一种重组蓝藻.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200810239558.X

申请日:

2008.12.12

公开号:

CN101748069A

公开日:

2010.06.23

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/13申请日:20081212授权公告日:20120808终止日期:20141212|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/13申请日:20081212|||公开

IPC分类号:

C12N1/13; C12N15/31; C12N15/52; C12N15/53; C12N15/54; C12N9/00; C12N9/04; C12N9/10; C07K14/195; C12R1/89(2006.01)N

主分类号:

C12N1/13

申请人:

中国科学院微生物研究所

发明人:

周杰; 解鹃; 高成华; 张延平; 李寅

地址:

100101 北京市朝阳区大屯路甲3号

优先权:

专利代理机构:

北京纪凯知识产权代理有限公司 11245

代理人:

关畅;任凤华

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内容摘要

本发明公开了一种重组蓝藻。该重组蓝藻,是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻:向色球藻科蓝藻中导入如下1)或2)中所述的丁醇合成相关基因:1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶;2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇,避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费,同时又有利于环境保护。因此,利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

权利要求书

1: 一种重组蓝藻,是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻:向蓝藻中导入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相关基因: 1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶; 2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶; 3)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。
2: 根据权利要求1所述的重组蓝藻,其特征在于:所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和/或乙酰辅酶A乙酰转移酶和/或丁醇脱氢酶。
3: 根据权利要求1或2所述的重组蓝藻,其特征在于:所述方法包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。
4: 根据权利要求2或3所述的重组蓝藻,其特征在于:所述灭活的方法为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因。
5: 根据权利要求4所述的重组蓝藻,其特征在于:所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因为聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因;所述灭活的方法为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因。
6: 根据权利要求3-5中任一所述的重组蓝藻,其特征在于:所述灭活的方法是通过同源重组实现的。
7: 根据权利要求1-6中任一所述的重组蓝藻,其特征在于: 所述烯酰水合酶为如下1)或2)所述的蛋白质: 1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质; 2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白质; 所述丁酰辅酶A脱氢酶为如下a)或b)所述的蛋白质: a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质; b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁酰辅酶A脱氢酶功能的由a)衍生的蛋白质; 所述电子转移黄素蛋白B亚基为如I或II所述的蛋白质: I由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质; II将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白B亚基功能的由I衍生的蛋白质; 所述电子转移黄素蛋白A亚基为如下i或ii所述的蛋白质: i由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质; ii将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白A亚基功能的由i衍生的蛋白质; 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为如下①或②所述的蛋白质: ①由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质; ②将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有3-羟丁酰辅酶A脱氢酶功能的由①衍生的蛋白质; 所述丁醇脱氢酶为如下A或B所述的蛋白质: A.由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质; B.将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁醇脱氢酶功能的由A衍生的蛋白质; 所述乙醇脱氢酶为如下A)或B)所述的蛋白质: A)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质; B)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇脱氢酶功能的由A)衍生的蛋白质; 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶为如下(1)或(2)所述的蛋白质: (1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质; (2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(1)衍生的蛋白质。
8: 根据权利要求1-7中任一所述的重组蓝藻,其特征在于: 所述烯酰水合酶的编码基因为如下1)、2)或3)所述的基因: 1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-786位核苷酸的DNA分子; 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; 3)与1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下a)、b)或c)所述的基因: a)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第800-1939位核苷酸的DNA分子; b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; c)与a)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为如I、II或III所述的基因: I其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子; II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; III与I限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为如下i、ii或iii所述的基因: i其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子; ii在严格条件下与i限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; iii与i限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下①、②或③所述的基因: ①核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子; ②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; ③与①限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述乙醇脱氢酶的编码基因为如下A、B或C所述的基因: A.其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第610-3186位核苷酸的DNA分子; B.在严格条件下与A限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; C.与A限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述丁醇脱氢酶的编码基因为如下(A)、(B)或(C)所述的基因: (A)其核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA分子; (B)在严格条件下与(A)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; (C)与(A)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子; 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因: (1)其核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA分子; (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子; (3)与(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
9: 根据权利要求1-8中任一所述的重组蓝藻,其特征在于:所述蓝藻为色球藻科蓝藻。
10: 根据权利要求1-9中任一所述的重组蓝藻,其特征在于:所述重组蓝藻为蓝藻集胞藻SMB-100CGMCC No.2795.和聚球藻SMB-101CGMCC No.2794。

说明书


一种重组蓝藻

    【技术领域】

    本发明涉及一种重组蓝藻。

    背景技术

    全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源的要求,而粮食短缺问题又要求可再生清洁能源的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作物争淡水。

    丁醇(butanol)是一种重要的化工原料,主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等,是一种高附加值化学品,全球年需求量超过140万吨。此外,丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料,具有如下优点:其热值、辛烷值与汽油相当,含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近;其不腐蚀管道,便于管道输送;其蒸汽压低,安全性高,能与汽油以任意比混合。

    丁醇可由发酵和石油化工合成法生产,由于石油危机,丁醇发酵生产成为研究热点。发酵生产主要是通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵粮食生产丁醇。从70年代起三十几年的研究,阐明了丙酮丁醇梭菌的丁醇代谢途径,使丁醇发酵生产取得了很大进展。但丁醇发酵生产存在发酵底物成本高、产物丁醇中混杂有丙酮、丙酮丁醇梭菌严格厌氧及丁醇对细胞有毒害等缺点。因此,科学家们在改进发酵生产丁醇的同时也在探索用非厌氧菌生物合成丁醇。美国和日本的科学家先后将丙酮丁醇梭菌的丁醇合成途径导入大肠杆菌中,并得到有丁醇产生的菌株。这种方法虽然解决了梭菌发酵生产丁醇时产物中混有丙酮和产丁醇梭菌的严格厌氧不利于操作的问题,但大肠杆菌仍为异养菌,其原料成本依然很高,没有解决发展生物能源与粮食问题的冲突。

    蓝藻(blue-green algae)又称蓝细菌(cyanobacteria),是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻能够利用二氧化碳和太阳能快速繁殖,而且其广泛分布在淡水、海水甚至是污水中,是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物,蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似,易于基因操作。

    【发明内容】

    本发明的一个目的是提供一种产丁醇的重组蓝藻。

    本发明所提供的重组蓝藻,是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻:向蓝藻中导入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相关基因:

    1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶(又称烯酰辅酶A水合酶)、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶;

    2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶;

    3)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。

    所述丁醇合成相关基因还可包括如下酶的编码基因:3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和/或乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)和/或丁醇脱氢酶。

    所述方法还可包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。

    所述灭活的方法可为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因。

    所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因具体可为聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因;所述灭活的方法具体可为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-3羟基丁酸酯合成酶的编码基因。

    所述灭活的方法可以是通过同源重组实现的。

    本发明方法中导入的丁醇合成相关基因可以自行通过复制型重组质粒来进行表达(即不包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤的情况),也可以整合到染色体上进行表达(即包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤情况),或者二者同时进行。

    所述各酶可以是如下氨基酸序列的蛋白质:

    所述烯酰水合酶为如下1)或2)所述的蛋白质:

    1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白质;

    所述丁酰辅酶A脱氢酶为如下a)或b)所述的蛋白质:

    a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁酰辅酶A脱氢酶功能的由a)衍生的蛋白质;

