培养。 0059 实施例 2 0060 在上述实施例 1 的步骤 1 中， 改良 PDA 培养基的组成为 ： 马铃薯 185g、 葡萄糖 13g、 琼脂 20g、 维生素 P 1g， 加水定容为 1L。本步骤中其他的步骤与实施例 1 相同。 0061 其他的步骤与实施例 1 相同。 0062 实施例 3 0063 在上述实施例 1 的步骤 1 中， 改良 PDA 培养基的组成为 ： 马铃薯 195g、 葡萄糖 18g、 琼脂 20g、 维生素 P 2g， 加水定容为 1L。本步骤中其他的步骤与实施例 1 相。
36、同。 0064 其他的步骤与实施例 1 相同。 0065 实施例 4 0066 在上述实施例 1 的步骤 1 中， 改良 PDA 培养基的组成为 ： 马铃薯 180g、 葡萄糖 10g、 琼脂 20g、 维生素 P 0.5g， 加水定容为 1L。本步骤中其他的步骤与实施例 1 相同。 0067 其他的步骤与实施例 1 相同。 0068 实施例 5 0069 在上述实施例 1 3 的步骤 1 中， 改良 PDA 培养基的组成为 ： 马铃薯 200g、 葡萄糖 20g、 琼脂 20g、 维生素 P 6g， 加水定容为 1L。本步骤中其他的步骤与相应的实施例相同。 0070 其他的步骤与相应的实施例。
37、相同。 0071 实施例 6 0072 在上述实施例 1 5 的步骤 2 中， 所涉及的种子液培养基的组成为 ： 马铃薯 220g、 葡萄糖 10g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 维生素 P 2g、 CaCl2 0.1g、 FeSO4 0.1g， 加水定容至 1L。 0073 其他的步骤与相应的实施例相同。 0074 实施例 7 0075 在上述实施例 1 5 的步骤 2 中， 所涉及的种子液培养基的组成为 ： 马铃薯 240g、 葡萄糖 20g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 维生素 P 5g、 CaCl2 1g、 FeSO4 0.25g， 加水定容至 1L。
38、。 0076 其他的步骤与相应的实施例相同。 0077 实施例 8 0078 在上述实施例 1 5 的步骤 2 中， 所涉及的种子液培养基的组成为 ： 马铃薯 200g、 葡萄糖 5g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 维生素 P 1g、 CaCl2 0.1g、 FeSO4 0.05g， 加水定容至 1L。 0079 其他的步骤与相应的实施例相同。 0080 实施例 9 0081 在上述实施例 1 5 的步骤 2 中， 所涉及的种子液培养基的组成为 ： 马铃薯 260g、 葡萄糖 30g、 KH2PO4 1g、 MgSO4 0.5g、 维生素 P 6g、 CaCl2 2g、 Fe。
39、SO4 0.35g， 加水定容至 1L。 0082 其他的步骤与相应的实施例相同。 0083 实施例 10 说 明 书 CN 102766663 B 8 7/12 页 9 0084 在上述的实施例 1 9 的步骤 4 中， 所涉及的定向发酵培养基的组成为 ： 麦芽粉 8g、 葡萄糖 20g、 FeSO4 0.2g、 维生素 P 1g、 天门冬氨酸 0.5g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 1g、 复合维生 素 0.001g、 吐温 80 1g， 加水定容至 1L。 0085 其他的步骤与相应的实施例相同。 0086 实施例 11 0087 在上述的实施例 1 9 的步骤 4 中， 所涉及的。
40、定向发酵培养基的组成为 ： 麦芽粉 15g、 葡萄糖 100g、 FeSO4 0.5g、 维生素 P6g、 天门冬氨酸 8g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 1g、 复合维生 素 0.05g、 吐 80 10g， 加水定容至 1L。 0088 其他的步骤与相应的实施例相同。 0089 实施例 12 0090 在上述的实施例 1 9 的步骤 4 中， 所涉及的定向发酵培养基的组成为 ： 麦芽粉 5g、 葡萄糖 15g、 FeSO4 0.1g、 维生素 P 1g、 天门冬氨酸 0.5g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 1g、 复合维生 素 0.001g、 吐温 80 1g， 加水定容至 1。
41、L。 0091 其他的步骤与相应的实施例相同。 0092 实施例 13 0093 在上述的实施例 1 9 的步骤 4 中， 所涉及的定向发酵培养基的组成为 ： 麦芽粉 20g、 葡萄糖 100g、 FeSO4 0.6g、 维生素 P 6g、 天门冬氨酸 8g、 MgSO4 1g、 KH2PO4 2g、 复合维生 素 0.05g、 吐温 80 10g， 加水定容至 1L。 0094 实施例 14 0095 在上述的实施例 1 13 中， 培养基中所用的维生素 P 用等质量的维生素 C 或芦丁 替换， 其它的步骤与相应的实施例相同。 0096 实施例 15 0097 上述实施例 1 14 中的桑黄。
42、活性多糖的制备方法包括以下步骤 ： 0098 在步骤 1 中， 桑黄菌丝体接入改良 PDA 培养基中， 在 25有氧避光培养 ； 本步骤中 的其他步骤与对应实施例相同。 0099 在步骤2中， 取3块步骤1中1cm2大小的斜面菌种转接入装有50ml种子液培养基 的 250ml 容量的三角瓶中， 25， 转速 150 180r/min， 摇床培养 180 小时， 进行扩大培养， 本步骤中其他的步骤与对应实施例相同。 0100 在步骤 3 中， 将 10ml 步骤 2 所培养的菌种接入装有 100ml 种子液培养基的容量为 500ml 的三角瓶中进行二次扩大培养， 菌种与种子液培养基中的体积比为 。
