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1、(10)授权公告号 CN 102526721 B (45)授权公告日 2013.09.04 CN 102526721 B *CN102526721B* (21)申请号 201110355780.8 (22)申请日 2011.11.11 CCTCC NO: V201133 2011.10.21 CCTCC NO: C201198 2011.10.21 A61K 39/15(2006.01) C12N 7/00(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 中国水产科学研究院长江水产研 究所 地址 430223 湖北省武汉市东湖高。
2、新技术开 发区武大园一路 8 号 (72)发明人 徐进 曾令兵 范玉顶 周勇 肖艺 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 CN 1895667 A,2007.01.17,说明书第2页第 1-22 行和具体实施方式 . 曾令兵等 . 斑点叉尾鮰出血病病原呼肠孤病 毒的分离与鉴定 . 病毒学报 .2009, 第 25 卷 ( 第 6 期 ),460-466. 李振龙 （责任编辑） . 草鱼出血病 .中国水 产 .2010,( 第 11 期 ),56-57. 肖波 . 草鱼呼肠孤病毒及其免疫防治研究进 展 . 鲁东大学学报 ( 自然科学版 ) .2010, 第 26 。
3、卷 ( 第 1 期 ),48-53. (54) 发明名称 一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗及制备方 法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种斑点叉尾鮰出血病的灭活 疫苗及制备方法和应用， 其步骤 ： A、 CCK 细胞培 养 ； B、 CCRV-730 病毒培养与收获保存 ； C、 病毒液 滴度 TCID50测定， 此病毒滴度即为灭活疫苗的效 价。 D、 CCRV-730 病毒用 丙内酯灭活， 然后 37 孵育水解 丙内酯 ； E、 将灭活好的疫苗用鱼用生 理盐水稀释至一定效价， 得到可直接使用的斑点 叉尾鮰细胞培养灭活疫苗。本灭活疫苗是在预防 斑点叉尾鮰出血病中进行应用。本发明不仅灭活 效果。
4、好， 而且最大限度地避免了灭活剂对抗原蛋 白的破坏， 具有较好的免疫效果。此外， 消除了灭 活剂自身的毒性， 提高了疫苗的安全性。 本疫苗具 有免疫效果好、 使用安全、 生产成本低、 生产效率 高等优点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 左丽 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 102526721 B CN 102526721 B *CN102526721B* 1/1 页 2 1. 一种斑点叉尾鮰出血病灭活疫苗的制备方法， 其步骤是 ： A.CC。
5、K 细胞培养 ： 取液氮中保存的 CCK 细胞， 37温育 2 3 分钟融化， 加入含 10%V/ V 小牛血清的 MEM 培养液 ： 5ml/T25培养瓶， pH7 7.5， 转移至培养瓶中 25 30培养， 静 置 6 8 小时， 待细胞贴壁后换新鲜培养液， 在细胞培养 2 3 天， 铺满培养瓶底后， 采用 0.1% 0.5%W/V 的胰蛋白酶消化贴壁细胞， 进行传代培养 ； B.CCRV-730 病毒培养与收获 ： 待 CCK 传代细胞在瓶底铺满时， 去掉培养液， 然后按 1/5 的培养基体积加入感染的病毒悬液， 病毒的感染复数 MOI 为 1 5PFU/cell， 在病毒吸附细 胞 4。