    所述电子转移黄素蛋白B亚基为如I或II所述的蛋白质:

    I由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    II将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白B亚基功能的由I衍生的蛋白质;

    所述电子转移黄素蛋白A亚基为如下i或ii所述的蛋白质:

    i由序列表中序列6所示地氨基酸序列组成的蛋白质;

    ii将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白A亚基功能的由i衍生的蛋白质;

    所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为如下①或②所述的蛋白质:

    ①由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    ②将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有3-羟丁酰辅酶A脱氢酶功能的由①衍生的蛋白质;

    所述丁醇脱氢酶为如下A或B所述的蛋白质:

    A.由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    B.将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁醇脱氢酶功能的由A衍生的蛋白质;

    所述乙醇脱氢酶为如下A)或B)所述的蛋白质:

    A)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    B)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇脱氢酶功能的由A)衍生的蛋白质;

    所述乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)为如下(1)或(2)所述的蛋白质:

    (1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

    (2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(1)衍生的蛋白质。

    所述导入的各酶的核苷酸序列可以如下:

    所述烯酰水合酶的编码基因为如下1)、2)或3)所述的基因:

    1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-786位核苷酸的DNA分子;

    2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    3)与1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下a)、b)或c)所述的基因:

    a)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第800-1939位核苷酸的DNA分子;

    b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    c)与a)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为如I、II或III所述的基因:

    I其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子;

    II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    III与I限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为如下i、ii或iii所述的基因:

    i其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子;

    ii在严格条件下与i限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    iii与i限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下①、②或③所述的基因:

    ①核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子;

    ②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    ③与①限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述乙醇脱氢酶的编码基因为如下A、B或C所述的基因:

    A.其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第610-3186位核苷酸的DNA分子;

    B.在严格条件下与A限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    C.与A限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述丁醇脱氢酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因:

    (1)其核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA分子;

    (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    (3)与(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因:

    (1)其核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA分子;

    (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;

    (3)与(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子;

    本发明中所用的出发菌可以蓝藻门中的任一蓝藻,具体可以是色球藻科蓝藻,具体可如色球藻科蓝藻为淡水蓝藻聚球藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)和海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)。

    本发明中得到的重组蓝藻具体为蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)SMB-100CGMCC No.2795和聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101 CGMCC No.2794。

    蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)SMB-100已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC No.2795。

    聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC No.2794。

    本发明利用了蓝藻可以进行光合自养的特性、可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点。

    本发明对蓝藻代谢途径进行改造和重建,在蓝藻中建立丁醇合成途径,使其具有产丁醇的能力。这样构建的重组蓝藻根据其自身的光合自养的特点来大量繁殖,从而产生更多的能源产品丁醇。本发明中使用蓝藻自身的诱导启动子,在控制丁醇合成途径的同时又避免了丁醇对蓝藻的毒害作用。

    本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇,避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费,同时又有利于环境保护。因此,利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

    【附图说明】

    图1为重组蓝藻SMB-100的鉴定。

    图2为标准品中丁醇的色谱图。

    图3为重组蓝藻8MB-100培养液中丁醇的色谱图。

    图4为重组蓝藻SMB-101的鉴定。

    【具体实施方式】

    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

    下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从生物公司购买。

    下述实施例中的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。

    本发明的总体构思如下:

    一、通过代谢工程改造,在蓝藻中建立丁醇合成途径:

    1、从丙酮丁醇梭菌中克隆丁醇合成途径中所需酶的编码基因:烯酰水合酶(crt)、丁酰辅酶A脱氢酶(bcd)、电子转移黄素蛋白B亚基(etfB)、电子转移黄素蛋白A亚基(etfA)、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)和乙醇脱氢酶(adhe)。其中前五个基因crt、bcd、etfB、etfB和hbd为一个操作子,将其命名为命名为crt操纵子。

    2、在蓝藻中诱导表达crt操纵子:构建蓝藻表达载体pAM-crt,使crt操纵子在蓝藻内源铜诱导启动子的启动下,在蓝藻中诱导表达。

    3、在蓝藻中表达乙醇脱氢酶基因(adhe):通过同源重组,将adhe基因整合在蓝藻基因组DNA上,并使其表达。

    二、工程蓝藻的鉴定及丁醇的诱导合成与检测:

    1、基因水平鉴定上述丁醇合成途径所需酶的编码基因已成功转入蓝藻中;

    2、通过诱导激活工程藻中建立的丁醇合成途径,使工程藻产丁醇;通过液相色谱检测工程蓝藻中有丁醇产生。

    下述实施例中,出发菌分别为色球藻科集胞藻属淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)(Zhang S,Spann KW,et al.Identification oftwo genes,sll0804 and slr1306,as putative components of theCO2-concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp.strainPCC 6803.J Bacteriol.2008 190:8234-7;)(中国科学院微生物研究所)和色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002);(Jin Z,Heinnickel M,et al.Biogenesis of iron-sulfur clusters in photosystem I:holo-NfuA from the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002 rapidly andefficiently transfers[4Fe-4S]clusters to apo-PsaC in vitro.J Biol Chem.2008,283:28426-35)(中国科学院微生物研究所)。

    丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824(US2007020740(A1));蓝藻表达载体pAM2770(Wu X,Li DW,et al.The Anabaenasp.strain PCC 7120 asr1734 gene encodes a negative regulator of heterocystDevelopment.Molecul Microbiol.2007,64:782-794.)(中国科学院微生物研究所);质粒pRL271(Wei TF,Ramasubramanian TS,et al.Anabaena sp.strain PCC7120 ntcA Gene required for growth on nitrate and heterocyst development.JBacteriol.1994,176:4473-4482.)。(中国科学院微生物研究所)。

    下述实施例中Synechocystis sp.PCC 6803及其工程菌转化、筛选及培养时所用培养基为BG-11培养基,基因工程菌株筛选时添加10μg/ml的卡那霉素和10μg/ml的氯霉素。

    下述实施例中Synechococcus sp.PCC 7002及其工程菌转化、筛选及培养时所用培养基为Medium 957培养基,基因工程菌株筛选时添加10μg/ml的卡那霉素和10μg/ml的氯霉素。

    BG-11培养基组成:每升培养基中含有NaNO31.5g,K2HPO40.04g,MgSO4·7H2O0.075g,CaCl2·2H2O 0.036g,柠檬酸0.006g,柠檬酸铁铵0.006g,EDTA(disodiumsalt)0.001g,Na2CO30.02g,Trace metal mix A5 1.0ml,琼脂10.0g,蒸馏水1.0L,pH 7.1±0.3。

    Medium 957培养基组成:每升培养基中含有蒸馏水250.0ml,海水750.0ml,MgSO4·7H2O 0.04g,CaCl2·2H2O 0.02g,NaNO3 0.75g,K2HPO4·3H2O 0.02g,柠檬酸3.0mg,柠檬酸铁铵3.0mg,EDTA(disodium potassium salt)乙二胺四乙酸0.5mg,Na2CO30.02g,Trace metal mix A5 1.0ml,琼脂10.0g,pH 8.5±0.3。

    Trace metal mix A5组成:每升中含有H3BO32.86g,MnCl2·4H2O 1.81g,ZnSO4·7H2O 0.222g,NaMoO4·2H2O 0.39g,CuSO4·5H2O 0.079g,Co(NO3)2·6H2O49.4mg,蒸馏水1.0L。

