一种用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的靶序列及试剂盒.pdf

一种用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的靶序列及试剂盒
    【技术领域】

    本发明属生物技术领域，特别是涉及一种利用聚合酶链式反应扩增致病性ail基因，从而高灵度地特异检测临床样品中小肠结肠炎耶尔氏森菌的方法及利用该方法获得的实时荧光PCR检测试剂盒。

    背景技术

    小肠结肠炎耶尔氏森氏菌病(耶氏菌病)是80年代才受到重视的一种新的肠道传染病，世界各大洲均有发现，是欧洲某些国家腹泻的主要病种，不少地区耶氏菌引起的胃肠炎和严重腹泻，比痢疾还多。除肠道症状外，还能引起呼吸道、心血管系统、骨骼、结缔组织和全身疾病，出现败血症时病死率达30％以上。1981年我国才发现此病，引起全国重视，并开展了全国性调查和研究，分别从人群、动物和外环境分离出病原菌，证明耶氏菌病在我国的分布是非常广泛的。

    我国已发现58个血清型，其中11个型是国际上首次报道，它们是O：7、19，O：7、8、19，O：10、16，O：17、19，O：18、19，O：26、35，O：25、45，O：29，O：36、46，O：42、51。我国经证实对人有毒力的血清型有O：3、O：9、O：5、27，O：6、30，O：7、8，O：15，O：40，与国外报道相同，唯有O：8型在国外是毒力很强的，而我国目前分离到的菌株均缺乏毒力因子。另从生物型来分共有6型，其中1A型为非致病株，1B、2、3、4、5型为致病株。我国分离到O：3和O：9血清型菌株均为生物3型，从国内外各型致病株来看，小肠结肠炎耶尔氏森氏菌的致病性均位于inV，ail，yst和virF等基因位点上，ail位点与细菌的侵袭力有关，而yst及位于pYv质粒上的virF基因位点与细菌的毒力有关。

    要消灭小肠结肠炎耶尔氏森氏菌需要多方努力，如发展快速诊断方法、研制新药、进行分子机制研究和疫苗研究等，其中发展快速诊断方法最为紧迫。由于小肠结肠炎耶尔森氏菌生长缓慢，通过培养法来鉴定小肠结肠炎耶尔氏森氏菌需要时间比较长，因此，培养法对临床帮助不大。为了更快地检查出标本中的小肠结肠炎耶尔氏森氏菌，需要开发利用聚合酶链式反应(PCR)对小肠结肠炎耶尔氏森氏菌的核酸进行扩增检测。

    近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，特异性好，速度快等优点在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法。国内目前也已有关于乙肝、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

    对于聚合酶链式反应(PCR)来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列最为重要。针对小肠结肠炎耶尔氏森氏菌，这个碱基序列必须为小肠结肠炎耶尔氏森氏菌特异拥有并且不能存在于为人类或其它生物DNA基因组及可能发生合并感染的其它物种中。

    从国内外各型致病株来看，小肠结肠炎耶尔森氏菌的致病性均位于inV，ail，yst和virF等基因位点上，ail位点与细菌的侵袭力有关，而yst及位于pYv质粒上的virF基因位点与细菌的毒力有关，由于质粒在培养过程中易丢失，通过聚合酶链反应扩增virF易出现假阴性，而inV及vst位点的特异性不强，因此，本领域迫切需要开发新高特异性地检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法和试剂盒，以便能够有效检测小肠结肠炎耶尔森氏菌。

    【发明内容】

    所要解决的技术问题

    本发明的目的就是提供一种有效检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法和试剂盒。

    在本发明的第一方面，提供一种检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的遗传标记物，它具有SEQ ID NO：1中连续的75～537个核苷酸。

    在另一优选例中，所述的遗传标记物具有SEQ ID NO：2中第1～150个核苷酸。

    在本发明的第二方面，提供一种检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的试剂盒，它含有特异性扩增小肠结肠炎耶尔氏森菌遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15～30个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补，且扩增产物长度为75～537个核苷酸。

    在另一优选例中，所述的试剂盒还含有探针，所述探针的长度为18～30个核苷酸，且该探针的序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同或互补。