6、0 60 分钟后， 补加含 2%V/V 小牛血清的 MEM ： pH7 7.5 维持液进行病毒增殖， 在病 毒感染 48 72 小时， 收获病毒， -80至室温冻融 3 次， 3000rpm， 4， 离心 10 分钟， 取上 清再 5000rpm， 4， 离心 30 分钟以去除游离的细胞碎片， 上清为纯化的 CCRV-730 病毒液， CCRV-730 病毒液置于 -80保存备用 ； C. 病毒滴度测定 ： 将待测病毒液进行 10 倍稀释 10-1 10-10， 在 96 孔板上感染 CCK 细 胞， 在病毒感染 48 72 小时， 按 Reed-Muench 法计算病毒滴度 TCID50， 。
7、病毒滴度即为灭活 疫苗的效价 ； D.CCRV-730 病毒的灭活 ： 取保存于 -80的 CCRV-730 纯化病毒液于 4融化， 按 0.025%V/V 的浓度加入保存于 -20的灭活剂 丙内酯， 混匀后放置于 4对病毒进行灭 活， 灭活 24h 后， 将灭活的病毒液置于 37水浴锅中孵育 2 小时以水解 丙内酯 ； E. 将灭活好的疫苗用鱼用生理盐水稀释至效价为 105TCID50/ml， 得到直接使用的斑点 叉尾鮰细胞培养灭活疫苗 ； 所述的 CCK 细胞为斑点叉尾鮰肾脏细胞系 （channel catfish kidney， CCK） CCTCC NO:C201198 ； 所述的斑点。
8、叉尾鮰呼肠孤病毒 CCRV-730 株， CCTCC NO:V201133。 2. 权利要求 1 所述的制备方法所制得的疫苗在制备治疗或预防斑点叉尾鮰出血病药 物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102526721 B 2 1/5 页 3 一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗及制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及水产养殖鱼用灭活疫苗领域， 具体涉及一种斑点叉尾鮰出血病的灭活 疫苗， 同时还涉及一种斑点叉尾鮰出血病灭活疫苗的制备方法， 还涉及一种斑点叉尾鮰出 血病灭活疫苗的用途。 背景技术 0002 斑点叉尾鮰(Channel catfish)于1984年从美国引进至我国养殖以来， 由于。
9、其营 养丰富、 肉质鲜美， 深受国内消费者的欢迎， 逐渐成为我国水产品出口的主要品种之一， 目 前已在全国 20 多个省市养殖。随着我国斑点叉尾鮰养殖规模的扩大， 集约化养殖程度的提 高， 疾病的危害也越来越大， 特别是近年来不少地区鱼种养殖场都发生了爆发性的出血病， 死亡率高达 90以上， 造成了重大的经济损失。通过病原学研究发现， 此病是由呼肠孤病 毒引起。对于其防治措施， 目前尚无有效药物， 疫苗免疫被公认为是最有效的预防措施。灭 活疫苗由于其安全性好， 目前已被广泛应用于水产养殖中。然而传统的灭活疫苗主要是采 用福尔马林灭活， 由于福尔马林对抗原成分有一定破坏作用， 因而用其制备的灭活。
10、免疫效 果较差且不稳定。 此外， 其灭活时间长， 福尔马林使用量大， 残留毒性不易去除等缺点， 限制 了其大规模生产与应用。 丙内酯是一种杂环类化合物 (C3H4O2)， 对病毒具有很强的灭活 作用， 其灭活机理为改变病毒基因组 RNA 的结构达到灭活目的。大剂量 丙内酯虽是一种 致癌物， 但极易水解， 水解后形成人体脂肪代谢产物 - 羟基丙酸， 对鱼体、 人体无害。由于 丙内酯只作用于病毒RNA， 对病毒蛋白无破坏作用， 保持了抗原蛋白的完整性， 所以丙 内酯灭活疫苗的免疫效果好。 0003 目前尚未见到斑点叉尾鮰出血病疫苗的相关报道， 本发明首次提供一种高效、 安 全、 可规模生产的斑点叉。