43、1 ： 10， 25摇床 培养， 本步骤中其他的步骤与对应实施例相同。 0101 在步骤 4 中将 0.7L 步骤 3 中扩大培养的菌种转接入装有 7L 定向发酵培养基的容 积为10L的发酵罐中， 菌种与定向发酵培养基的体积比为1 ： 10， 保持罐温28， 罐压0.5 0.7kPa， 搅拌速率 300 400rpm， 通气量 1 ： 0.5 0.7v/v.m， 发酵 220 小时， 本步骤中其他 的步骤与对应实施例相同。 0102 其他的步骤与对应实施例相同， 制得桑黄活性多糖， 产率为 54%。 0103 实施例 16 0104 在上述实施例 1 14 中的桑黄活性多糖的制备方法包括以下步。
44、骤 ： 0105 在步骤 1 中， 桑黄菌丝体接入改良 PDA 培养基中， 在 30有氧避光培养 ； 本步骤中 说 明 书 CN 102766663 B 9 8/12 页 10 的其他操作与实施例 1 相同。 0106 在步骤 2 中， 取 3 块步骤 1 中 1cm2大小的斜面菌种转接入装有 50ml 种子液培养 基的 250ml 容量的三角瓶中， 30， 转速 150 180r/min， 120 小时， 进行扩大培养， 本步骤 中其他的步骤与实施例 1 相同。 0107 在步骤 3 中， 将 6.7ml 步骤 2 所培养的菌种接入装有 100ml 种子液培养基的容量 为 500ml 的三角。
45、瓶中进行二次扩大培养， 菌种与种子液培养基中的体积比为 1 ： 15， 30培 养， 本步骤中其他的步骤与实施例 1 相同。 0108 在步骤4中将0.47L步骤3中扩大培养的菌种转接入装有7L定向发酵培养基的容 积为10L的发酵罐中， 菌种与定向发酵培养基的体积比为1 ： 15， 保持罐温29， 罐压0.5 0.7kPa， 搅拌速率 300 400rpm， 通气量 1 ： 0.5 0.7v/v.m， 发酵 180 小时， 本步骤中其他 的步骤与实施例相同。 0109 其他的步骤与实施例 1 相同。 0110 为了确定本发明中定向发酵培养基的最优工艺条件以及最佳配比， 还进行了以下 试验， 具。
46、体如下 ： 0111 1、 因子筛选实验 0112 根据桑黄子实体的生长条件， 确定出对桑黄生长及活性多糖产生可能有影响的因 子， PB 实验对其主要因子进行筛选， 筛选结果如下 ： 0113 表 1 全面因子筛选结果 0114 0115 参见表 1 和附图 1 和 2， 可以得出对多糖总抗氧化活性影响最为明显的因子有 ： 维 生素 P、 天门冬氨酸和硫酸亚铁 ； 影响多糖含量的因子是麦芽粉。 0116 综合上面结果可以看出影响桑黄多糖含量和多糖总抗氧化活性的因子是 ： 麦芽 粉、 维生素 P、 硫酸亚铁、 天门冬氨酸。 0117 2、 最陡爬坡实验 0118 目的是为了确定下一步响应面设计中。
47、的中心点， 结果如下表 2 ： 0119 表 2 响应面设计和实验结果 0120 说 明 书 CN 102766663 B 10 9/12 页 11 0121 由上表可以看出 ： 第五组实验有利于胞外多糖的产生， 第四组实验有利于多糖总 抗氧化活性的提高。所以， 分别把第五组和第四组数据作为后面多糖含量和多糖总抗氧化 活性响应面设计的中心点， 通过前面 PB 实验可以知道 ： 麦芽粉对多糖含量的影响非常显 著， 维生素 P、 硫酸亚铁和天门冬氨酸对多糖的总抗氧化活性有显著影响作用。因此， 麦芽 粉、 硫酸亚铁、 维生素 P、 天门冬氨酸的中心点分别定为 ： 12g/L、 0.25g/L、 2.。
48、5g/L、 2.5g/L。 0122 三、 响应面设计 0123 通过中心组合实验进行响应面分析， 实验组如下 ： 0124 表 3 为响应面设计及实验结果 0125 A B C D EPS(g/L) EPS TEAC(mmol/g) 1 1 1 1 -1 3.593 0.9751 2 2 0 0 0 5.791 1.396 3 1 -1 1 1 6.302 0.8063 4 0 0 0 0 6.115 0.9962 5 -2 0 0 0 1.019 3.121 6 0 0 0 0 5.993 1.006 7 1 -1 -1 -1 6.954 0.5181 8 0 0 -2 0 6.382 0。
49、.7178 9 0 0 0 0 5.843 1.164 10 0 0 0 0 5.879 1.125 说 明 书 CN 102766663 B 11 10/12 页 12 11 -1 1 -1 1 4.611 1.406 12 0 -2 0 0 4.892 0.8077 13 -1 -1 1 1 4.122 1.436 14 1 -1 1 -1 6.115 0.935 15 -1 -1 1 -1 3.804 1.548 16 1 -1 -1 1 6.506 0.7383 17 0 0 0 -2 4.982 0.9473 18 0 0 0 0 5.811 1.043 19 1 1 1 1 5.746 0.6786 20 0 0 0 2 6.271 1.053 21 1 1 -1 1 7.287 0.5753 22 0 0 0 0 5.939 1.138 23 -1 1 1 1 4.444 1.455 24 0 0 2 0 4.892 1.083 25 0 0 0 0 6.031 1.。