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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610466093.6 (22)申请日 2016.06.23 (71)申请人 蓬莱海洋(山东)股份有限公司 地址 265607 山东省烟台市蓬莱市经济开 发区金创路168号 申请人 山东省科学院生物研究所 (72)发明人 韩利文 张轩铭 陈玉峰 何秋霞 侯海荣 李晓彬 张姗姗 郭敬兰 党立 刘可春 孙博 隋晓明 于涛 彭德杰 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 张宏松 (51)Int.Cl. A61K 35/616(2015.01) A。
2、61P 39/06(2006.01) (54)发明名称 一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂 苷的方法 (57)摘要 本发明涉及一种利用海参内脏提取高纯度 海参内脏皂苷的方法， 该方法醇提后结合控温泡 沫分离和树脂富集来提取海参内脏皂苷， 使分离 更彻底， 有效的保护了活性成分的生物活性， 大 大减少原料中海参多肽对皂苷纯度的影响， 得到 的皂苷保存有完好的结构和有效地生物活性， 具 有良好的抗自由基氧化作用， 纯度高， 提取效率 高， 一步上样， 大大缩短提取时间、 降低能耗。 权利要求书1页 说明书6页 CN 106038602 A 2016.10.26 CN 106038602 A 1.。
3、一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 包括步骤如下： (1)收集海参内脏沥去水分， 烘干、 粉碎， 然后加入乙醇， 升温至6085进行提取60 240min， 经固液分离得到海参皂苷提取液， 提取液采用减压蒸馏回收乙醇后得海参皂苷浸 膏； (2)将海参皂苷浸膏配制成悬浮液， 悬浮液采用控温泡沫分离进行分离纯化， 得到的泡 沫经破泡沫后得到海参皂苷破沫液； 所述的控温泡沫分离， 鼓泡气体为空气， 控温温度为40 60， 鼓泡气体流速13mL/min， 一个操作周期30180min； (3)将步骤(2)得到的海参皂苷破沫液稀释后直接上样至大孔树脂柱顶端， 吸附完全后 用不同浓度的乙醇进行。
4、两步洗脱， 收集洗脱液， 进行干燥处理即得高纯度海参内脏皂苷。 2.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(2)， 所述的控温泡沫分离， 控温温度为4055， 鼓泡气体流速12mL/min， 优选的， 所述的控温泡沫分离， 控温温度为45， 鼓泡气体流速1.5mL/min。 3.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 采用向浸膏中加入浸膏重量1015倍的水进行悬浮， 制得悬浮液。 4.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述的破沫方法为溶剂。
5、破沫法， 选择无水乙醇作为破沫剂， 将无水乙醇经喷嘴 喷入进行破沫。 5.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述海参皂苷破沫液稀释是采用向海参皂苷破沫液中加入水进行稀释， 使其乙 醇质量浓度为20-30， 直接通过管路泵至大孔树脂柱顶端， 作为上柱液。 6.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述大孔树脂柱内填料为D101树脂， 上柱吸附方式为动态吸附， 上柱液以1bv 10bv/h的流速通入大孔树脂柱。 7.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特。