11、尾鮰出血病灭活疫苗及其制备方法。 发明内容 0004 本发明的目的是在于提供了一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗， 该疫苗含有完整 的病毒抗原蛋白， 不含灭活剂， 效价为 105TCID50/ml， 免疫效果好。 0005 本发明的另一个目的是在于提供了一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗的制备方 法， 该方法仅使用 0.025 (V/V) 的灭活剂 丙内酯于 4灭活 24 小时即可达到完全灭活 的目的。该方法简单快捷， 灭活彻底， 并且不破坏抗原蛋白的完整性。 0006 本发明还有一个目的是在于提供了一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗在制备治 疗或预防斑点叉尾鮰出血病药物中的应用。应用该疫苗对斑点叉尾鮰鱼。
12、种进行注射免疫 时， 其保护率达 89， 浸泡免疫的保护率达 72.6。 0007 为了实现上述的目的， 本发明采用以下技术措施 ： 0008 一种斑点叉尾鮰出血病灭活疫苗的制备方法， 其步骤是 ： 0009 A、 CCK细胞培养 ： 取液氮中保存的CCK细胞， 37温育23分钟融化， 加入含10 (V/V) 小牛血清的 MEM 培养液 (5ml/T25培养瓶， pH7 7.5)， 转移至培养瓶中 25 30培 说 明 书 CN 102526721 B 3 2/5 页 4 养。静置 6 8 小时， 待细胞贴壁后换新鲜培养液。在细胞培养 2 3 天， 铺满培养瓶底后， 采用 0.1 0.5 (W。
13、/V) 的胰蛋白酶消化贴壁细胞， 进行传代培养。所述的 MEM 培养液为 Sigma-aldrich 或 Gibco 或其它公司生产的 Eagle s MEM 细胞培养液。 0010 B、 CCRV-730 病毒培养与收获 ： 待 CCK 传代细胞在瓶底铺满时， 去掉培养液， 然后按 1/5的培养基体积加入感染的病毒悬液， 病毒的感染复数MOI(Multiplicity ofinfection) 为 1 5PFU/cell， 在病毒吸附细胞 40 60 分钟后， 补加含 2 (V/V) 小牛血清的 MEM(pH7 7.5) 维持液进行病毒增殖。在病毒感染 48 72 小时， 细胞病变效应达 8。
14、0 时， 收获病毒， -80至室温 (20-25， 以下相同 ) 冻融 3 次， 3000rpm， 4， 离心 10 分钟， 取 上清再 5000rpm， 4， 离心 30 分钟以去除游离的细胞碎片， 上清即为纯化的 CCRV-730 病毒 液。CCRV-730 病毒液置于 -80保存备用。所述的 MEM 培养液同步骤 A 一样。 0011 C、 病毒滴度测定 ： 将待测病毒液进行一系列 10 倍稀释 (10-1 10-10)， 按上述病毒 增殖方法在 96 孔板上感染 CCK 细胞。在病毒感染 48 72 小时， 观察细胞病变情况。按 Reed-Muench 法计算病毒滴度 TCID50。此。
15、病毒滴度即为灭活疫苗的效价。 0012 D、 CCRV-730 病毒的灭活 ： 取保存于 -80的 CCRV-730 纯化病毒液于 4融化， 按 0.025 (V/V) 的浓度加入保存于 -20的灭活剂 丙内酯 ( 又称 3- 羟基丙内酯， -Propiolactone， BPL)， 迅速混匀后放置于 4对病毒进行灭活。灭活 24h 后， 将灭活的 病毒液置于 37水浴锅中孵育 2 小时以水解 丙内酯。 0013 E、 将灭活好的疫苗用鱼用生理盐水 (0.65 ) 稀释至效价为 105TCID50/ml， 得到可 直接使用的斑点叉尾鮰细胞培养灭活疫苗。 0014 本发明所用的病毒株为斑点叉尾鮰。