    在另一优选例中，所述引物对中的一个引物选自下组：SEQ ID NO：3或6；另一个引物选自下组：SEQ ID NO：4或7；并且所述的探针是TaqMan探针，其序列选自SEQ ID NO：5或8。

    在另一优选例中，该试剂盒还包括a)核酸提取液，b)PCR缓冲液，c)定量校准品，d)阳性对照，e)阴性对照。

    在本发明的第三方面，提供了一种检测样品中小肠结肠炎耶尔氏森菌的方法，它包括操作步骤：

    ①样品DNA提取；

    ②将提取的DNA作为模板，用特异性扩增小肠结肠炎耶尔氏森菌遗传标记物的引物对进行扩增，其中所述的的引物长度为15～30个核苷酸，一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补。

    ③检测扩增产物是否存在，存在扩增产物表示样品存在小肠结肠炎耶尔氏森菌。

    在另一优选例中，所述的步骤③是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的小肠结肠炎耶尔氏森菌。

    在本发明的第四方面，提供了一种致病性ail基因的用途，其特征在于，它被用作体外检测小肠结肠炎耶尔氏森菌是否存在的遗传标记物。

    在另一优选例中，致病性ail基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

    【具体实施方式】

    本发明人经过深入而广泛的研究，从小肠结肠炎耶尔氏森菌中发现的一段约500个碱基对的基因-致病性ail基因(S.Thisted Lambertz，C.Nilsson，S.Hallanvuo，and M.Lindblad.Real-Time PCR Method for Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitiea inFood.Applied and Environmental Microbiology，October 2008，p.6060-6067，Vol.74，No.19)中发现合适的扩增序列。该基因序列为小肠结肠炎耶尔氏森菌致病株特有的功能性基因，且ail基因位点与细菌的侵袭力有关，因此，选择这一特定结构性、功能性基因序列作为引物，具有很好的特征性。

    如本文所用，ail位点基因的核苷酸序列，其GenBank登录号AJ605740，具体序列示于SEQ ID NO：1。

    根据ail基因设计的引物可在小肠结肠炎耶尔氏森菌致病株中扩出相应的DNA片段，而且，该引物未在其他相关菌株上扩增出相应片段，说明以ail基因序列为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。

    虽然通过同源性比较，ail基因的全长基因中有多个区域作为合适的特异性标志区域，然而，SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列是一种特别优选的适合作为小肠结肠炎耶尔氏森菌特异性遗传标志的序列。

    因此，基于SEQ ID NO：1和2，本发明提供了一种利用聚合酶链式反应扩增ail基因检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的方法；还提供一种快速定量检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的荧光定量PCR试剂盒。其中的关键是使用了特异性扩增小肠结肠炎耶尔氏森菌遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15～30个核苷酸，且一个引物序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，另一个引物的序列与SEQ ID NO：1互补，且扩增产物的长度为75～537个核苷酸。例如，SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物SEQ ID NO：4与SEQ IDNO：1所示的序列互补，且扩增产物的长度为150bp。SEQ ID NO：3和4分别对应于SEQ IDNO：1的2389和2518位置。

    本发明所述的特异性扩增小肠结肠炎耶尔氏森菌的引物及检测用的探针，可根据发明的遗传标记物的序列(SEQ ID NO：1或2)进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得(如可以用商业化的DNA自动合成仪合成)。

    本发明的这些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其它化学发光物质进行标记。

    本发明所述的小肠结肠炎耶尔氏森菌专一性核酸分子引物具有极好的种特异性。用本发明引物进行常规PCR反应，结果能从含有小肠结肠炎耶尔氏森菌的材料的DNA提取物中扩增出大小为150bp特异性PCR产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，并通过判断相应大小PCR产物的有无可准确、快速检测小肠结肠炎耶尔氏森菌，而且所需的样品量非常少。

    为了减少假阳性，还可对扩增产物用小肠结肠炎耶尔氏森菌特异性探针进行杂交。一种优选的探针是TaqMan探针，它可在PCR反应中直接实时地通过荧光信号反映扩增产物的存在与否以及数量的高低。

    本发明的探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其它化学发光物质进行标记。将该序列的5’端用报告荧光基团如羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)等标记，3’端用淬灭基团如TAMRA或Dabcyl等标记后即可用于小肠结肠炎耶尔氏森菌进行定性和定量分析的PCR反应。