6、征在于， 大孔树脂柱内填料用量为每小时料液流量的1/201/10。 8.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 两步洗脱为饱和吸附后先用24倍柱体积、 与上柱液同等浓度的乙醇溶液进行 初步洗脱， 然后用46倍柱体积、 质量浓度6090的乙醇进行再次洗脱。 9.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述的海参内脏为鲜品或冻干品， 冻干品使用前进行化冻， 海参内脏优选刺参 内脏， 烘干温度为6080， 粉碎至60-120目。 10.根据权利要求1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方。
7、法， 其特征在 于， 步骤(1)中， 所述的乙醇的质量浓度为9296， 乙醇的加入量为海参内脏粉末质量的4 8倍， 升温至7085进行提取23次。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106038602 A 2 一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种海产品废弃物再利用的方法， 具体是一种利用海参内脏提取高纯 度海参内脏皂苷的方法。 背景技术 0002 海参为高蛋白、 低脂肪无脊椎动物， 明代以后被本草收录， 列为补益药， 是营养价 值极高的保健食品。 随着海参食用及药用价值的日益显现， 海参的需求量与日俱增， 其养殖 和销售规模也逐渐扩大， 由此。
8、产生大量的下脚料， 如内脏(肠、 卵等)。 现实生产进程中， 海参 内脏往往被当做加工的废弃物丢弃， 造成极大的资源浪费和环境污染， 如何对其中资源进 行利用和加工， 是深度开发的前提和依据。 0003 国内外通过相关技术对海参内脏中活性物质的分离鉴定以及生物医学作用进行 了不断深入的研究， 证实海参内脏中含有海参皂苷、 海参粘多糖、 活性肽等多种成分。 海参 内脏皂苷， 又称海参素， 是海参防御外界不良环境所产生的主要次生代谢产物， 具有抗肿 瘤、 提高免疫力、 抗新血管生成、 抗凝血、 促进纤维蛋白溶解、 抑制栓塞形成、 抗炎、 抗菌抗病 毒的作用。 0004 目前已知的海参皂苷按照苷元类。
9、型可分为以下两种： 海参烷型和非海参烷型， 海 参烷型苷元一般为18(20)内酯环， 非海参烷型苷元有18(16)内酯环或无内酯环结构。 从糖 链组成来看， 植物源皂苷糖链可由23个支链构成， 而海参皂苷糖链多由单一直链构成， 糖 分子数目一般不超过6个， 且常伴有硫酸化取代基团的出现。 0005 海参内脏和体壁所含的皂苷类成分在结构上在母核结构上基本相同， 但是其基团 有所不同。 在含量上， 体壁皂苷的含量较之内脏要低且一年四季变化不明显， 海参内脏中的 皂苷含量在其繁殖季节可增加至平时的80200倍， 种类也比体壁皂苷丰富， 是一种极具开 发潜力的天然活性资源。 0006 中国专利文献CN。
10、 102512452A(申请号： 201110384721.3)公开一种利用海参体腔 液制备海参皂苷的工艺方法， 将海参体腔液过滤去除不溶物； 清液进行浓缩后拌入适量硅 胶粉， 鼓风干燥； 所得固体物质粉碎后采用石油醚提取脱脂； 脱脂后用乙醇提取23次， 收 集提取液浓缩后通过大孔吸附树脂柱， 而后用水冲洗大孔吸附树脂柱去除杂质， 再用乙醇 洗脱吸附在大孔吸附树脂上的海参皂苷成分， 收集洗脱液减压浓缩至浸膏状， 干燥， 得海参 皂苷干品， 经过实际应用发现， 该方法提取效果差， 提取效率低， 纯度低， 夹杂其他杂质成分 较多。 0007 国内对海参皂苷的研究和开发主要集中在体壁， 对于内脏特有。
11、的这类皂苷成分， 未见相关文献报道。 另外， 海参吐脏等生物学现象非常独特， 其强大的组织再生能力引起全 球的研究人员的关注， 海参内脏成分成为研究人员关注的焦点， 因此如何提取高纯度海参 内脏皂苷至关重要。 发明内容 说 明 书 1/6 页 3 CN 106038602 A 3 0008 针对现有技术的不足， 本发明提供一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的 方法， 本发明利用海参内脏为原料， 结合控温泡沫分离和树脂富集， 提取得到的海参内脏皂 苷纯度高， 提取效率高。 0009 本发明的技术方案如下： 0010 一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 包括步骤如下： 0011 (。