    实施例1、色球藻科集胞藻属(Synechocystis)淡水蓝藻集胞藻的重组构建

    本实施例中使用的出发蓝藻为淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)。

    一、向出发菌中导入丁醇合成相关基因

    本实验中的丁醇合成相关基因由crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因组成,组成一个crt操纵子,各基因均来自梭菌。

    1、crt操纵子的扩增:

    提取丙酮丁醇梭菌基因组DNA;

    根据丙酮丁醇梭菌基因组中crt操纵子DNA序列和蓝藻表达载体pAM2770上的酶切位点设计引物如下:

    crtF:ATTC GAGCTC AATGGAACTAAACAATGTCATCCT(下划线部分为SacI酶切位点);

    crtR:CG GGATCC ATGGGGATTCTTGTAAACTTATT(下划线部分为BamHI酶切位点)。

    以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板、以crtF和crtR为引物,进行PCR扩增;对扩增产物进行测序,得到的基因的序列如序列表中序列1所示,表明扩增产物为有crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因的crt操纵子,序列正确,其中自序列1的5’末端第1-786位核苷酸为crt基因的序列,第800-1939位核苷酸为bcd基因的序列,第1958-2737核苷酸为etfB基因的序列,第2756-3766位核苷酸为etfA基因的序列,第3871-4719位核苷酸为hbd基因的序列。

    2、重组蓝藻表达载体pAM-crt的构建:

    为避免丁醇对蓝藻生长的毒害作用,使用蓝藻内源启动子铜诱导启动子petE在蓝藻中诱导表达crt操纵子。

    用限制性内切酶SacI和BamHI酶切上述crt操纵子;用限制性内切酶SacI和BamHI酶切蓝藻表达载体pAM2770,回收大片段;将两酶切产物连接,连接产物转化至大肠杆菌中,通过50μg/ml卡那霉素筛选,得到重组质粒。重组质粒序列分析结果表明,crt操纵子正确插入到pAM2770载体上铜诱导启动子petE下游SacI和BamHI位点,并且插入的序列正确,将正确的阳性重组蓝藻表达载体命名为pAM-crt。

    3、pAM-crt对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化及筛选:

    转化方法:具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞,用培养基BG-11洗涤细胞后,将质粒pAM-crt加入到蓝藻培养液中混匀,光照下静止培养5小时;

    筛选:在含有卡那霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子,卡那霉素筛选浓度为10μg/ml;

    将得到的阳性重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM-crt。

    4、空载体pAM2770对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化及筛选:

    转化方法:具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞,用培养基BG-11洗涤细胞后,将质粒pAM2770加入到蓝藻培养液中混匀,光照下静止培养5小时。

    筛选:在含有卡那霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子,卡那霉素筛选浓度为10μg/ml。;

    将得到的含空载体的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770。

    二、用丙酮丁醇梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中PHB合成酶基因

    由于蓝藻中存在聚羟基丁酸(PHB)次级代谢途径,PHB合成与丁醇合成有共同的前体,而PHB合成酶的敲除不影响蓝藻生长,因此,用丁醇合成途径中最后一个酶乙醇脱氢酶基因(adhe)来取代蓝藻基因组中的PHB合成酶基因(phb),构建整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down,通过同源重组,用adhe和氯霉素抗性基因(Cm)取代蓝藻PHB合成酶基因。

    1、蓝藻同源重组整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down的构建:

    adhe基因的获得:以丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板,用下述引物(adheF/adheR)进行PCR扩增,PCR产物测序,得到adhe基因,其核苷酸序列如序列表中序列2中第610-3186位核苷酸所示。

    up为蓝藻基因组DNA中phb编码区上游的600bp DNA片段,通过以下方法获得:以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因组DNA为模板,用下述引物进行PCR扩增,PCR产物测序,得到up序列,其核苷酸序列如序列表中序列2中第1-609位核苷酸所示。

    down为蓝藻基因组DNA中phb编码区下游的600bp DNA片段,通过以下方法获得:以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因组DNA为模板,用下述引物(downF/downR)进行PCR扩增,PCR产物测序,得到down序列,其核苷酸序列如序列表中序列2中第4402-4996位核苷酸所示。

    Cm序列的获得:以质粒pRL271为模板,用下述引物(CmF/CmR)进行PCR扩增,PCR产物测序,得到Cm序列,其核苷酸序列如序列表中序列2中第3352-4401位核苷酸所示。

    up-adhe的获得:首先PCR分别扩增得到up和adhe,然后再把两片段混在一起作模板,用upF/adheR引物对进行第二轮PCR扩增,得到up-adhe;

    Cm-down的获得:首先PCR分别扩增得到Cm和down,然后再把两片段混在一起作模板,用CmF/downR引物对进行第二轮PCR扩增,得到Cm-down;;

    pUC-up-adhe-Cm-down的获得:用限制性内切酶XbaI酶切Cm-down,用限制性内切酶XbaI酶切pUC-18载体,连接得到重组载体pUC-18/Cm-down;用限制性内切酶BamHI酶切up-adhe,用限制性内切酶BamHI酶切pUC-18/Cm-down,连接得到重组载体pUC-up-adhe-Cm-down。

    阳性质粒的转化及筛选:用pUC-up-adhe-Cm-down转化大肠杆菌,经50μg/ml氨苄霉素和30μg/ml氯霉素筛选阳性克隆。

    阳性质粒的验证:将筛选得到的阳性质粒进行测序,表明插入的up-adhe-Cm-down序列如序列表中序列2所示,得到载体pUC-up-adhe-Cm-down正确;

    扩增各片段及融合PCR所需引物如下:

    upF:5’-CGCGGATCCCAGATTCGGTCTTCCCCCAGGCG(BamHI)

    upR:5’-CTTTTTGATTTGTAACTTTCATGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC(up-adhe融合所需嵌合引物)

    adheF:5’-ATGAAAGTTACAAATCAAAAAGA

    adheR:5’-CGCGGATCCAAAGAATTGTGGAGTAAAGGATA(BamHI)

    CmF:5’-GCTCTAGAGGTTGATAATGAACTGTGCTGAT(XbaI)

    CmR:5’-GTTGCCCTAATGTATTCCAGCAAATCGAATTTCTGCCATTCATCCG

    (Cm-down融合所需嵌合引物)

    downF:5’-TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC

    downR:5’-GCTCTAGAGATATCGAAGCGGACAACGGCAT(XbaI)

    2、将pUC-up-adhe-Cm-down转化至实验一中的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt中:

    转化方法:具体步骤为收集处于对数生长期的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt细胞,用培养基BG-11洗涤细胞后,将质粒pUC-up-adhe-Cm-down加入到细胞液中混匀,光照下静止培养5小时。

    筛选:在含有氯霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子,氯霉素筛选浓度为10μg/ml;将筛选得到的重组蓝藻命名为SMB-100。

    同时向蓝藻PCC 6803/pAM2770中转入空载体pUC-18,将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770/pUC,作为对照;同时向蓝藻PCC 6803中转入空载体pUC18,作为对照,将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pUC。

    三、重组蓝藻SMB-100的验证及目标产物丁醇的检测

    (1)基因水平鉴定:

    分别提取蓝藻SMB-100、PCC 6803/pAM2770、PCC 6803/pUC和PCC 6803/pAM2770/pUC的总DNA;再分别以crtF、crtR和phb700F、phb700R(蓝藻PHB合成酶基因的上下游700bp处设计的引物)为引物,进行PCR扩增。结果如图1A所示,在SMB-100中用引物crtF、crtR扩增得到4.7kb的DNA片段,大小与crt操纵子一致;在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带,表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-100中。结果如图1B所示,在SMB-100中,用引物phb700F、phb700R扩增得到5.3kb的DNA片段,大小与up-adhe-Cm-down一致;在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3.4kb片段,该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp,这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-100中,并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合成酶基因。(图1中,A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-100的鉴定,泳道1:DNA Maker λDNA/HindIII,泳道2:SMB-100,泳道3:对照组PCC 6803/pAM2770,泳道4:对照组PCC 6803/pUC、泳道5:对照组PCC 6803/pAM2770/pUC;B为adhe基因整合到SMB-100基因组的鉴定,泳道1:DNA MakerλDNA/HindIII,泳道2:SMB-100,泳道3:对照组PCC6803/pAM2770,泳道4:对照组PCC 6803/pUC,泳道5:对照组PCC6803/pAM2770/pUC)。phb700F:5’-TACAACATTTTTCTGTAGGC-3’,phb700R:5’-ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3’。

    (2)重组蓝藻SMB-100生产丁醇性能的检测:

    将重组蓝藻SMB-100接种于不含铜的BG-11培养基中,在30℃、60μmol m-2s-1光照、振荡的条件下培养至对数生长后期,使其细胞密度达到OD730=1.5;向培养液中加入2μM CuSO4使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达,进而诱导丁醇合成;在铜诱导48小时后,取培养液进行液相色谱检测。

    液相色谱检测方法为:样品前处理:取培养液12000rpm离心1min,取上清液,用0.22μm滤膜过滤;色谱条件:Agilent 1200液相色谱仪,示差检测器;BioRadAminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm),柱温15℃;上样量10μl;流动相为0.05mM H2SO4,流速0.5ml/min。

    丁醇标准品购自Sigma公司(目录号:4C006217);在如上色谱条件下标准品中丁醇的保留时间为40.9分钟,丁醇标准品的检测图谱如图2所示(A表示丁醇)。

    重组蓝藻SMB-100培养液的上清的检测图谱如图3所示(A表示丁醇)。

    实验设3次重复,结果取平均数。结果表明,工程藻SMB-100生产丁醇的能力为0.27g/L培养液。

    实施例2、色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002的重组构建

    本实施例中使用的出发蓝藻为海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC7002)。

    一、向出发菌中导入丁醇合成相关基因

    导入基因的序列及导入方法均与实施例1中一所述一致。

    转入空载体pAM2770的重组蓝藻命名为PCC 7002/pAM2770。

    二、用梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中PHB合成酶基因

    方法均与实施例1中二所述一致。

    既导入空载体pAM2770又导入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC7002/pAM2770/pUC,作为对照;向蓝藻PCC 7002中转入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC 7002/pUC。

    将得到的含有adhe基因和crt操纵子的重组蓝藻命名为SMB-101。

    三、蓝藻SMB-101的验证及目标产物丁醇的检测

    (1)基因水平鉴定:

    鉴定方法与实施例1中三所述一致。

    结果如图4A所示,在SMB-101中用引物crtF、crtR扩增得到4.7kb的DNA片段,大小与crt操纵子一致;在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带,表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-101中。结果如图4B所示,在SMB-101中,用引物phb700F、phb700R扩增得到5.3kb的DNA片段,大小与up-adhe-Cm-down一致;在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3.4kb片段,该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-101中,并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合成酶基因。(图4中,A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-101的鉴定,1:DNA MakerλDNA/HindIII;2:SMB-101;3:对照组PCC 7002/pAM2770,4:对照组PCC 7002/pUC,5:对照组PCC 7002/pAM2770/pUC;B为adhe基因整合到SMB-101基因组的鉴定,1:DNA MakerλDNA/HindIII;2:SMB-101;3:对照组PCC 7002/pAM2770,4:对照组PCC 7002/pUC,5:对照组PCC 7002/pAM2770/pUC)。phb700F:5’-TACAACATTTTTCTGTAGGC-3’,phb700R:5’-ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3’。

    (2)重组蓝藻SMB-101生产丁醇性能的检测:

    将重组蓝藻SMB-101接种于不含铜的Medium 957培养基中,在30℃、60μmolm-2s-1光照、振荡的条件下培养至对数生长后期,使其细胞密度达到OD730=1.5;向培养液中加入2μM CuSO4使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达,进而诱导丁醇合成;在铜诱导48小时后,取培养液进行液相色谱检测。

