一种检测犬细小病毒的LAMP试剂盒 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种检测犬细小病毒的环介导等温核酸扩增技术(LAMP)试剂盒。
背景技术
犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)是美国Eugster于1978年从患出血性肠炎的犬粪便中发现的病毒，该病毒为细小病毒科细小病毒属，单股线状DNA病毒。犬细小病毒以导致犬发病率高，传染性强、死亡率高等特点已成为犬科动物临床发病的重要致病病毒。犬细小病毒病已成为我国养犬业最为严重的传染病之一，该病既影响着家养宠物的生命健康，又危害着我国养犬业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业的发展。
目前，犬细小病毒的传统检测方法有血清学检测方法和病原学检测方法。血清学检测方法主要为血凝试验、酶联免疫吸附试验和免疫胶体金检测方法，但都因灵敏度不高、特异性不强等原因一直没有在临床上普及应用。病原学检测方法目前常用F81、MDCK等传代细胞系分离培养病毒，病毒分离方法虽然在理论上可以检出一个感染性的病毒粒子，确诊犬细小病毒的感染，但也因分离病毒的操作繁琐、代价高及确诊缓慢等因素同样没有投入临床应用。
随着分子生物学的发展，目前已有多种PCR方法用于犬细小病毒的检测，虽在灵敏度方面有所改进，但由于需要精密仪器的配套使用，同样也无法满足基层和现地检测的需求。上述的方法探索虽有一定的研究意义，但终究不能真正应用于临床上细小病毒的早期快速诊断。
环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用Bst-DNA polymerase的帮助从而可在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。
近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；MasakiImai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。
LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见该方法在犬细小病毒检测中的应用。
【发明内容】
本发明的目的是提供用于检测犬细小病毒的特异性LAMP引物组。
本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、可见化的、操作方法简单的LAMP检测试剂盒。
本发明所述的LAMP引物组包括以下四条引物：
F3： 5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’
B3： 5’-TGGCACAGAATTTTCGATAG-3’
5’-GGTATGGTTGGTTTCCATGGATA
FIP：
AATATGCCATTTACTCCAGCAG-3’
5’-CCATCTCATACTGGAACTAGTG
BIP：
GCGCATCATCTGGATCTGTACC-3’
本发明的LAMP引物组还包括以下两条引物：
LF： 5’-CCCAATGTCTCAGATCTCAT-3’
LB： 5’-CACCAGCAGATATATACCAT-3’
本发明所述的用于检测犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，包含有以下四条LAMP引物：
F3： 5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’ 18bp
B3： 5’-TGGCACAGAATTTTCGATAG-3’ 20bp
5’-GGTATGGTTGGTTTCCATGGATA
FIP： 45bp
AATATGCCATTTACTCCAGCAG-3’
5’-CCATCTCATACTGGAACTAGTG
BIP： 44bp
GCGCATCATCTGGATCTGTACC-3’
本发明所述的用于检测犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，还包含有以下两条LAMP引物：
LF： 5’-CCCAATGTCTCAGATCTCAT-3’ 20bp
LB： 5’-CACCAGCAGATATATACCAT-3’ 20bp
本发明所述的用于检测犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，还包括LAMP反应液，共同构成LAMP检测体系；25μL LAMP反应液的具体配置为：
F3、B3 各0.08μM～0.12μM；
FIP、BIP 各0.64μM～0.96μM；
LF、LB 各0.32μM～0.48μM；
dNTP 0.6mM～1.2mM；
Mg2+ 4mM～10mM；
反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer 1×；
链置换DNA聚合酶Bst DNA polymerase 8U；
甜菜碱betaine 0.2mM～1.0mM。
实验证明，本发明用于检测犬细小病毒的LAMP检测试剂盒，其25μL LAMP反应液的具体配置优选为：
F3、B3 各0.1μM；
FIP、BIP 各0.8μM；
LF、LB 各0.4μM；
dNTP 1.0mM；
Mg2+ 8mM；
反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer 1×；
链置换DNA聚合酶Bst DNA polymerase 8U；
甜菜碱betaine 0.3mM。
本发明所述LAMP试剂盒的检测反应条件为：65℃恒温1h，80℃2min，然后终止反应。
本发明的犬细小病毒的LAMP检测试剂盒利用疫苗株犬细小病毒构建的标准质粒DNA为模板，对LAMP反应条件进行了优化，最低检测限达到2～3个拷贝，整个试验只需要1h左右即可，相对于常规PCR反应要4～5h才能完成检测，大大缩短了检测时间；在特异性和重复性检验中，该方法有很高的可靠性，并且操作简单。