12、1)收集海参内脏沥去水分， 烘干、 粉碎， 然后加入乙醇， 升温至6085进行提取 60240min， 经固液分离得到海参皂苷提取液， 提取液采用减压蒸馏回收乙醇后得海参皂 苷浸膏； 0012 (2)将海参皂苷浸膏配制成悬浮液， 悬浮液采用控温泡沫分离进行分离纯化， 得到 的泡沫经破泡沫后得到海参皂苷破沫液； 所述的控温泡沫分离， 鼓泡气体为空气， 控温温度 为4060， 鼓泡气体流速13mL/min， 一个操作周期30180min； 0013 (3)将步骤(2)得到的海参皂苷破沫液稀释后直接上样至大孔树脂柱顶端， 吸附完 全后用不同浓度的乙醇进行两步洗脱， 收集洗脱液， 进行干燥处理即得高纯。
13、度海参内脏皂 苷。 0014 本发明优选的， 步骤(2)， 所述的控温泡沫分离， 控温温度为4055， 鼓泡气体流 速12mL/min。 0015 最为优选的， 步骤(2)， 所述的控温泡沫分离， 控温温度为45， 鼓泡气体流速 1.5mL/min。 0016 本发明优选的， 步骤(2)中， 采用向浸膏中加入浸膏重量1015倍的水进行悬浮， 制得悬浮液。 0017 本发明优选的， 步骤(2)中， 所述的破沫方法为溶剂破沫法， 选择无水乙醇作为破 沫剂， 将无水乙醇经喷嘴喷入进行破沫。 0018 本发明优选的， 步骤(3)中， 所述海参皂苷破沫液稀释是采用向海参皂苷破沫液中 加入水进行稀释， 使。
14、其乙醇质量浓度为20-30， 直接通过管路泵至大孔树脂柱顶端， 作 为上柱液。 0019 本发明优选的， 步骤(3)中， 所述大孔树脂柱内填料为D101树脂， 上柱吸附方式为 动态吸附， 上柱液以1bv10bv/h的流速通入大孔树脂柱。 0020 本发明优选的， 大孔树脂柱内填料用量为每小时料液流量的1/201/10。 0021 本发明优选的， 步骤(3)中， 两步洗脱为饱和吸附后先用24倍柱体积、 与上柱液 同等浓度的乙醇溶液进行初步洗脱， 然后用46倍柱体积、 质量浓度6090的乙醇进 行再次洗脱。 0022 本发明优选的， 步骤(1)中， 所述的海参内脏为鲜品或冻干品， 冻干品使用前进行。
15、 化冻， 海参内脏优选刺参内脏， 烘干温度为6080， 粉碎至60-120目。 0023 本发明优选的， 步骤(1)中， 所述的乙醇的质量浓度为9296， 乙醇的加入量为 海参内脏粉末质量的48倍， 升温至7085进行提取23次。 0024 本发明的特点及优点： 0025 本发明利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法结合控温泡沫分离和树脂 富集来提取海参内脏皂苷， 得到的皂苷保存有完好的结构和有效地生物活性， 具有良好的 抗自由基氧化作用， 纯度高， 提取效率高。 升温至7085进行提取23次使细胞破碎充 说 明 书 2/6 页 4 CN 106038602 A 4 分、 强化胞内物质释放和。
16、扩散， 提取更彻底、 充分， 控温泡沫分离使悬浮液内的表面活性物 质聚集在气泡的表面上， 控温温度为4060， 鼓泡气体流速13mL/min， 使泡沫更加丰 富， 使海参皂苷更多的聚集在气泡的表面上， 使分离更彻底， 有效的保护了活性成分的生物 活性， 大大减少原料中海参多肽对皂苷纯度的影响， 两级分步纯化对海参内脏中皂苷实施 更进一步的精制， D101树脂吸附， 海参皂苷破沫液稀释后直接一步上样， 无需重新收集泡沫 进行配制上柱液， 大大缩短提取时间、 降低能耗的同时提高提取效率。 终产品海参内脏皂苷 含量可达到85以上， 适合开展工业化生产； 分离得到的皂苷保存有完好的结构和有效地 生物活。
17、性， 实验表明其具有良好的抗自由基氧化作用； 变废为宝， 减少海参加工过程中副产 品对环境的污染， 技术简单、 生产成本低， 产品具有极高的利用价值。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 0027 实施例1 0028 一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 具体步骤如下： 0029 (1)海参内脏鲜品100kg常温解冻后100目滤布沥去水分， 80烘干、 粉碎。 加入海 参内脏粉末质量4倍量质量浓度95的乙醇， 升温至60进行醇提， 时间为240min， 提取2 次； 合并提取液采用减压蒸馏回收乙醇后得海参皂苷浸膏； 0030 (2)浸膏加入浸膏重量10。