    色谱检测方法及条件同实施例1中三一致。

    实验设3次重复,结果取平均数。结果表明,工程藻SMB-101生产丁醇的能力为0.22g/L培养液。

    【序列表】

    <210>1

    <211>4736

    <212>DNA

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>1

    atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac    60

    agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata   120

    ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa   180

    tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga   240

    aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta   300

    atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat   360

    ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca   420

    cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag   480

    cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat   540

    aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg   600

    agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt   660

    gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag   720

    gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat   780

    agataggagg taagtttata tggattttaa tttaacaaga gaacaagaat tagtaagaca   840

    gatggttaga gaatttgctg aaaatgaagt taaacctata gcagcagaaa ttgatgaaac   900

    agaaagattt ccaatggaaa atgtaaagaa aatgggtcag tatggtatga tgggaattcc   960

    attttcaaaa gagtatggtg gcgcaggtgg agatgtatta tcttatataa tcgccgttga  1020

    ggaattatca aaggtttgcg gtactacagg agttattctt tcagcacata catcactttg  1080

    tgcttcatta ataaatgaac atggtacaga agaacaaaaa caaaaatatt tagtaccttt  1140

    agctaaaggt gaaaaaatag gtgcttatgg attgactgag ccaaatgcag gaacagattc  1200

    tggagcacaa caaacagtag ctgtacttga aggagatcat tatgtaatta atggttcaaa  1260

    aatattcata actaatggag gagttgcaga tacttttgtt atatttgcaa tgactgacag  1320

    aactaaagga acaaaaggta tatcagcatt tataatagaa aaaggcttca aaggtttctc  1380

    tattggtaaa gttgaacaaa agcttggaat aagagcttca tcaacaactg aacttgtatt  1440

    tgaagatatg atagtaccag tagaaaacat gattggtaaa gaaggaaaag gcttccctat  1500

    agcaatgaaa actcttgatg gaggaagaat tggtatagca gctcaagctt taggtatagc  1560

    tgaaggtgct ttcaacgaag caagagctta catgaaggag agaaaacaat ttggaagaag  1620

    ccttgacaaa ttccaaggtc ttgcatggat gatggcagat atggatgtag ctatagaatc  1680

    agctagatat ttagtatata aagcagcata tcttaaacaa gcaggacttc catacacagt  1740

    tgatgctgca agagctaagc ttcatgctgc aaatgtagca atggatgtaa caactaaggc  1800

    agtacaatta tttggtggat acggatatac aaaagattat ccagttgaaa gaatgatgag  1860

    agatgctaag ataactgaaa tatatgaagg aacttcagaa gttcagaaat tagttatttc  1920

    aggaaaaatt tttagataat ttaaggaggt taagaggatg aatatagttg tttgtttaaa  1980

    acaagttcca gatacagcgg aagttagaat agatccagtt aagggaacac ttataagaga  2040

    aggagttcca tcaataataa atccagatga taaaaacgca cttgaggaag ctttagtatt  2100

    aaaagataat tatggtgcac atgtaacagt tataagtatg ggacctccac aagctaaaaa  2160

    tgctttagta gaagctttgg ctatgggtgc tgatgaagct gtacttttaa cagatagagc  2220

    atttggagga gcagatacac ttgcgacttc acatacaatt gcagcaggaa ttaagaagct  2280

    aaaatatgat atagtttttg ctggaaggca ggctatagat ggagatacag ctcaggttgg  2340

    accagaaata gctgagcatc ttggaatacc tcaagtaact tatgttgaga aagttgaagt  2400

    tgatggagat actttaaaga ttagaaaagc ttgggaagat ggatatgaag ttgttgaagt    2460

    taagacacca gttcttttaa cagcaattaa agaattaaat gttccaagat atatgagtgt    2520

    agaaaaaata ttcggagcat ttgataaaga agtaaaaatg tggactgccg atgatataga    2580

    tgtagataag gctaatttag gtcttaaagg ttcaccaact aaagttaaga agtcatcaac    2640

    taaagaagtt aaaggacagg gagaagttat tgataagcct gttaaggaag cagctgcata    2700

    tgttgtctca aaattaaaag aagaacacta tatttaagtt aggagggatt tttcaatgaa    2760

    taaagcagat tacaagggcg tatgggtgtt tgctgaacaa agagacggag aattacaaaa    2820

    ggtatcattg gaattattag gtaaaggtaa ggaaatggct gagaaattag gcgttgaatt    2880

    aacagctgtt ttacttggac ataatactga aaaaatgtca aaggatttat tatctcatgg    2940

    agcagataag gttttagcag cagataatga acttttagca catttttcaa cagatggata    3000

    tgctaaagtt atatgtgatt tagttaatga aagaaagcca gaaatattat tcataggagc    3060

    tactttcata ggaagagatt taggaccaag aatagcagca agactttcta ctggtttaac    3120

    tgctgattgt acatcacttg acatagatgt agaaaataga gatttattgg ctacaagacc    3180

    agcgtttggt ggaaatttga tagctacaat agtttgttca gaccacagac cacaaatggc    3240

    tacagtaaga cctggtgtgt ttgaaaaatt acctgttaat gatgcaaatg tttctgatga    3300

    taaaatagaa aaagttgcaa ttaaattaac agcatcagac ataagaacaa aagtttcaaa    3360

    agttgttaag cttgctaaag atattgcaga tatcggagaa gctaaggtat tagttgctgg    3420

    tggtagagga gttggaagca aagaaaactt tgaaaaactt gaagagttag caagtttact    3480

    tggtggaaca atagccgctt caagagcagc aatagaaaaa gaatgggttg ataaggacct    3540

    tcaagtaggt caaactggta aaactgtaag accaactctt tatattgcat gtggtatatc    3600

    aggagctatc cagcatttag caggtatgca agattcagat tacataattg ctataaataa    3660

    agatgtagaa gccccaataa tgaaggtagc agatttggct atagttggtg atgtaaataa    3720

    agttgtacca gaattaatag ctcaagttaa agctgctaat aattaagata aataaaaaga    3780

    attatttaaa gcttattatg ccaaaatact tatatagtat tttggtgtaa atgcattgat    3840

    agtttcttta aatttaggga ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt    3900

    actatgggtt caggaattgc tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga    3960

    gatattaaag atgaatttgt tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa    4020

    ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc    4080

    ggaacagttg accttaatat ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa    4140

    agaatggata ttaaaaagca gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca    4200

    attcttgcat caaatacatc atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga    4260

    cctgataagg ttataggtat gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag    4320

    gtaataagag gaatagctac atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata    4380

    gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata    4440

    ttaataccaa tgattaatga agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa    4500

    gacatagata aagctatgaa acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt    4560

    gattttatag gtcttgatat atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga    4620

    gattctaagt atagaccaca tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga    4680

    agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat tcaaaataag tttacaagaa tcccca        4736

