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1、(10)授权公告号 CN 102766578 B (45)授权公告日 2014.04.09 CN 102766578 B (21)申请号 201210295602.5 (22)申请日 2012.08.20 201110319768.1 2011.10.20 CN C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 烟台华融生物科技有限公司 地址 264006 山东省烟台市开发区大季家工 业园 (72)发明人 陈勇 邹宁 (74)专利代理机构 烟台双联专利事务所 ( 普通 合伙 ) 37225 代理人 梁翠荣 CN 201801523 U,2011.04。
2、.20, CN 102337215 A,2011.10.20, CN 1439721 A,2003.09.03, 杨佳 . 高油脂微藻的筛选及其在再生水中的 产油特性研究 .中国优秀硕士学位论文全文数 据库 .2012,( 第 3 期 ),B027 440. (54) 发明名称 雨生红球藻的培养生产方法 (57) 摘要 本发明是一种雨生红球藻的培养生产方法， 在密封罐体中， 将雨生红球藻绿色游动细胞接种 到培养基中， 采用人工 LED 光源照光培养 ； 所用的 LED 光源发出的单色光的波长范围在 450nm 带宽 30nm 和 640nm 带宽 30nm， 并按照红光与蓝光光强 2:1 5:。
3、1 的比例同时使用两种上述不同波长的 光源， 总光照强度为80E/m2.s1500E/m2.s ； 培养过程温度保持在1528， 通过添加二氧化 碳控制培养环境的 pH8.01.0。明显节省了控温 的能耗， 培养周期较传统方法缩短了 50% 以上 ； 所 得到的绿色藻液中雨生红球藻细胞浓度是传统方 法的 2-5 倍。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘新蕾 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 102766578 B CN 102766578 B。
4、 1/1 页 2 1. 雨生红球藻的培养生产方法， 其特征在于 ： 培养容器为密封罐体 ； 在接种与培养阶 段， 将雨生红球藻绿色游动细胞接种到培养基中， 接种密度 6 万 /ml， 采用人工 LED 光源培 养 ； 所用的LED光源发出的单色光的波长分别是蓝光475nm， 红光663nm， 并按照红光与蓝光 光强 3:1 的比例同时使用两种上述不同波长的光源， 总光照强度为 1500E/m2.s ； 培养过 程温度保持在 25 ； 通过添加二氧化碳控制培养环境的 pH8.01.0 ； 其中， LED 光源光照时间 12 24 h / 天 ； 其中， 罐体材料为玻璃钢增强塑料或者不锈钢， 或者。
5、搪瓷 ； 培养液混合方式是泵流搅 拌。 权 利 要 求 书 CN 102766578 B 2 1/4 页 3 雨生红球藻的培养生产方法 0001 技术领域 0002 本发明涉及工业规模培养雨生红球藻的方法。所述的雨生红球藻属于淡水藻类。 背景技术 0003 雨生红球藻又叫做湖生红球藻或湖生血球藻， 属于团藻目， 红球藻科。 0004 在 1899 年发现这种藻经常以一种血红色外壳的形式附着在水坛或靠海的周期性 有水的浅水湾边上， 这种藻的生命历程是经过一个红色的休眠阶段， 之后是一个绿色的游 动阶段， 再之后又是一个红色的休眠阶段。 0005 1934 年， Elliot 从细胞形态学的角度补。