16、呼肠孤病毒 CCRV-730 株， 已由中国典型培养 物保藏中心保藏， 保藏日期是2011年10月21日， 保藏编号是CCTCC NO ： V201133。 所述的灭 活疫苗含有斑点叉尾鮰肾脏细胞系 (channel catfish kidney， CCK)， CCTCC NO ： C201198。 0015 F、 灭活疫苗的安全性检验 ： 0016 灭活效果 ： 取上述制备好的疫苗， 按上述病毒增殖的方法接种 CCK 细胞， 同时设置 阴性对照， 观察56天， 若出现细胞病变效应， 则表明病毒灭活不完全 ； 若未见细胞病变效 应， 再盲传2次， 若盲传出现细胞病变， 则表明病毒灭活仍不完全，。
17、 若盲传2次均未出现细胞 病变， 则表明病毒灭活完全， 疫苗安全。 0017 无菌检验 ： 取上述制备好的疫苗， 接种肉汤蛋白胨细菌培养琼脂平板， 涂平板后于 37培养 15 天， 若有菌落生长， 则表明疫苗有细菌污染， 需用 0.22m 滤膜过滤除菌后使 用 ； 若无菌落生长， 则表明疫苗是无菌的。 0018 鱼体实验 ： 取上述制备好的疫苗， 注射健康斑点叉尾鮰 30 尾， 注射剂量为 0.2ml/ 尾， 同时注射鱼用生理盐水作为阴性对照。饲养 15 天， 若疫苗组出现死亡， 而阴性对照组未 出现死亡， 表明疫苗不安全 ； 若疫苗组和阴性对照组均未见死亡， 则表明疫苗安全。 0019 G、。
18、 灭活疫苗的最佳免疫剂量 ： 健康的斑点叉尾鮰鱼种 ( 体长 8 10cm) 于室内饲 养 10 天后， 分组每尾注射 0.2ml 不同稀释度的灭活疫苗， 同时用 MEM 细胞培养液注射另一 批鱼做阴性对照， 28饲养 10 12 天后， 随意从每组中取出一部分鱼采血做血清中和试 验， 测定免疫鱼与对照鱼的血清中和抗体水平 ； 将每组中的另一部分鱼以强毒攻击， 测定其 免疫保护率。 经试验测定， 每尾注射0.2ml效价为105TCID50/ml的丙内酯灭活疫苗， 其免 疫效果最好， 其中和抗体效价为 1 1024 ； 保护率高达 89。在较大规模的免疫保护效果 说 明 书 CN 1025267。
19、21 B 4 3/5 页 5 测定试验中， 用斑点叉尾鮰出血病细胞培养灭活疫苗(效价为105TCID50/ml)按每尾0.05ml 的剂量浸泡免疫 5 万尾斑点叉尾鮰鱼种 ( 规格 4 6cm， 另设对照组 1 万尾， 池塘水浸泡 )， 正常饲养 6 个月后， 免疫组成活率达到 83， 对照组成活率为 38， 相对免疫保护力达到 72.6。表明用 丙内酯灭活的细胞疫苗注射和浸泡途径对斑点叉尾鮰进行免疫， 均有很 强的保护保护力， 可以有效预防斑点叉尾鮰出血病。 0020 所述的一种斑点叉尾鮰出血病灭活疫苗有如下特性 ： 0021 1. 本疫苗对细胞、 鱼体不具感染力。 0022 2. 本疫苗含。
20、有 CCRV-730 病毒的全部蛋白。 0023 3. 本疫苗效价为 105TCID50/ml。 0024 4. 本疫苗无菌、 无灭活剂残留。 0025 5. 本疫苗为红色澄清液体， pH7 7.5。 0026 6. 本疫苗只对斑点叉尾鮰出血病有效。 0027 一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗在制备治疗或预防斑点叉尾鮰出血病药物中 的应用， 其步骤是 ： 0028 A. 浸泡免疫 ： 当年斑点叉尾鮰鱼种养至 4 6cm 时， 可进行浸泡免疫。将免疫鱼 置于 2 3的盐水中高渗脱水 2 3 分钟后， 然后浸浴在含量 104TCID50/ml 的斑点叉尾鮰 出血病灭活疫苗液中 10 分钟， 或用尼龙。