    <210>2

    <211>4996

    <212>DNA

    <220>

    <223>

    <400>2

    cagattcggt cttcccccag gcgatcgcca aggaaaaatt atttttctga cccgctaccg     60

    tggcgacaat ggtggccagg ttgatactcc tcaggttggt taacagccta tccaaaactt    120

    gctagagtgt tcattggcca aaaatcccat taattctttt attattaccg ctttgccatg     180

    gttaacacct acaccgccga aatccaacac cagggtcaga cctataccat ctccgttccc     240

    gaggataaaa cggtgctcca agcggcggat gatgagggga tacaactacc tacttcctgt     300

    ggcgctgggg tttgcactac ctgtgcggcg ttaatcaccg aaggcacagc ggagcaggct     360

    gacggcatgg gagtttcagc ggaactacag gctgagggat atgctctact ttgtgtagcc     420

    tatccccgct cagatttgaa aattatcacc gaaaaagaag acgaagttta tcagcggcag     480

    ttcggcggcc aaggttagat tcggctggaa ttctcccttc ccatgacaaa tcttccagag     540

    caacacttgc caccccaaaa agctgagcca taattcaggt agcggccagt agtaaggtgg     600

    attttgacca tgaaagttac aaatcaaaaa gaactaaaac aaaagctaaa tgaattgaga     660

    gaagcgcaaa agaagtttgc aacctatact caagagcaag ttgataaaat ttttaaacaa     720

    tgtgccatag ccgcagctaa agaaagaata aacttagcta aattagcagt agaagaaaca     780

    ggaataggtc ttgtagaaga taaaattata aaaaatcatt ttgcagcaga atatatatac     840

    aataaatata aaaatgaaaa aacttgtggc ataatagacc atgacgattc tttaggcata     900

    acaaaggttg ctgaaccaat tggaattgtt gcagccatag ttcctactac taatccaact     960

    tccacagcaa ttttcaaatc attaatttct ttaaaaacaa gaaacgcaat attcttttca    1020

    ccacatccac gtgcaaaaaa atctacaatt gctgcagcaa aattaatttt agatgcagct    1080

    gttaaagcag gagcacctaa aaatataata ggctggatag atgagccatc aatagaactt    1140

    tctcaagatt tgatgagtga agctgatata atattagcaa caggaggtcc ttcaatggtt    1200

    aaagcggcct attcatctgg aaaacctgca attggtgttg gagcaggaaa tacaccagca    1260

    ataatagatg agagtgcaga tatagatatg gcagtaagct ccataatttt atcaaagact    1320

    tatgacaatg gagtaatatg cgcttctgaa caatcaatat tagttatgaa ttcaatatac    1380

    gaaaaagtta aagaggaatt tgtaaaacga ggatcatata tactcaatca aaatgaaata    1440

    gctaaaataa aagaaactat gtttaaaaat ggagctatta atgctgacat agttggaaaa    1500

    tctgcttata taattgctaa aatggcagga attgaagttc ctcaaactac aaagatactt    1560

    ataggcgaag tacaatctgt tgaaaaaagc gagctgttct cacatgaaaa actatcacca    1620

    gtacttgcaa tgtataaagt taaggatttt gatgaagctc taaaaaaggc acaaaggcta    1680

    atagaattag gtggaagtgg acacacgtca tctttatata tagattcaca aaacaataag    1740

    gataaagtta aagaatttgg attagcaatg aaaacttcaa ggacatttat taacatgcct    1800

    tcttcacagg gagcaagcgg agatttatac aattttgcga tagcaccatc atttactctt    1860

    ggatgcggca cttggggagg aaactctgta tcgcaaaatg tagagcctaa acatttatta    1920

    aatattaaaa gtgttgctga aagaagggaa aatatgcttt ggtttaaagt gccacaaaaa    1980

    atatatttta aatatggatg tcttagattt gcattaaaag aattaaaaga tatgaataag    2040

    aaaagagcct ttatagtaac agataaagat ctttttaaac ttggatatgt taataaaata    2100

    acaaaggtac tagatgagat agatattaaa tacagtatat ttacagatat taaatctgat    2160

    ccaactattg attcagtaaa aaaaggtgct aaagaaatgc ttaactttga acctgatact    2220

    ataatctcta ttggtggtgg atcgccaatg gatgcagcaa aggttatgca cttgttatat    2280

    gaatatccag aagcagaaat tgaaaatcta gctataaact ttatggatat aagaaagaga    2340

    atatgcaatt tccctaaatt aggtacaaag gcgatttcag tagctattcc tacaactgct    2400

    ggtaccggtt cagaggcaac accttttgca gttataacta atgatgaaac aggaatgaaa    2460

    taccctttaa cttcttatga attgacccca aacatggcaa taatagatac tgaattaatg    2520

    ttaaatatgc ctagaaaatt aacagcagca actggaatag atgcattagt tcatgctata    2580

    gaagcatatg tttcggttat ggctacggat tatactgatg aattagcctt aagagcaata    2640

    aaaatgatat ttaaatattt gcctagagcc tataaaaatg ggactaacga cattgaagca    2700

    agagaaaaaa tggcacatgc ctctaatatt gcggggatgg catttgcaaa tgctttctta    2760

    ggtgtatgcc attcaatggc tcataaactt ggggcaatgc atcacgttcc acatggaatt    2820

    gcttgtgctg tattaataga agaagttatt aaatataacg ctacagactg tccaacaaag    2880

    caaacagcat tccctcaata taaatctcct aatgctaaga gaaaatatgc tgaaattgca    2940

    gagtatttga atttaaaggg tactagcgat accgaaaagg taacagcctt aatagaagct    3000

    atttcaaagt taaagataga tttgagtatt ccacaaaata taagtgccgc tggaataaat  3060

    aaaaaagatt tttataatac gctagataaa atgtcagagc ttgcttttga tgaccaatgt  3120

    acaacagcta atcctaggta tccacttata agtgaactta aggatatcta tataaaatca  3180

    ttttaaaaaa taaagaatgt aaaatagtct ttgcttcatt atattagctt catgaagcac  3240

    atagactatt ttacatttta ctcttgtttt ttatctttca agtggttgct tgtacgaatc  3300

    tgtaccatct ttaatattaa ttaccttgta tcctttactc cacaattctt tgttgataat  3360

    gaactgtgct gattacaaaa atactaaaaa tgcccatatt ttttcctcct tataaaatta  3420

    gtataattat agcacgcgaa ttcatcgaat aaatacctgt gacggaagat cacttcgcag  3480

    aataaataaa tcctggtgtc cctgttgata ccgggaagcc ctgggccaac ttttggcgaa  3540

    aatgagacgt tgatcggcac gtaagaggtt ccaactttca ccataatgaa ataagatcac  3600

    taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct aaaatggaga  3660

    aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg  3720

    aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg gatattacgg  3780

    cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc  3840

    ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg  3900

    tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt  3960

    catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata tattcgcaag  4020

    atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt gagaatatgt  4080

    ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata  4140

    tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg  4200

    tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc catgtcggca  4260

    gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg taattttttt  4320

    aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg gtgctacgcc tgaataagtg ataataagcg  4380

    gatgaatggc agaaattcga tttgctggaa tacattaggg caacactcag gactcatcta  4440

    gtgctttaac tgatacatcc accgcttgta cgtcaatagt tccaggggga gtggggcggg  4500

    taaattgtcc attgctcact tccaactctt ccccgcaact ggggcatcgg catggctgac  4560

    cgtcaaaacc agtgaagtga tactgacaaa cgggacactc cccatccacc aattttctct  4620

    tcagccacca gcggaatacc aaaaagccca ccgttggtgc cagaaacaat agcaaaatca  4680

    acagagcaat gccattgaca acccatttca gaccaatggc actgaggagc atggccacgg  4740

    caaggacagt caagccacag cccaggcctg attggttgac ggtaacaaat ttgggggaaa  4800

    agttgttcac agatggctcc taccaacagc attaccgctg ggatcactat tttccatcct  4860

    agtccattag ctccgcagtt ggaataccaa ggtatcctcc cctgggctaa aggttttgaa  4920

    caggtcgcac accatgccta tcccattaaa atcacgttgt caatcacatg gataatgccg  4980

    ttgtccgctt cgatat                                                  4996

    <210>3

    <211>261

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>3

    Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val

    1               5                  10                  15

    Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr

                20                 25                  30

    Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu

            35                 40                  45

    Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala

        50                 55                  60

    Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg

    65                 70                  75                  80

    Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu

                   85                  90                  95

    Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly

                100                105                 110

    Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala

            115                 120                125

    Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly

        130                 135                140

    Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln

    145                 150               155                  160

    Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile

                    165                170                 175

    Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala

                180                 185                190

    Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys

            195                 200                205

    Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr

        210                 215                220

    Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu

    225                 230                235                 240

    Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu

                    245                250                 255

    Gly Phe Lys Asn Arg

                260

    <210>4

    <211>378

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>4

    Met Asp Phe Asn Leu Thr Arg Glu Gln Glu Leu Val Arg Gln Met Val

    1               5                  10                  15

    Arg Glu Phe Ala Glu Asn Glu Val Lys Pro Ile Ala Ala Glu Ile Asp

                20                 25                  30

    Glu Thr Glu Arg Phe Pro Met Glu Asn Val Lys Lys Met Gly Gln Tyr

            35                 40                  45

    Gly Met Met Gly Ile Pro Phe Ser Lys Glu Tyr Gly Gly Ala Gly Gly

        50                 55                  60

    Asp Val Leu Ser Tyr Ile Ile Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys Val Cys

