临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存.pdf

本发明涉及一种临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存，其制备方法如下：冲洗脐带，将脐带剪切至颗粒状，置于含2％庆大霉素的生理盐水中，离心，悬浮，离心，培养10天，按1∶3传代，传至4～5代，可获得大量间充质干细胞，加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃。

1.  一种脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌条件下取正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹；
(2)将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至约颗粒状，组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟；
(3)将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟；
(4)将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基；
(5)于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养1周；
(6)待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代；
(7)经14～15天扩增后，细胞传至4～5代，得到间充质干细胞。

2.  权利要求1的制备方法，其特征在于，所述步骤进一步包括，将步骤7获得的间充质干细胞进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃，记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期，即得合格的间充质干细胞。

3、  权利要求1的制备方法，其特征在于，操作均在严格无菌条件下进行，使用的细胞培养基中加入0.2％的庆大霉素。

4、  权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)无菌条件下取正常顺产的胎儿脐带，脐带长约20cm，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹，同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤，
2)将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，
3)将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，去除大量组织块黏液，
4)将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，
5)于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养，
6)1周后待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代，
7)经15天扩增后，细胞传至5代，获得1×10⁸MSCs，
8)将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃，记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。

5、  权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)无菌条件下取剖腹产的胎儿脐带，脐带长约25cm，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹，同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤，
2)将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，
3)将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，去除大量组织块黏液，
4)将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，
5)于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养，
6)1周后待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代，
7)经传至15代，获得4×10⁹MSCs，
8)将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃，记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。

临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存
技术领域
本发明涉及一种医疗用品的制备，具体是应用于临床治疗用的人脐带间充质干细胞的制备和储存。
技术背景
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞的一种类型，因能分化为间质组织而得名，是属于中胚层的一类多能干细胞，具有很强的自我更新和向多种组织分化发育的潜能。MSCs主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓中含量最为丰富，可以向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化，如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、平滑肌细胞、骨髓基质细胞、成纤维细胞及多种血管内皮细胞，甚至神经系统的神经元和神经胶质细胞，同时还具有免疫调节和促进造血重建等功能，使之成为治疗多系统疾病的“实用型干细胞”。MSCs的多分化潜能和组织修复功能，使其在临床上具备广泛的应用潜能。目前，国内外已将MSCs应用于临床治疗移植物抗宿主病(GVHD)、心血管修复、脊髓损伤、骨和软骨修复、烧伤、类风湿性关节炎、帕金森病等。人们正在继续开发应用MSCs治疗其他疾病的尝试，相信，未来将有更多的疾病可以用MSCs进行治疗。
目前MSCs还是主要来源于成人的骨髓。虽然骨髓的MSCs最为丰富，但成人骨髓来源的MSCs数量及增殖分化潜能随年龄的增长而下降，且供者MSCs的采集须行骨髓穿刺术，手术存在一定的风险，异体间移植还增加了交叉感染的机会，自体骨髓MSCs移植，由于疾病的原因，病人常有感染及体质较弱等因素，也限制了其应用。而脐带来源的MSCs增殖、分化能力强，适合体外大规模培养，且脐带来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，无道德伦理的限制，同时脐带来源的MSCs免疫原性低，异体间移植不会引起排斥反应，因此，脐带MSCs有望成为骨髓MSCs的理想替代来源。
常用的脐带间充质干细胞体外分离方法主要是酶解法，依据选取消化酶的种类又可分为胶原酶消化、胰酶消化和两种酶顺序消化法。由于酶解法需要应用动物蛋白源性的消化酶，存在过敏和交叉感染的可能，增加了临床应用的安全风险。此外，应用酶解法成本较高，原代培养细胞纯度低。为了克服以上缺点，本发明采用了植块培养的方法，无需应用消化酶，有利于质量控制，且对细胞损伤小，细胞增殖能力强，原代培养细胞纯度高，为临床MSCs的应用提供了安全、可靠、充足的MSCs的来源，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，克服了之前应用胶原酶和胰蛋白酶等异源蛋白消化法可能带来的风险，降低制备成本，增加间充质干细胞的得率和安全性。
本发明的人脐带间充质干细胞的制备方法如下：
1.无菌条件下取正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹。同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤。
2.将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟。
3.将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，该步骤用以去除大量组织块黏液。
4.将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基。
5.于培养第10天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养。此后1周细胞增长迅速，成为形态较为均一的长梭型细胞，呈涡旋状生长，贴壁细胞的融合率可达到80％。
6.待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代。
7.经14～15天扩增后，细胞传至4～5代，可获得大量间充质干细胞。细胞形态如图1所示。
8.将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行表型检测，表型结果如图2所示，符合CD31、HLA-DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性的细胞，属于合格细胞，将其加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃。记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期，即得。此脐带间充质干细胞可用于临床治疗。
上述操作均在严格无菌条件下进行，为保证细胞不受污染，使用的细胞培养基中加入0.2％的庆大霉素。由于在组织块处理过程中，不采用胶原酶和胰蛋白酶等动物源性蛋白的处理，减少了发生污染的机会，以及避免了应用外源(动物)蛋白可能产生的副作用，且大地降低了制备成本。
本发明的人脐带间充质干细胞制备方法效果优良，可从人脐带中获得大量的MSCs，而且简单易行，成本低，安全性好，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1脐带来源的MSC的形态：脐带来源的MSC细胞传第五代第2天的形态(HE染色)，A是10倍物镜下的形态，B是40倍物镜下的形态。
图2脐带来源的MSC表型：其表型特征为CD31、HLA-DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性。
具体实施方式：
以下通过实例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
1.无菌条件下取正常顺产的胎儿脐带，脐带长约20cm，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹。同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤。
2.将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟。
3.将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，去除大量组织块黏液。
4.将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基。
5.于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养。
6.1周后待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代。
7.经15天扩增后，细胞传至5代，获得1×10⁸MSCs。细胞的形态如图1所示。
8.将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃。记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期
上述操作均在严格无菌条件下进行，为保证细胞不受污染，使用的细胞培养基中加入0.2％的庆大霉素。
实施例2
1.无菌条件下取剖腹产的胎儿脐带，脐带长约25cm，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹。同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤。
2.将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟。
3.将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，去除大量组织块黏液。
4.将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基。
5.于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养。
6.1周后待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代。
7.经传至15代，获得4×10⁹MSCs。
8.将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃。记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。
上述操作均在严格无菌条件下进行，为保证细胞不受污染，使用的细胞培养基中加入0.2％的庆大霉素。