    虽然引物和探针与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的产物含有本发明的片段。

    虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为70～1000bp，较佳地为75～500bp，更佳地为100～300bp。

    将本发明的引物与TaqMan探针技术结合，便得到了本发明的同时对小肠结肠炎耶尔氏森菌进行定性检测和定量计数分析方法，这种分析方法不仅克服了常规定量PCR方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

    在一优选例中，一种快速定量检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的荧光PCR试剂盒，该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品，其特征是：

    1)荧光定量反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液，特异性扩增ail基因遗传标记物的引物和荧光探针(如引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，荧光探针序列为SEQ ID NO：5)，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。

    2)定量校准品是含有SEQ ID NO：2共150个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌中增殖。阳性对照品是小肠结肠炎耶尔氏森菌阳性培养物。

    在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液包含50mM KCl，10mM Tris-HClPH8.3(25℃)，2mM MgCl₂，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，荧光探针2pmol，0.2mM dNTPs，无菌双蒸水和1.5个单位的Taq酶(Roche，瑞士)。其中引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，荧光探针SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

    在本发明的一个优选方案中，定量校准品是含有SEQ ID NO：2共有150个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌中增殖。贮存浓度为5×10⁹copies/μl，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释到5×10⁹copies/μl，-20℃保存。

    在本发明的一个优先方案中，DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH 8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。

    在本发明提供检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性探针，在探针完整时，两个基团在空间结构上距离靠近，5’端报告基团产生的荧光为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中检测不到荧光。在PCR退火和延伸过程中，探针和模板特异性结合，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其在5’→3’外切酶活性对荧光探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量PCR仪内的荧光检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈正比例关系，对小肠结肠炎耶尔氏森菌定量可以通过与定量校准品的循环阈值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出，Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量循环数。Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度定量校准品的Ct值制成标准曲线，再根据代测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

    本发明提供的检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的荧光定量PCR试剂盒，经过对各组分，如引物浓度、荧光探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等优化，将PCR技术与实时荧光PCR系统(包括PE7000/7300/7500，LightCycler)相结合。通过优化方案，反复实验，试剂盒完全可以满足快速特异检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的实际要求。

    本发明还提供了一种利用本发明试剂盒检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的方法，该方法包括如下检测步骤：

    i.用DNA裂解液从阳性对照品和等测样本中提取DNA；

    ii.分别取上步提取的DNA、梯度定量校准品加入荧光反应液中用实时荧光PCR仪进行扩增检测；

    iii.通过比较待测样本和标准品的循环阈值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。

    本发明与现常用的培养法相比具有以下主要优点和效果：

    a)检测速度快，加上DNA的提取，2～3小时完成；

    b)荧光探针的存在，保证了检测的特异性和灵敏度；

    c)操作简单；

    d)定量准确；

    e)可同时进行高通过的样品检测。

    下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Hardor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

    实施例1分离用于PCR分析的小肠结肠炎耶尔氏森菌DNA

    为了从待测样本中分离用于聚合酶链式反应检测的小肠结肠炎耶尔氏森菌DNA，必须使用不影响聚合酶链式反应的简单方法。首先，用灭菌生理悬浮临床样本(如粪便等)，将漂洗液15,000rpm离心15分钟后弃上清，沉淀物中可能含有小肠结肠炎耶尔氏森菌；沉淀中加入DNA裂解液后，振荡混匀，100℃沸水浴15分钟，裂解小肠结肠炎耶尔氏森菌释放DNA。最后15,000rpm离心15分钟，DNA溶解至上清液中，取上清液作为用于PCR分析的小肠结肠炎耶尔氏森菌DNA。

    实施例2检测试剂盒的制备

    用常规方法制备一种快速定量检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的荧光PCR试剂盒，该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品。其中：

    1)荧光定量反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液，特异性扩增ail基因遗传标记物的引物序列为SEQ ID NO：3和4，荧光探针序列为SEQ ID NO：5，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。(扩增产物大小为150bp)

    具体地，荧光定量反应液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl PH8.3(25℃)，2mM MgCl₂，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，荧光探针2pmol，0.2mM dNTPs，无菌双蒸水和1.5个单位的Taq酶(Roche，瑞士)。