    65                  70                 75                  80

    Gly Thr Thr Gly Val Ile Leu Ser Ala His Thr Ser Leu Cys Ala Ser

                    85                 90                  95

    Leu Ile Asn Glu His Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Val

                100                 105                110

    Pro Leu Ala Lys Gly Glu Lys Ile Gly Ala Tyr Gly Leu Thr Glu Pro

            115                 120                125

    Asn Ala Gly Thr Asp Ser Gly Ala Gln Gln Thr Val Ala Val Leu Glu

        130                135                 140

    Gly Asp His Tyr Val Ile Asn Gly Ser Lys Ile Phe Ile Thr Asn Gly

    145                150                 155                 160

    Gly Val Ala Asp Thr Phe Val Ile Phe Ala Met Thr Asp Arg Thr Lys

                    165                170                 175

    Gly Thr Lys Gly Ile Ser Ala Phe Ile Ile Glu Lys Gly Phe Lys Gly

                180                185                 190

    Phe Ser Ile Gly Lys Val Glu Gln Lys Leu Gly Ile Arg Ala Ser Ser

            195                200                205

    Thr Thr Glu Leu Val Phe Glu Asp Met Ile Val Pro Val Glu Asn Met

        210                215                 220

    Ile Gly Lys Glu Gly Lys Gly Phe Pro Ile Ala Met Lys Thr Leu Asp

    225                230                 235                 240

    Gly Gly Arg Ile Gly Ile Ala Ala Gln Ala Leu Gly Ile Ala Glu Gly

                    245                250                 255

    Ala Phe Asn Glu Ala Arg Ala Tyr Met Lys Glu Arg Lys Gln Phe Gly

               260                265                 270

    Arg Ser Leu Asp Lys Phe Gln Gly Leu Ala Trp Met Met Ala Asp Met

            275                280                 285

    Asp Val Ala Ile Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Val Tyr Lys Ala Ala Tyr

        290                295                 300

    Leu Lys Gln Ala Gly Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys

    305                 310                315                 320

    Leu His Ala Ala Asn Val Ala Met Asp Val Thr Thr Lys Ala Val Gln

                    325                330                 335

    Leu Phe Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Lys Asp Tyr Pro Val Glu Arg Met

                340                345                 350

    Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Glu Ile Tyr Glu Gly Thr Ser Glu Val

            355                360                 365

    Gln Lys Leu Val Ile Ser Gly Lys Ile Phe

        370                 375

    <210>5

    <211>259

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>5

    Met Asn Ile Val Val Cys Leu Lys Gln Val Pro Asp Thr Ala Glu Val

    1               5                  10                  15

    Arg Ile Asp Pro Val Lys Gly Thr Leu Ile Arg Glu Gly Val Pro Ser

                20                 25                  30

    Ile Ile Asn Pro Asp Asp Lys Asn Ala Leu Glu Glu Ala Leu Val Leu

            35                  40                 45

    Lys Asp Asn Tyr Gly Ala His Val Thr Val Ile Ser Met Gly Pro Pro

        50                  55                 60

    Gln Ala Lys Asn Ala Leu Val Glu Ala Leu Ala Met Gly Ala Asp Glu

    65                 70                 75                  80

    Ala Val Leu Leu Thr Asp Arg Ala Phe Gly Gly Ala Asp Thr Leu Ala

                   85                  90                  95

    Thr Ser His Thr Ile Ala Ala Gly Ile Lys Lys Leu Lys Tyr Asp Ile

                100                105                 110

    Val Phe Ala Gly Arg Gln Ala Ile Asp Gly Asp Thr Ala Gln Val Gly

            115                120                 125

    Pro Glu Ile Ala Glu His Leu Gly Ile Pro Gln Val Thr Tyr Val Glu

        130                135                140

    Lys Val Glu Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Ile Arg Lys Ala Trp Glu

    145                150                 155                 160

    Asp Gly Tyr Glu Val Val Glu Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr Ala

                    165                170                 175

    Ile Lys Glu Leu Asn Val Pro Arg Tyr Met Ser Val Glu Lys Ile Phe

                180                185                190

    Gly Ala Phe Asp Lys Glu Val Lys Met Trp Thr Ala Asp Asp Ile Asp

            195                200                 205

    Val Asp Lys Ala Asn Leu Gly Leu Lys Gly Ser Pro Thr Lys Val Lys

        210                215                 220

    Lys Ser Ser Thr Lys Glu Val Lys Gly Gln Gly Glu Val Ile Asp Lys

    225                 230                235                 240

    Pro Val Lys Glu Ala Ala Ala Tyr Val Val Ser Lys Leu Lys Glu Glu

                    245                250                 255

    His Tyr Ile

    <210>6

    <211>336

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>6

    Met Asn Lys Ala Asp Tyr Lys Gly Val Trp Val Phe Ala Glu Gln Arg

    1              5                   10                  15

    Asp Gly Glu Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Gly Lys

                20                 25                  30

    Glu Met Ala Glu Lys Leu Gly Val Glu Leu Thr Ala Val Leu Leu Gly

            35                 40                  45

    His Asn Thr Glu Lys Met Ser Lys Asp Leu Leu Ser His Gly Ala Asp

        50                 55                  60

    Lys Val Leu Ala Ala Asp Asn Glu Leu Leu Ala His Phe Ser Thr Asp

    65                  70                 75                  80

    Gly Tyr Ala Lys Val Ile Cys Asp Leu Val Asn Glu Arg Lys Pro Glu

                    85                 90                  95

    Ile Leu Phe Ile Gly Ala Thr Phe Ile Gly Arg Asp Leu Gly Pro Arg

                100                105                 110

    Ile Ala Ala Arg Leu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Asp Cys Thr Ser Leu

            115                120                 125

    Asp Ile Asp Val Glu Asn Arg Asp Leu Leu Ala Thr Arg Pro Ala Phe

        130                 135                140

    Gly Gly Asn Leu Ile Ala Thr Ile Val Cys Ser Asp His Arg Pro Gln

    145                 150                155                 160

    Met Ala Thr Val Arg Pro Gly Val Phe Glu Lys Leu Pro Val Asn Asp

                    165                170                 175

    Ala Asn Val Ser Asp Asp Lys Ile Glu Lys Val Ala Ile Lys Leu Thr

                180                185                 190

    Ala Ser Asp Ile Arg Thr Lys Val Ser Lys Val Val Lys Leu Ala Lys

            195                200                 205

    Asp Ile Ala Asp Ile Gly Glu Ala Lys Val Leu Val Ala Gly Gly Arg

        210                215                 220

    Gly Val Gly Ser Lys Glu Asn Phe Glu Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser

    225                 230                235                 240

    Leu Leu Gly Gly Thr Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ile Glu Lys Glu

                    245                250                 255

    Trp Val Asp Lys Asp Leu Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val Arg

                260                265                 270

    Pro Thr Leu Tyr Ile Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His Leu

            275                 280                285

    Ala Gly Met Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Ile Ala Ile Asn Lys Asp Val

        290                 295                300

    Glu Ala Pro Ile Met Lys Val Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Asp Val

    305                 310                315                 320

    Asn Lys Val Val Pro Glu Leu Ile Ala Gln Val Lys Ala Ala Asn Asn

                    325                330                 335

    <210>7

    <211>282

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>7

    Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile

    1               5                  10                  15

    Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile

                20                 25                  30

    Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu

            35                 40                  45

    Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu

        50                 55                  60

    Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp

    65                  70                 75                  80

    Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys

                    85                 90                  95

    Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu

                100                105                 110

    Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr

            115                 120                125

    Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro

        130                135                 140

    Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu

    145                 150                155                 160

    Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro

                    165                170                 175

    Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile

                180                185                 190

    Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser

            195                200                 205

    Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met

        210                215                 220

    Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala

    225                230                235                  240

    Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro

                    245                250                 255

    His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys

                260                265                 270

    Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Lys

            275                 280

    <210>8

    <211>390

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>8

    Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys

    1              5                   10                  15

    Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys

                20                 25                  30

    Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr

            35                 40                  45

    Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu

        50                 55                  60

    Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Thr Thr Val Glu Lys Gly

    65                  70                 75                  80

    Val Lys Ile Cys Arg Glu Asn Gly Val Glu Val Val Leu Ala Ile Gly

                    85                 90                  95

    Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu

                100                 105                110

    Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Asp Ile Val Leu Asp Gly Ser Lys Ile Lys