18、倍的水进行悬浮混匀， 制得悬浮液， 将获得的悬浮液用控 温型泡沫分离器进行分离， 温度为40， 鼓泡气体流速为1.5mL/min， 分离时间180min， 将无 水乙醇经喷嘴喷入进行破沫， 得到海参皂苷破沫液； 0031 (3)海参皂苷破沫液加入水稀释为含乙醇20的溶液， 通过管路泵入D101大孔树 脂柱床顶端， 先以6倍柱体积、 质量浓度20的乙醇冲洗大孔树脂柱去除盐分、 糖类、 色素等 杂质成分， 然后用4倍柱体积(BV)、 浓度90的乙醇将吸附在大孔树脂柱上的海参皂苷成分 洗脱下来， 收集洗脱液减压浓缩、 烘干， 得1.5kg类白色海参内脏皂苷产品， 经检测纯度为 90。 0032 实施。
19、例2 0033 一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 包括步骤如下： 0034 (1)海参内脏鲜品100kg常温解冻后100目滤布沥去水分， 80烘干、 粉碎； 加入海 参内脏粉末质量8倍量质量浓度95乙醇， 升温至85进行醇提， 时间为60min， 提取2次； 合 并提取液采用减压蒸馏回收乙醇后得海参皂苷浸膏； 0035 (2)浸膏加入浸膏重量10倍的水进行悬浮混匀， 制得悬浮液； 将获得的悬浮液用控 温型泡沫分离器进行分离， 温度为60， 鼓泡气体流速为1mL/min， 分离时间30min， 将无水 乙醇经喷嘴喷入进行破沫， 得到海参皂苷破沫液； 0036 (3)海参皂苷破沫液加。
20、入水稀释为含乙醇30的溶液， 通过管路泵入D101大孔树 脂柱床顶端， 以2倍柱体积、 质量浓度30的乙醇冲洗大孔树脂柱去除盐分、 糖类、 色素等杂 质成分， 最后用6倍柱体积(BV)、 浓度60的乙醇将吸附在大孔树脂柱上的海参皂苷成分洗 脱下来， 收集洗脱液减压浓缩、 烘干， 得1.1kg类白色海参内脏皂苷产品， 经检测纯度为 85。 0037 实施例3 说 明 书 3/6 页 5 CN 106038602 A 5 0038 一种利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 包括步骤如下： 0039 (1)海参内脏100kg常温解冻后100目滤布沥去水分， 80烘干、 粉碎； 加入海参内 脏粉。
21、末质量6倍量质量浓度95乙醇， 升温至70进行醇提， 时间为90min， 提取2次； 合并提 取液采用减压蒸馏回收乙醇后得海参皂苷浸膏； 0040 (2)浸膏加入浸膏重量10倍的水进行悬浮混匀， 制得悬浮液； 将获得的悬浮液用控 温型泡沫分离器进行分离， 温度为50， 鼓泡气体流速为2mL/min， 分离时间60min， 将无水 乙醇经喷嘴喷入进行破沫， 得到海参皂苷破沫液； 0041 (3)海参皂苷破沫液液加入水稀释为含乙醇25的溶液， 通过管路泵入D101大孔 树脂柱床顶端， 以3倍柱体积、 质量浓度25的乙醇冲洗大孔树脂柱去除盐分、 糖类、 色素等 杂质成分， 最后用5倍柱体积(BV)、。
22、 浓度80的乙醇将吸附在大孔树脂柱上的海参皂苷成分 洗脱下来， 收集洗脱液减压浓缩、 烘干， 得1.6kg类白色海参内脏皂苷产品， 经检测纯度为 88。 0042 实验例： 0043 按实施例1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 条件同实施例 1， 其不同之处在于： 0044 实验例1： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为10。 0045 实验例2： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为20。 0046 实验例3： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为30。 ； 0047 实验例4： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为70。 0048 实验例5： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为8。