    2)定量校准品是含有SEQ ID NO：2共有150个核苷酸片段构成的pGEM-T载体(该载体购自Promego公司，SEQ ID NO：2插入β-内酰胺酶编码区)，且该载体可在大肠杆菌中增殖。

    具体地，定量校准品在贮存浓度为5×10⁹copies/μl，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释到5×10⁹copies/μl，-20℃保存。

    3)DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH 8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。

    实施例3用小肠结肠炎耶尔氏森菌进行聚合酶链式反应

    分别取实施例2中的荧光反应液各26μl加入到不同的PCR反应管中，将实施例1中所得的DNA和定量校准品向荧光定量反应液中加入4μl，总体积30μl，在实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)上开始扩增检测。扩增参数设置为50℃2分钟，94℃5分钟，按94℃10秒→60℃45秒循环40次。把荧光检测的程序设计在每个循环的退火步骤结果时，检测波长为530nm。

    循环结束后，运用仪器配套软件，读取待检样本拷贝数。结果为：定量较准品5×10⁶copies/μl、5×10⁵copies/μl、5×10⁴copies/μl的22.13、25.65、29.08；待测样本的Ct值范围为21～36，经标准曲线换算定量范围为8.26×10⁶copies/μl～1.18×10¹copies/μl。具体结果如下表：

       待测样本  Ct值  病毒量(copies/μl)  1  31.13  5.72×10³  2  26.38  2.51×10⁵  3  30.96  9.37×10³  4  21.25  8.26×10⁶  5  36.12  1.18×10¹  6  24.98  7.51×10⁵  7  33.47  2.64×10²

    这表明，本发明试剂盒可在8.26×10⁶copies/μl～1.18×10¹copies/μl的广大范围内极其灵敏度地扩增出小肠结肠炎耶尔氏森菌。

    实施例4用各种病原体进行聚合酶链式反应

    用实施例1～3相同的方法进行扩增检测，不同点在于本实施例的反应模板选取其他相近各类的病原体的DNA，如肺炎衣原体、生殖支原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、人白细胞DNA。

    检测结果如下表：

       模板来源  Ct值  肺炎衣原体  -

       模板来源  Ct值  生殖支原体  -  肺炎链球菌  -  金黄色葡萄球菌  -  人白细胞DNA  -

    如上所述，本实施例对其他相近的病原体基因无交叉反应，可特异地扩增出小肠结肠炎耶尔氏森菌。

    因此，本发明第一次揭示了扩增ail基因检测小肠结肠炎耶尔氏森菌在敏感性、特异性方面的优势，同时提供了一种在此基础上快速特异检测小肠结肠炎耶尔氏森菌的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒对小肠结肠炎耶尔氏森菌的灵敏度、特异性强、重复性好，仅需2～3小时，大大缩短了检测时间。整个操作过程只需一个，一次可检测32～96(实时荧光PCR仪型号决定)个样本，减少了人力资源的浪费。

    实施例5用各种病原体进行聚合酶链式反应

    重复实施例1～4的相同方法，不同点仅在于用SEQ ID NO：6和7所示的引物替换SEQID NO：3和4所示的引物，用SEQ ID NO：8所示的探针替换SEQ ID NO：5所示的探针。

    检测结果表明，该引物对和探针同样可以特异地扩增出小肠结肠炎耶尔氏森菌。

    在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外，应理解，在音读阅读了本发明的上述讲授内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书限定的范围。

    核苷酸序列表

    SEQUENCE LISTING

    <110>上海复星医药(集团)股份有限公司

    上海复星医学科技发展有限公司

    <120>一种用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的靶序列及试剂盒

    <130>05

    <160>8

    <170>PatentIn version 3.3

    <210>1

    <211>3865

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：1

    <222>(1)..(3865)