            115                120                 125

    Arg Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ala Thr Gly Ser

        130                 135                140

    Glu Met Asp Thr Trp Ala Val Ile Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys

    145                 150                155                 160

    Leu Ile Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp

                    165                170                 175

    Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr

                180                185                 190

    Ala Asp Ile Met Ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys

            195                 200                205

    Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys

        210                215                 220

    Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala

    225                230                 235                 240

    Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu

                    245                250                 255

    Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu

                260                265                 270

    Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu

            275                280                 285

    Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys

        290                295                 300

    Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn

    305                 310                315                 320

    His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe

                    325                330                 335

    Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly Ile Glu

                340                345                 350

    Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly

            355                360                 365

    Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln

        370                375                 380

    Ile Phe Lys Lys Ser Val

    385                 390

    <210>9

    <211>858

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>9

    Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu

    1              5                   10                  15

    Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp

                20                 25                  30

    Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn

            35                 40                  45

    Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp

        50                  55                 60

    Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr

    65                 70                  75                  80

    Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly

                    85                 90                  95

    Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro

                100                105                 110

    Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu

            115                 120                125

    Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys

        130                 135                140

    Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala

    145                 150                155                 160

    Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu

                    165                170                 175

    Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly

                180                 185                190

    Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile

            195                 200                205

    Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp

        210                215                 220

    Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn

    225                 230                235                 240

    Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile

                    245                250                 255

    Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu

                260                265                 270

    Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly

            275                 280                285

    Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys

        290                 295                300

    Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu

    305                 310                315                 320

    Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser

                    325                330                 335

    Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys

                340                345                 350

    Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser

            355                 360                365

    Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly

        370                 375                380

    Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln

    385                 390                395                 400

    Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr

                    405                410                 415

    Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu

                420                425                 430

    Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn

            435                 440                445

    Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys

        450                 455                460

    Leu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Leu Lys Asp Met Asn Lys Lys Arg Ala

    465                 470                475                 480

    Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys

                    485                490                 495

    Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr

                500                505                 510

    Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys

            515                 520                525

    Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly

        530                 535                540

    Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro

    545                 550                555                 560

    Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys

                    565                570                 575

    Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala

                580                 585                590

    Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val

            595                 600                605

    Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu

        610                 615                620

    Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met

    625                 630                635                 640

    Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala

                    645                650                 655

    Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu

                660                 665                670

    Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr

            675                680                 685

    Lys Asn Gly Thr Asn Asp Ile Glu Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala

        690                 695                700

    Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys

    705                 710                715                 720

    His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly

                    725                730                 735

    Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Tyr Asn Ala Thr

                740                745                 750

    Asp Cys Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Pro Gln Tyr Lys Ser Pro Asn

            755                 760                765

    Ala Lys Arg Lys Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu Asn Leu Lys Gly

        770                 775                780

    Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys

    785                 790                795                 800

    Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile Ser Ala Ala Gly Ile

                    805                810                 815

    Asn Lys Lys Asp Phe Tyr Asn Thr Leu Asp Lys Met Ser Glu Leu Ala

                820                 825                830

    Phe Asp Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro Arg Tyr Pro Leu Ile Ser

            835                 840                845

    Glu Leu Lys Asp Ile Tyr Ile Lys Ser Phe

        850                 855

    <210>10

    <211>392

    <212>PRT

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>10

    Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser

    1               5                  10                  15

    Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr

                20                 25                  30

    Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val

            35                  40                 45

    Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn

        50                  55                 60

    Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro

    65                  70                 75                  80

    Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser

                    85                 90                  95

    Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala

                100                105                 110

    Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala

            115                 120                125

    Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile

        130                 135                140

    Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr

    145                 150                155                 160

    Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp

                    165                170                 175

    Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser

                180                 185                190

    Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys

            195                 200                205

    Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr

        210                 215                220

    Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr

    225                 230                235                 240

    Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu

                    245                250                 255

    Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu

                260                 265                270

    Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met

            275                 280                285

    Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly

        290                 295                300

    Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala

    305                 310                315                 320

    Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys

                    325                330                 335

    Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala

                340                 345                350

    Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg

            355                 360                365

    Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly

        370                 375                 380

    Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys

    385                 390

    <210>11

    <211>1173

    <212>DNA

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>11

    gtggttgatt tcgaatattc aataccaact agaatttttt tcggtaaaga taagataaat     60

    gtacttggaa gagagcttaa aaaatatggt tctaaagtgc ttatagttta tggtggagga    120

    agtataaaga gaaatggaat atatgataaa gctgtaagta tacttgaaaa aaacagtatt    180

    aaattttatg aacttgcagg agtagagcca aatccaagag taactacagt tgaaaaagga    240

    gttaaaatat gtagagaaaa tggagttgaa gtagtactag ctataggtgg aggaagtgca    300

    atagattgcg caaaggttat agcagcagca tgtgaatatg atggaaatcc atgggatatt    360

    gtgttagatg gctcaaaaat aaaaagggtg cttcctatag ctagtatatt aaccattgct    420

    gcaacaggat cagaaatgga tacgtgggca gtaataaata atatggatac aaacgaaaaa    480

    ctaattgcgg cacatccaga tatggctcct aagttttcta tattagatcc aacgtatacg    540

    tataccgtac ctaccaatca aacagcagca ggaacagctg atattatgag tcatatattt    600

    gaggtgtatt ttagtaatac aaaaacagca tatttgcagg atagaatggc agaagcgtta    660

    ttaagaactt gtattaaata tggaggaata gctcttgaga agccggatga ttatgaggca    720

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    gacactaatt ggagtgtaca cttaatggaa catgaattaa gtgcttatta cgacataaca    840

    cacggcgtag ggcttgcaat tttaacacct aattggatgg agtatatttt aaataatgat    900

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    cactatgaca tagcacatca agcaatacaa aaaacaagag attactttgt aaatgtacta   1020

    ggtttaccat ctagactgag agatgttgga attgaagaag aaaaattgga cataatggca   1080

    aaggaatcag taaagcttac aggaggaacc ataggaaacc taagaccagt aaacgcctcc   1140

    gaagtcctac aaatattcaa aaaatctgtg taa                                1173

    <210>12

    <211>1179

    <212>DNA

    <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

    <400>12

    atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct     60

    cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa    120

    gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt    180

    ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca    240

    gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa    300

    attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga    360

    gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt    420

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    tttggatcaa ctatagaagg acttgcaaaa ttaaaacctg ccttcaaaaa agatggaaca    720

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资源描述

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本发明公开了一种重组蓝藻。该重组蓝藻,是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻:向色球藻科蓝藻中导入如下1)或2)中所述的丁醇合成相关基因:1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶;2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因:电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的。

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