6、充了这种藻类的生长史的细节。在整个生 命周期中出现四种典型的细胞形态 ： 小虫体、 长有鞭毛的大虫体、 没有运动能力的胶鞘体、 带有坚硬细胞壁的红色大细胞红孢囊 （Haematocysts） 。在有充足营养的清洁环境中， 大虫体占主导地位 ； 一旦环境恶化就会转化为叫胶鞘体， 之后转化为具有抵抗力的红孢囊， 并开始积累虾青素。 随后， 当周围的环境又变得营养充足适宜的时候， 红孢囊变成可运动的 小虫体， 这些小虫体长成胶鞘体或者大虫体。 0006 雨生红球藻中虾青素含量为 15% 30%， 被看作是天然虾青素的 “浓缩品” 。雨 生红球藻对虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高， 而且雨生红球。
7、藻所含虾青素及其 酯类的配比(约70%的单酯， 25%的双酯及5%的单体)与水产养殖动物自身配比极为相似， 这是通过化学合成和利用红发夫酵母等提取的虾青素所不具备的。此外， 雨生红球藻中虾 青素的结构以 3S-3 S 型为主， 与鲑鱼等水产生物体内虾青素结构基本一致 ； 而红发夫酵母 中虾青素结构则为 3R 一 3 R 型。当前， 雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最 好生物， 因此， 利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景， 已成为近年来国际上天 然虾青素生产的研究热点。在与红球藻相关的文献中没有任何有毒性的报道。 0007 雨生红球藻于 在 2010 年 11 月 11 日 。
8、“中华人民共和国卫生部第 17 号公告 ” 中 获得 “准生证” 。 从此在抗氧化剂行业， 天然虾青素的生产及其研发将进入快车道， 天然虾青 素将对氧化应激类疾病， 如糖尿病、 痛风、 高血压等的防治产生革命性的改变。 0008 与螺旋藻、 小球藻等人类常用保健的微藻相比， 雨生红球藻有着更加令人惊异的 抗氧化作用， 同时也有着更加高难度的养殖与保存技术。 0009 雨生红球藻这种淡水藻类不同于海藻， 后者主要含有叶绿素 a 和叶绿素 b， 雨生红 球藻细胞中含有的光合作用色素主要是叶绿素 a 和虾青素。雨生红球藻这种淡水藻类不同 于海藻和其它淡水藻类的特征之一是 ： 其生活史由绿色和红色两个。
9、阶段组成。 0010 雨生红球藻这种淡水藻类不同于海藻和其它淡水藻类的另一个特征是 ： 在绿色阶 段细胞内虾青素含量低， 繁殖速度快， 需光弱， 不耐 28以上的高温 ； 而在红色阶段虾青素 含量高， 繁殖慢， 生长快， 喜高光照， 耐 28至 36的相对高温。 0011 因此， 雨生红球藻的培养比较困难， 对温度和光照等培养条件要求十分苛刻。 目前 的科研和生产中大多采用的自然光照方法， 很难做到精确控温。 特别是在夏季和冬季， 大量 的能源被浪费于夏季的降温和冬季的加热升温。 说 明 书 CN 102766578 B 3 2/4 页 4 0012 发明内容 0013 本发明所要解决的技术问。
10、题是， 提供一种雨生红球藻的培养生产方法， 在有效节 约能源的前提下， 通过严格控制温度和光照等培养条件， 使得雨生红球藻繁殖较快， 以进一 步提高生产效率， 并得到更高的细胞浓度。 0014 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下 ： 0015 雨生红球藻的培养生产方法， 其特征在于 ： 培养容器为密封罐体 ； 在接种与培养 阶段， 0016 将雨生红球藻绿色游动细胞接种到培养基中， 采用人工 LED 光源培养 ； 所用的 LED 光源发出的单色光的波长范围在 450nm 带宽 30nm 和 640nm 带宽 30nm， 并按照红光 与蓝光光强 2:1 5:1 的比例同时使用两种上述不同。
11、波长的光源， 总光照强度为 80E/ m2.s 1500E/m2.s ； 培养过程温度保持在 15 28， 通过添加二氧化碳控制培养环境的 pH8.01.0。 0017 其中 LED 单色光的波长分别优选为蓝光 475nm， 红光 663nm。 0018 总光照强度优选为 1500E/m2.s。 0019 培养温度优选为 25。 0020 LED 光源光照时间为 12 24 h / 天。 0021 罐体材料为玻璃钢增强塑料或者不锈钢， 或者搪瓷。 0022 培养液混合方式是泵流搅拌。 0023 红光与蓝光光强优选比例为 3:1。 0024 本发明的积极效果如下。 0025 第一、 雨生红球藻的。