    <400>1

    gcgtaaaaag ttttcccgca ctcagctgat tcattttctc ggttcctgtc aggcggcgac    60

    cgtggtgatg gaggcctgca gcggtgcgca atttatggct cgccagattg ctgatttggg    120

    ccatgagccg aagttgattt atccgcagtt cgtccgccct tttgttaaga gtaacaagaa    180

    cgattttgtc gatgcggaag ctatctgcga ggccgcttcc cggccctcta tgcgttttgt    240

    aaaaccccgc aggcaatggc cgccctgcat cgggtcaggg actcgttgat acggcaacgc    300

    gttaaaacca ccaaccagat gcacgctttt ttgctggagt tcagcgtcag cctgccgcgc    360

    ggtattgccg tgatacggcg tctgagcgct gtgctggaag aaaacgactt cccgccttat    420

    cttgcaaggg ttctcagcag gcttcaccgc cattatgttt acctctgcgg ggaaattgat    480

    gaggtcgata aggaactgaa aacccacctt gcagaggatg aaaacgcaca gcgcctgttg    540

    accattcccg gcgtcgggcc ggtaacggcg agtctgttag ccacgcggct gggtgacgga    600

    aaaaactatg ccagcagtcg tgactttgcg gcgtcgacag gtctggttcc tcgccagtac     660

    aagcacaggt ggaaaaacaa cgctgatggg catcagcaag cgaggtgata aaaatctgcg     720

    gcgacttctg gtacagtgtg cacgggtctt tatacagcgg ctggagcaca atccagggcg     780

    tctggcagag tgggttagaa agcagcttgc caaccatcat tcaaacgtgg tggcgtgcgc     840

    actggcaaac aaactggccc gcatagcctg ggcagtgacg gcacatcagg cggcgttcag     900

    tcaataaaag agccaacgaa aaactcgtca gctcagttaa ttaacacgtt actttctggt     960

    tttgcgacga cagataattg atgacatgaa cggcatatcg gcctgctgat gaacctgaca    1020

    taaaaaatgg ctctctgaag ccgggcggct ttttaaggtt cggcaggcgc ggaactcatc    1080

    gtggcgcggg cattaatgct caccagacgc cgaatagatt tacgcaagcc catcataaat    1140

    caaaatctgc gttgcaaaaa cgggggtgac catagatttt atggcagtaa atcaccgcgc    1200

    tctcaccgcg cattttaaat ccgagaccat tcacaaaagt gacctctgag aacgccatcg    1260

    cagcatggtg cgctcgggca tggtcgttct ggtgagcaga ggtctctttt gagggtaatt    1320

    accatgcaat atccaacagt atctgtaaac ggagtctctg ttcgtattga cgaagagggg    1380

    cgttacaacc tcaacgatct gcacgctgcc gctgtagcta atggagaagc aacggagtca    1440

    caaagaccga gtgtatttct tcggagtgcg cagataaaac gctttgtaaa agcgcttgag    1500

    gtcaaagcac aaaaaaagtt acttgtaaac aaatcaatca cttagggtta ttaaaggtgg    1560

    tgatgagctt ggagtatggg gtgtcgaatt gttggctatc cgatatgcag catgaattaa    1620

    gccggagttt gaaatcgaag tttacgacgt tttcagaaca gtcgtccgtc ttcgggtgag    1680

    cgccatgtct cacctgaaca aactggatca catcatcaac accgaaacca aagagataag    1740

    ccagtacgcc agaaaaatgg ctcgatgggg tgttggggga aggaagcaaa tattgcttat    1800

    ggcacgaaaa cgtatgatat atgagattca gatgtatttg ccggggctgg gaagtaacgc    1860

    gggtaattac tgtgacattc agtaataaaa tagagcctct attaaaggag cttcccgatt    1920

    tgaaatcgga aaaattacat cataaacatg ggtgtccaga agtcagttat cggcgatata    1980

    tccatttaaa gagtattgag ctatgaccag tattcatcaa taactacaga acaaaaatac    2040

    aggaataagc gactgatggg ataaagctga ggtaagctca tggtactgta tcaatatcca    2100

    tatttacata tgtatcatgg acttggcatt atatcactcg ccgtgtcagt gatatggtta    2160

    ttgtattagt attgttataa caattagggt gattttgatg aaaaagacat tactaactag    2220

    ttctttaata gcctgtttat caattgcgtc tgttaatgtg tacgctgcga gtgaaaatag    2280

    tatttctatt ggttatgcac aaagccatgt aaaagaaaat gggtatacat tggataatga    2340

    ccctaaaggt tttaacctga agtaccgtta tgaactcgat gataactggg gagtaatagg    2400

    ttcgtttgct tatacccatc agggatacga tttcttctat ggcagtaata agtttggtca    2460

    cggtgatctt gattactatt cagtaacaat ggggccatct ttccgcatta acgaatatgt    2520

    tagcctttat ggattactgg gtgctgctca cggaaaggtt aagtcatctg tatttgatgg    2580

    gtcagtcagt acaagtaaga cgtcaatggc atacggggca ggggtgcaat tcaacccgct    2640