23、0。 0049 实验例6： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为90。 0050 实验例7： 步骤(2)控温型泡沫分离， 温度为100 0051 将上述实验例1-实验例7、 及实施例1-3观察控温泡沫分离处理的泡沫量， 处理后 制得的海参内脏皂苷， 检测其提取效率， 作一张对比试验表， 对比结果如下表1所示。 0052 表1 0053 说 明 书 4/6 页 6 CN 106038602 A 6 0054 0055 通过上表1数据及效果对比可以看出， 本发明控温泡沫分离使悬浮液内的表面活 性物质聚集在气泡的表面上， 控温温度为4060， 鼓泡气体流速13mL/min， 使泡沫更加 丰富， 使海参。
24、皂苷更多的聚集在气泡的表面上， 使分离更彻底， 提取效率高， 而实验例1-实 验例7提取效率远远小于本发明的， 这是由于泡沫不多， 影响了海参皂苷的分离及纯化， 温 度过低， 泡沫稀少、 粗大， 海参皂苷不能很好的聚集在气泡的表面上， 聚集量少， 分离不彻 底， 导致提取效率过低， 温度过高， 泡沫高度低、 粗大， 很快消失， 海参皂苷聚集时间短， 分离 不充分， 提取效率低。 本发明的方法建立在其化学成分的基础上， 基于海参内脏皂苷与其他 皂苷在化学结构上不同， 设计出了醇提后， 结合控温泡沫分离和树脂富集， 大大提高了提取 效率。 0056 对比实验 0057 对比例1 0058 按实施例。
25、1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 条件同实施例 1， 其不同之处在于： 0059 大孔树脂柱内的填料为大孔树脂AB-8。 0060 对比例2 0061 按实施例1所述的利用海参内脏提取高纯度海参内脏皂苷的方法， 条件同实施例 1， 其不同之处在于： 0062 大孔树脂柱内的填料为大孔树脂ADS-7。 0063 将上述实验例1-实验例7、 实施例1-3及对比例1-2， 综合评断其提取效率， 产品纯 度及抗自由基氧化作用， 作一张对比试验表， 对比结果如下表2所示。 0064 自由基(O2-)清除率/的检测 0065 分别称取实验例1-实验例7、 实施例1-3及对比例1-2的产品。
26、加水配制成浓度 0.5mg/mL溶液； 0066 将以上配制好的0.5mg/mL各取2mL于具塞试管中， 每支试管中加入50mmol/L的 Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)2mL， 混匀并于25水浴中预热10min， 后加入10mmol/L的邻苯 三酚溶液0.4mL， 于25水浴中反应5min后， 加入12mol/L的HCl溶液0.2mL终止反应， 然后于 325nm处测定吸光度， 按现有常规方法计算清除率， 每组测定3次并取其平均值。 0067 表2 0068 编号提取效率纯度自由基(O2-)清除率/ 实施例1989038.60.6 实施例2938538.20.7 实施例395883。
27、8.60.8 实验例1357818.20.7 实验例2428118.50.6 说 明 书 5/6 页 7 CN 106038602 A 7 实验例3558218.10.3 实验例4567912.50.6 实验例5508110.50.8 实验例6488210.40.6 实验例732849.50.2 对比例1966537.50.6 对比例2966936.60.7 0069 通过上表2数据及效果对比可以看出， 实验例1-实验例7提取效率远远小于本发明 实施例1-3的， 对比例1、 对比例2的提取效率虽然和本发明实施例的相当， 但纯度远远小于 本发明的， 实验例1-实验例7随着温度的升高， 自由基(O2-)清除率也逐渐降低， 由于温度 的升高海参皂苷的结构和有效地生物活性得到破坏， 不能很好的发挥其作用， 综上， 本发明 醇提后结合控温泡沫分离和树脂富集来提取海参内脏皂苷， 使分离更彻底， 有效的保护了 活性成分的生物活性， 大大减少原料中海参多肽对皂苷纯度的影响， 得到的皂苷保存有完 好的结构和有效地生物活性， 具有良好的抗自由基氧化作用， 纯度高， 提取效率高， 一步上 样， 大大缩短提取时间、 降低能耗。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106038602 A 8 。