12、繁殖时期适宜生长在弱光下。因此本发明采用 LED 作光源， 一 方面可以连续 24 小时使细胞进行光合作用， 积累营养物质， 加速生长繁殖 ； 另一方面避免 了采用自然太阳光源带来的温控困难， 节省了夏冬两季控温所消耗的大量能源， 降低了生 产成本和对环境的污染。同时根据光合作用色素对不同光质的需求特点， 采用最有效的单 色二极管光源， 提高了能量利用率、 生产效率、 细胞浓度以及虾青素产率。 第二、 与传统的培 养方法相比较， 本培养方法明显节省了控温的能耗， 培养周期较传统方法缩短了 50% 以上 ； 经生化分析， 所得到的绿色藻液中雨生红球藻细胞浓度达到 120 万 /ml， 是传统方法。
13、的 2-5 倍。第三、 本发明的培养容器为密封罐体， 与现有技术的开放池或者管道反应器相比较， 具 有占地少， 不容易被其它生物污染的优点。罐体材料具有耐腐蚀、 价格低的优势。第四、 本 发明培养液混合方式采用泵流搅拌， 形成自循环系统。 与现有技术的气升方式相比较， 具有 能耗少， 培养液不易被空气中生物污染的优点。 具体实施方式 0026 下面结合实施例进一步说明本发明。 0027 本发明的方法如下 ： 0028 一、 培养环境 0029 培养容器为容积 10 立方米的密封罐体， 罐体材料为玻璃钢增强塑料 （FRP 或者 GRP） 或者不锈钢， 或者搪瓷。选择培养基采用 GB11 培养基。。
14、培养生产过程采用排管或者夹 套方式实现保温。 说 明 书 CN 102766578 B 4 3/4 页 5 0030 反应器灭菌 ： 化学或蒸汽法对反应器进行灭菌处理。 0031 培养基灭菌 ： 对培养基进行次氯酸化学灭菌或高温灭菌。化学灭菌后将培养基进 行中和至 pH6.0-8.5， 灭菌后培养基温度调节至 28以下。 0032 二、 接种与培养 0033 将雨生红球藻绿色游动细胞接种到培养基中。接种密度 6 万 /ml。采用人工 LED 光源进行培养。 0034 所述人工 LED 光源由高亮度发光二极管提供， 该 LED 光源发出的单色光的波长范 围在 450nm 带宽 30nm 和 64。
15、0nm 带宽 30nm， 优选的单色光的波长是 475nm 和 663nm。同时使 用两种上述不同波长的光源， 其中红光与蓝光的光强比例为2:15:1， 优选3:1， 总光照强 度为 80E/m2.s 1500E/m2.s。优选的总光照强度是 ： 1500E/m2.s。 0035 通过泵流使细胞在培养液中保持悬浮， 温度保持在 15 28， 优选的温度是 25。通过自动化添加二氧化碳控制 pH8.01.0， 优选 8.0。 0036 培养液混合方式是 ： 泵流搅拌。 0037 以下是本发明的实验效果实例。 0038 表 1 是本发明在培养温度 25下， 红、 蓝光不同比例的实验效果。由表 1 。
16、可知， 相 同条件下， 红光与蓝光的光强比例为 2:1 5:1 时具有较短的培养周期并获得较高的细胞 浓度， 尤其是红光与蓝光的光强比例为 3: 1 时效果最佳。 0039 表 1 0040 0041 备注 ： 接种密度 6 万 /ml。pH 通过自动化添加二氧化碳控制在 8.00.5。 0042 表 2 是不同总光照强度对雨生红球藻生长的影响。由表 2 看出， 随着总光照 强度的提高， 0043 达到的细胞密度升高。 0044 表 2 0045 说 明 书 CN 102766578 B 5 4/4 页 6 0046 备注 ： 接种密度 6 万 /ml。pH 通过自动化添加二氧化碳控制在 8.00.5。受实验 条件限制， 总光照强度超过 1500E/m2.s 的实验尚未进行。 说 明 书 CN 102766578 B 6 。