由于LAMP的扩增效率非常高，可产生大量的焦磷酸镁而使反应液呈现混浊，在LAMP扩增结束后无须电泳就可直接肉眼观察反应是否有混浊现象来判断是否有扩增。当反应液稍微混浊，肉眼难以观察时，可直接加入染料后在紫外光下进行观察。若有扩增，染料嵌入双链中导致反应液颜色发出绿色荧光，可更加直观的判断出是否为阳性；若无扩增则保持原有的染料着色不变，这样就可以更好于基层检测和现场检测。
利用发明的犬细小病毒LAMP快速检测试剂盒对临床上的犬细小病毒强毒株进行了检测，检测阳性率达到100％，在设计引物时候特别选取了细小病毒VP2基因上对于CPV-2a、CPV2b和CPV2c的保守区，所以该试剂盒可快速、灵敏地检测出目前流行的犬细小病毒毒株，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的现场检测，易于大范围推广应用。
【附图说明】
图1为LAMP体系优化过程，A为不同MgSO4浓度与电泳亮度关系图；B为不同dNTP浓度与电泳亮度关系图；C为不同Betaine浓度比例与电泳亮度的关系图；D为内外引物浓度比例与电泳亮度关系图；
其中，图A中1～6泳道MgSO4浓度分别为2mM，4mM，6mM，8mM，10mM，12mM；泳道7为阴性对照，M为DL2000plus marker；图B中1～6泳道dNTP浓度分别为0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM，1.2mM；7为阴性对照，M为DL2000plus marker；图C中1～4泳道Betaine浓度分别为0mM，0.3mM，0.5mM，1.0mM；5为阴性对照，M为DL2000plus marker；图D中泳道1～6，内外引物浓度之比分别为2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1；7为阴性对照；M为DL2000-plus marker；
图2为Alu I酶切结果；其中1为LAMP产物，2为酶切结果，3为阴性对照，M为DL2000plus Marker；
图3为特异性检验结果；其中1为犬细小病毒，2为小鹅瘟病毒，3为猪细小病毒，4为犬轮状病毒cDNA，5为犬瘟热病毒cDNA，6为阴性对照，M为DL2000plus；
图4为LAMP(图4-A)和PCR(图4-B)检测结果的灵敏度比较；其中1～7泳道质粒拷贝数分别为2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101，2.0；8为阴性对照；M为DL2000plus；
图5为临床样品地LAMP扩增产物加入EvaGreen染料后紫外照射结果；其中1～6为临床检测样品，7为阴性对照；
图6为LAMP加入环引物(图6-A)和未加入环引物(图6-B)影响反应灵敏度比较；其中1～7泳道质粒拷贝数分别为2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101，2.0；8为阴性对照；M为DL2000plus。
【具体实施方式】
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如无特别指明，实验所用的引物由上海英骏生物技术有限公司合成；Bst DNA聚合酶(大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、Mg2+购自Sigma公司。
实施例1
一、特异性DNA序列查找
从美国基因数据库——GenBank检索获得多株犬细小病毒基因组序列，登录号分别为EU697385、FJ869139-FJ86913922、FJ222822、FJ005265-FJ005200、EU659120、EU483515、EF666063、DQ354068、AY742955、DQ182617、DQ340405、AB120728、AB437433、EU483516，通过BLAST软件进行序列同源性分析即找到特异性的保守靶序列进行LAMP引物设计，该特异性保守靶序列为：
TGC ATC ATT GAT GGT TGC ATT AGA TAG TAA TAA TACTAT GCC ATT TAC TCC AGC AGC TAT GAG ATC TGA GAC ATTGGG TTT TTA TCC ATG GAA ACC AAC CAT ACC AAC TCCATG GAG ATA TTA TTT TCA ATG GGA TAG AAC ATT AAT ACCATC TCA TAC TGG AAC TAG TGG CAC ACC AAC AAA TATATA CCA TGG TAC AGA TCC AGA TGA TGC TCA ATT TTA TACTAT CGA AAA TTC TGT GCC A
二、引物的设计
使用Primer 4.0(http://primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Japan)，针对靶序列设计六条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)
三、LAMP
1、犬细小病毒的扩增、病毒基因组提取：犬细小病毒弱毒疫苗同步接种F81细胞，48h后细胞产生明显病变，病变细胞反复冻融三次后取1mL参照TRANS GEN公司的基因组提取试剂盒提取细小病毒基因组，并构建阳性质粒，为检测体系提供模板，-80℃冰箱中储存备用。
2、LAMP检测体系的建立
通过设置不同终浓度的Mg SO4：2mM，4mM，6mM，8mM，10mM，12mM；不同终浓度的dNTP：0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM，1.2mM；不同终浓度的Betaine：0mM，0.3mM，0.5mM，1mM；以及内外引物浓度比例：2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1(此时内外引物的浓度：0.2μM∶0.1μM，0.4μM∶0.1μM，0.6μM∶0.1μM，0.8μM∶0.1μM，1.0μM∶0.1μM，1.2μM∶0.1μM)，其它条件选择实验过程的优选试验条件。