21、袋充氧浸泡 1 2 小时。然后将鱼种捞出放池塘饲 养。 0029 B. 注射免疫 ： 当年斑点叉尾鮰鱼种养至 8 10cm 时， 可进行注射免疫。采用腹腔 或者背鳍基部注射的方法给予。每尾注射 0.2ml 效价为 105TCID50/ml 的斑点叉尾鮰出血病 灭活疫苗后， 放池塘饲养。 条件允许的情况下， 可在首次免疫后间隔一个月进行加强免疫一 次， 免疫剂量不变， 可获得更高的保护率。 0030 本发明与传统灭活疫苗相比， 具有以下主要优点 ： 0031 1. 制备方法简单快捷、 操作方便， 适于规模化批量生产和应用。 0032 2. 疫苗抗原蛋白完整， 免疫原性好， 免疫保护力高。 003。
22、3 3. 疫苗灭活彻底， 且灭活剂分解完全， 不含有毒有害成分， 安全性高。 0034 4. 可进行浸泡和注射免疫。浸泡免疫的保护率达 72.6， 注射免疫保护率达 89。 0035 5. 具有商品化推广价值， 与免疫佐剂同时使用， 可进一步提供鱼体免疫保护率。 具体实施方式 0036 实施例 1 ： 0037 斑点叉尾鮰呼肠孤病毒 CCRV-730 的制备方法， 其步骤是 ： 0038 A.CCK细胞培养 ： 取液氮中保存的CCK细胞(本实验室建立， CCTCC C201198)， 37 温育 2 3 分钟融化， 加入含 10 (V/V) 小牛血清的 MEM 培养液 (5ml/T25培养瓶，。
23、 pH7 或 7.2 或 7.4 或 7.5)， 转移至培养瓶中 28培养。静置 6 或 7 或 8 小时， 待细胞贴壁后换新鲜 培养液。在细胞培养 2 或 3 天， 铺满培养瓶底后， 采用 0.1 0.5 (W/V) 的胰蛋白酶消 化贴壁细胞， 进行传代培养。所述的 MEM 培养液为 Sigma-aldrich 或 Gibco 或其它公司生 产的 Eagle s MEM 细胞培养液。 说 明 书 CN 102526721 B 5 4/5 页 6 0039 B.CCRV-730 病毒培养与收获 ： 待 CCK 传代细胞在瓶底铺满时， 去掉培养液， 然后按 1/5 的培养基体积加入感染的 CCR。
24、V-730 病毒悬液 ( 本实验室分离， CCTCCV201133)， 病毒的 感染复数 MOI(Multiplicity of infection) 为 1 5PFU/cell， 在病毒吸附细胞 40 或 45 或 50 或 55 或 60 分钟后， 补加含 2 (V/V) 小牛血清的 MEM(pH7 或 7.2 或 7.4 或 7.5) 维持 液进行病毒增殖。所述的培养基同上。 0040 C.CCRV-730 病毒的收获与纯化 ： 在病毒感染 48 或 56 或 64 或 72 小时， 细胞病变 效应达 80时， 收获病毒， -80至室温冻融 3 次， 3000rpm， 4， 离心 10 。
25、分钟， 取上清再 5000rpm， 4， 离心 30 分钟以去除游离的细胞碎片。上清即为纯化的 CCRV-730 病毒液。 CCRV-730 病毒液置于 -80保存备用。 0041 D.病毒滴度测定 ： 将待测病毒悬液进行一系列10倍稀释(10-110-10)， 按上述病 毒增殖方法在 96 孔板上感染 CCK 细胞。在病毒感染 48 或 56 或 64 或 72 小时， 观察细胞病 变情况。按 Reed-Muench 法计算病毒滴度 TCID50。此病毒滴度即为灭活疫苗的效价。本发 明所用的病毒株为斑点叉尾鮰呼肠孤病毒 CCRV-730 株， 已由中国典型培养物保藏中心保 藏， 保藏日期是 。
26、2011 年 10 月 21 日， 保藏编号是 CCTCC NO ： V201133。本发明所用的斑点叉 尾鮰肾脏细胞系(channel catfish kidney， CCK)为本实验室建立， 已由中国典型培养物保 藏中心保藏， 保藏日期是 2011 年 10 月 21 日， 保藏编号是 CCTCC NO ： C201198。 0042 实施例 2 ： 0043 斑点叉尾鮰出血病灭活疫苗的制备方法， 其步骤是 ： 0044 A.CCRV-730 病毒的灭活 ： 取保存于 -80的 CCRV-730 纯化病毒液于 4融化， 按 0.025 (V/V) 的浓度加入保存于 -20的灭活剂 丙内酯，。