    tccaaatttt gtcattgacg cttcatatga atactccaaa ctcgatagcg taaaatttgg    2700

    cacttggatg cttggtgcag ggtatcgatt ctaattatct cagatagtga aaacccacct    2760

    aaatggaggg ttcagacggc tgacaaagtc ctgacccttg ggccgggact ttgatataat    2820

    agggacaggc taaaaaacga gcttatccct gcgctaaaag aatctgctcc gcaacaatat    2880

    caactcgaaa tggtcaccct cgaagagctg gtgccgcaac atcatctggt gcgcaaagtc    2940

    gatgccgcca tagattttga atttatccgc gatgccgtcg ctcacctcta ttgtcctgac    3000

    aatggccgtc cggccgtcga ccctgtccgc ctgattaaaa tgatgctacc cggcggccgg    3060

    gtgctctaca ccgacagcac gcatctcaag gccagtgcca acccgcgtaa agccaaaaac    3120

    attccccagc cggtcaaagc cagtgcttac attgattcgc tgaatgcggc gattgatgaa    3180

    gaccgggccg ctgccggaaa aaagccgcta acgcccgcga cgacggcgaa aatgaaggac    3240

    accaaagtca gcaccactga cccggaaagc ggttttatgc accgggataa caagccgaaa    3300

    ggcttcttct ggctcgacca tcgcacagag gatggcaaat acggaattat cactgacacc    3360

    tatactaccc cccgtaatgt ccatgacagc cagccctata tcgcccggct ggagcgccag    3420

    ttaagccgtt ttaaactcaa ccccattgcg gtcgggctgg acacgggtta cttcaccgcc    3480

    ccggtctgtc acatgacaga acagattgat attattgcgg ttatgggtta ccggtggcca    3540

    aataaaggcc aaaatgtact gcaaaaaaac acttcattta cgatgataaa caggatgttt    3600

    atcaatgccc acaagggcag caacttatct acaaaaccac aagccgggaa ggctatcggc    3660

    actatcactc ttcatctgaa atctgtgggc aatgcccgca cttaattaac tgtacacaaa    3720

    gcaaaaacag ccaaaaagtc gtgacgaaga aatgtgtggg aggggagcaa agagcgggca    3780

    aatcagactc ggctgacggc atggggcaag aaagtttacg cgaggcgaaa agagacggtg    3840

    gaaggagctt cgcggatgca aaaca                                          3865

    <210>2

    <211>150

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：2

    <222>(1)..(150)

    <400>2

    gggagtaata ggttcgtttg cttataccca tcagggatac gatttcttct atggcagtaa     60

    taagtttggt cacggtgatc ttgattacta ttcagtaaca atggggccat ctttccgcat    120

    taacgaatat gttagccttt atggattact                                     150

    <210>3

    <211>20

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：3

    <222>(1)..(20)

    <400>3

    gggagtaata ggttcgtttg                                                 20

    <210>4

    <211>21

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：4

    <222>(1)..(21)

    <400>4

    agtaatccat aaaggctaac a                                            21

    <210>5

    <211>24

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：5

    <222>(1)..(24)

    <223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”

    <220>

    <221>misc_feature

    <222>(1)..(1)

    <400>5

    nacaatgggg ccatctttcc gcay                                         24

    <210>6

    <211>20

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：1

    <222>(1)..(20)

    <400>6

    ctggggagta ataggttcgt                                                20

    <210>7

    <211>20

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：7

    <222>(1)..(20)

    <400>7

    cccagtaatc cataaaggct                                                20

    <210>8

    <211>24

    <212>DNA

    <213>Yersinia enterocolitica

    <220>

    <221>SEQ ID NO：8

    <222>(1)..(24)

    <223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”

    <220>

    <221>misc_feature

    <222>(1)..(1)

    <400>8

    ntggtcacgg tgatcttgat tacy                                           24