分别在不同的温度(61℃至65℃)反应1h，80℃2min终止反应，最终通过产物琼脂糖凝胶电泳获得最佳反应参数。由于在65℃反应1h，80℃2min的条件下扩增最快，优选在此条件下进行反应。
在65℃反应1h，80℃2min对不同浓度的MgSO4、dNTP、Betaine和内外引物浓度比例的反应体系进行优化反应，通过凝胶电泳选择较亮的条带作为反应的最终浓度，结果参见图1。
显然，当MgSO4的浓度为4～10mM时，条带清晰；当dNTP的浓度为0.6～1.2mM，条带清晰；当甜菜碱Betaine的浓度为0.3、0.5、1.0mM时，条带清晰；当内外引物浓度为6∶1，8∶1，10∶1，12∶1时，特别是8∶1，10∶1，12∶1，条带清晰。
因此，得到优化的检测体系(25μL)如下：
1×ThermoPol Reaction Buffer，8mM Mg2+，0.3mM Betaine，1.0mM dNTP，0.1μM外引物(F3和B3)，0.8μM内引物(FIP和BIP)，0.4μM环引物(LF和LB)，8U Bst DNA polymerase，1μL模板。
检测反应条件：65℃恒温1h，80℃2min终止反应。
3、LAMP扩增特异性确认
用Alu I内切酶判定产物结构，确定其为特异性扩增产物。经内切酶消化，出现188bp和56bp两条电泳条带(泳道2)，与理论与其值相符合，说明是特异性扩增，参见图2。
4、检测体系特异性、灵敏性分析
以小鹅瘟病毒、猪细小病毒、犬轮状病毒、犬瘟热病毒等四种病毒核酸为模板检测体系的特异性。LAMP检测体系的特异性测试良好，可特异性的检测到犬细小病毒。参见图3。
以10-1、10-2......10-7稀释度的犬细小病毒阳性质粒为模板分别进行LAMP和PCR，比较两种方法的灵敏度LAMP方法的最低检测限能达到2～3拷贝，而PCR方法只能达到2.0×102拷贝。LAMP灵敏度比RT-PCR法高100倍。参见图4。
5、检测体系的结果鉴定
一方面，由于LAMP在DNA扩增过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，可通过观察终反应液是否浑浊确认是否进行了扩增反应，是否为阳性。
也可以在LAMP检测体系中加入荧光染料EvaGreen(或SYBRGreen I)，紫外灯下肉眼观察若反应液变为绿色，则说明反应呈阳性，若无色则说明反应为阴性，参见图5。
6、根据优化结果，确定了最佳的LAMP检测体系，在实际操作中可以存在一定的浮动范围，具体保持在1×ThermoPol ReactionBuffer，4mM～10mM Mg2+，0.2mM～1.0mM Betaine，0.6mM～1.2mMdNTP，0.08μM～0.12μM外引物(F3和B3)，0.64μM～0.96μM内引物(FIP和BIP)，0.32μM～0.48μM环引物(LF和LB)，8U Bst DNApolymerase，1μL模板。
实施例2
增加环引物(LF、LB)可以增加LAMP反应的灵敏度。
对此进行了对比试验，两组试验，一组加入环引物，一组未加入环引物，结果参见图6。
图6为LAMP加入环引物(图6-A)和未加入环引物(图6-B)影响反应灵敏度比较；其中1～7泳道质粒拷贝数分别为2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101，2.0；8为阴性对照；M为DL2000 plus，显然加入环引物的扩增反应明显要强于未加入环引物的一组。
【序列表】
<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120>一种检测犬细小病毒的LAMP试剂盒
<130>KHP09112534.5
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>244
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgcatcattg atggttgcat tagatagtaa taatactatg ccatttactc cagcagctat 60
gagatctgag acattgggtt tttatccatg gaaaccaacc ataccaactc catggagata 120
ttattttcaa tgggatagaa cattaatacc atctcatact ggaactagtg gcacaccaac 180
aaatatatac catggtacag atccagatga tgctcaattt tatactatcg aaaattctgt 240
gcca 244
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgcatcattg atggttgc 18
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tggcacagaa ttttcgatag 20
<210>4
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ggtatggttg gtttccatgg ataaatatgc catttactcc agcag 45
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccatctcata ctggaactag tggcgcatca tctggatctg tacc 44
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cccaatgtct cagatctcat 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
caccagcaga tatataccat 20