27、 迅速混匀后放置于 4对病毒 进行灭活。灭活 24h 后， 将灭活的病毒液置于 37水浴锅中孵育 2 小时以水解 丙内酯。 0045 B.将灭活好的疫苗用鱼用生理盐水(0.65)稀释至效价为105TCID50/ml， 得到可 供直接使用的斑点叉尾鮰细胞培养 丙内酯灭活疫苗。 0046 C. 灭活疫苗的安全性检验 ： 0047 1) 灭活效果 ： 取上述制备好的疫苗， 按上述病毒增殖的方法接种 CCK 细胞， 同时设 置阴性对照， 观察56天， 若出现细胞病变效应， 则表明病毒灭活不完全 ； 若未见细胞病变 效应， 再盲传2次， 若盲传出现细胞病变， 则表明病毒灭活仍不完全， 若盲传2次均未出现。
28、细 胞病变， 则表明病毒灭活完全， 疫苗安全。 0048 2) 无菌检验 ： 取上述制备好的疫苗， 接种肉汤蛋白胨细菌培养琼脂平板， 涂平板 后于37培养15天， 若有菌落生长， 则表明疫苗有细菌污染， 需用0.22m滤膜过滤除菌后 使用 ； 若无菌落生长， 则表明疫苗是无菌的。 0049 3) 鱼体实验 ： 取上述制备好的疫苗， 注射健康斑点叉尾鮰 30 尾， 注射剂量为 0.2ml/尾， 同时注射鱼用生理盐水作为阴性对照。 饲养15天， 若疫苗组出现死亡， 而阴性对 照组未出现死亡， 表明疫苗不安全 ； 若疫苗组和阴性对照组均未见死亡， 则表明疫苗安全。 0050 实施例 3 ： 0051。
29、 斑点叉尾鮰出血病灭活疫苗的保护效果评估， 其具体步骤是 ： 0052 A.实验室小规模实验 ： 健康的斑点叉尾鮰鱼种(体长810cm)于室内饲养10天 后， 分组每尾注射0.2ml不同稀释度的灭活疫苗， 同时用MEM细胞培养液注射另一批鱼做阴 性对照， 28饲养 10 12 天后， 随意从每组中取出一部分鱼采血做血清中和试验， 测定免 说 明 书 CN 102526721 B 6 5/5 页 7 疫鱼与对照鱼的血清中和抗体水平 ； 将每组中的另一部分鱼以强毒攻击， 测定其免疫保护 率。经试验测定， 每尾注射 0.2ml 效价为 105TCID50/ml 的 丙内酯灭活疫苗， 其免疫效果 最好。
30、， 其中和抗体效价为 1 1024 ； 保护率高达 89。 0053 B. 大塘较大规模实验 ： 用斑点叉尾鮰出血病细胞培养灭活疫苗 ( 效价为 105TCID50/ml) 按每尾 0.05ml 的剂量浸泡免疫 5 万尾斑点叉尾鮰鱼种 ( 规格 4 6cm， 另设 对照组1万尾， 池塘水浸泡)， 正常饲养6个月后， 统计实验组与对照组实验鱼的成活率。 实 验结果显示， 免疫组成活率达到 83， 对照组成活率为 38， 相对免疫保护力达到 72.6。 0054 以上两实验结果表明， 用 丙内酯灭活的斑点叉尾鮰出血病细胞疫苗以注射和 浸泡途径对斑点叉尾鮰进行免疫， 均有很强的保护保护力， 可以有效。
31、预防斑点叉尾鮰出血 病。 0055 实施例 4 ： 0056 一种斑点叉尾鮰出血病的灭活疫苗在制备治疗或预防斑点叉尾鮰出血病药物中 的应用， 其步骤是 ： 0057 A. 浸泡免疫 ： 当年斑点叉尾鮰鱼种养至 4 6cm 时， 可进行浸泡免疫。将免疫鱼 置于 2 3的盐水中高渗脱水 2 3 分钟后， 然后浸浴在含量 104TCID50/ml 的斑点叉尾鮰 出血病灭活疫苗液中 10 分钟， 或用尼龙袋充氧浸泡 1 2 小时。然后将鱼种捞出放池塘饲 养。 0058 B. 注射免疫 ： 当年斑点叉尾鮰鱼种养至 8 10cm 时， 可进行注射免疫。采用腹腔 或者背鳍基部注射的方法给予。每尾注射 0.2ml 效价为 105TCID50/ml 的斑点叉尾鮰出血病 灭活疫苗后， 放池塘饲养。 条件允许的情况下， 可在首次免疫后间隔一个月进行加强免疫一 次， 免疫剂量不变， 可获得更高的保护率。 说 明 书 CN 102526721 B 7 。