《奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610298608.6 (22)申请日 2016.05.09 (71)申请人 徐祗栋 地址 276100 山东省郯城县郯西路99号7号 楼4单元302室 (72)发明人 徐祗栋 (51)Int.Cl. A61K 31/4439(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称 奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药 物的应用 (57)摘要 本发明提供了奥美拉唑用于制备自身。
2、免疫 性疾病治疗药物的应用。 本发明通过实验发现， 口服奥美拉唑对自身免疫性疾病、 尤其是自身免 疫性疾病导致的炎性损伤具有确切的缓解作用。 进一步实验表明， 奥美拉唑下调了EAN脾脏中 干扰素、 肿瘤坏死因子 、 白介素6和白介素17四 种促炎性细胞因子的mRNA水平， 同时上调了白介 素4和白介素10两种抗炎性细胞因子的mRNA水 平。 而且在脾单个核细胞培养上清液中， ELISA检 测的细胞因子表达谱也有相似的趋势。 正是基于 以上药理性质， 奥美拉唑起到自身免疫性疾病治 疗作用， 进而支撑其用于制备自身免疫性疾病治 疗药物的用途。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 10592。
3、0002 A 2016.09.07 CN 105920002 A 1.奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述药物下调体内干扰素含量。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述药物下调体内肿瘤坏死因子 含量。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述药物下调体内iNOS含量。 5.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述药物下调体内白介素6的信使RNA表达 量。 6.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述药物下调体内白介素17的信使RNA表达 量。 7.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述药物的剂型是口服剂。 8.根。
4、据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述自身免疫性疾病是自身免疫性神经炎。 9.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述自身免疫性疾病是由自身免疫性疾病 引起的炎症损伤。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105920002 A 2 奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 进一步涉及物质的新的医药用途， 具体涉及奥美拉唑 用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。 背景技术 0002 自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起 的疾病。 由于其成因在于自身免疫系统， 因此此类病症的治疗主要着眼于免疫系统的调节，。
5、 通常具有较长的疗程。 现有技术中依据自身免疫疾病病变位置的不同， 治疗方法的侧重点 也存在差异， 普遍来看， 自身免疫疾病的治疗目前主要依赖于免疫抑制剂， 最常用的是肾上 腺皮质激素类制剂， 如： 强的松、 氢化可的松、 地塞米松等， 大家往往将其简称 “激素” 。 如果 疗效不佳， 还可能用环磷酰胺、 氨甲喋呤等所谓细胞毒性药物， 这些药物在缓解自身免疫疾 病的同时， 也影响着免疫系统正常的抵御能力。 0003 奥美拉唑， 5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3， 5-二甲基-2-吡啶基)甲基亚磺酰基- 1H-苯并咪唑， 为质子泵抑制剂， 是一种脂溶性弱碱性药物。 现有技术研究发现， 奥美拉唑易。
6、 浓集于酸性环境中， 特异性地作用于胃黏膜壁细胞顶端膜构成的分泌性微管和胞质内的管 状泡上， 即胃壁细胞质子泵(H+， K+-ATP酶)所在部位， 并转化为亚磺酰胺的活性形式， 通过 二硫键与质子泵的巯基发生不可逆行的结合， 从而抑制H+， K+-ATP酶的活性， 阻断胃酸分泌 的最后步骤， 使壁细胞内的H+不能转运到胃腔中， 使胃液中的酸含量大为减少。 对基础胃酸 和刺激引起的胃酸分泌都有很强的抑制作用。 对组胺、 五肽胃泌素及刺激迷走神经引起的 胃酸分泌有明显的抑制作用， 对H2受体拮抗剂不能抑制的由二丁基环腺苷酸引起的胃酸分 泌也有强而持久的抑制作用。 0004 目前的医疗实践中， 奥美。
7、拉唑主要用于十二指肠溃疡和卓-艾综合征， 也可用于胃 溃疡和反流性食管炎； 静脉注射可用于消化性溃疡急性出血的治疗。 现有技术中未见奥美 拉唑在自身免疫性疾病中的应用。 发明内容 0005 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷， 提供奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治 疗药物的应用， 以解决现有技术中奥美拉唑用途范围较为局限的技术问题。 0006 本发明要解决的另一技术问题是自身免疫性疾病的治疗效果不佳。 0007 奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。 0008 作为优选， 所述药物下调体内干扰素含量。 0009 作为优选， 所述药物下调体内肿瘤坏死因子 含量。 0010 作为优选， 所述。
8、药物下调体内iNOS含量。 0011 作为优选， 所述药物下调体内白介素6的信使RNA表达量。 0012 作为优选， 所述药物下调体内白介素17的信使RNA表达量。 0013 作为优选， 所述药物的剂型是口服剂。 说 明 书 1/5 页 3 CN 105920002 A 3 0014 作为优选， 所述自身免疫性疾病是自身免疫性神经炎。 0015 作为优选， 所述自身免疫性疾病是由自身免疫性疾病引起的炎症损伤。 0016 本发明以经典的吉兰-巴雷综合征动物模型， 即实验性自身免疫性神经炎(EAN)作 为实验环境研究了奥美拉唑对自身免疫性疾病的治疗作用。 本发明发现奥美拉唑可下调促 炎性细胞因子-。
9、干扰素、 肿瘤坏死因子 、 白介素6及白介素17的信使RNA水平， 并上调抗炎 性细胞因子白介素4和10的信使RNA的水平， 从而改善EAN模型中的炎症损伤； 同时发现其在 哺乳动物中的主要作用器官在于脾脏及坐骨神经。 基于以上积极的发现， 本发明进一步确 定了利用奥美拉唑制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。 临床评分及组织病理学检查结果 显示， 奥美拉唑干预后实验动物坐骨神经炎症细胞浸润和脱髓鞘损伤得到明显缓解， 其抗 炎效果也改善了免疫器官环境并间接产生神经保护作用， 其疗效确切、 显著。 附图说明 0017 图1是本发明实施例中奥美拉唑对EAN症状、 组织学病理学特征以及炎症细胞浸润 的缓。
10、解作用实验结果图； 其中A部分是临床评分变化图； B部分是发病高峰期临床评分结果； C部分是首发症状出现时间； D部分是临床评估运动缺损曲线的AUC结果图； E部分是临床评 分高峰期实验动物坐骨神经横断面HE染色图； F部分是坐骨神经中炎症细胞浸润数目检测 结果图； G部分是临床评分高峰期实验动物坐骨神经横断面快蓝染色图； H部分是坐骨神经 组织评分结果图。 0018 图2是本发明实施例中奥美拉唑对淋巴细胞增殖情况和细胞因子表达量的影响 图； 图中A部分是淋巴细胞数量的化学发光检测结果图； B部分是TNF- 、 IL-6、 IFN-、 IL-1 、 IL-4以及IL-10六种细胞因子表达量检测。
11、结果图； CF部分分别是TNF- 、 IL-6、 IFN-、 IL-1 、 IL-4以及IL-10六种细胞因子mRNA表达水平检测结果图。 0019 在以上附图中， CMC标记表示对照组实验结果， DMF-P表示奥美拉唑预防组实验结 果， DMF-T表示奥美拉唑治疗组实验结果。 具体实施方式 0020 以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。 为了避免过多不必要的细节， 在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。 0021 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述， 表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。 因此， 用 “大约” 、“左右” 等语言所修正的数值。
12、不限于该准确 数值本身。 在一些实施例中，“大约” 表示允许其修正的数值在正负百分之十(10)的范围 内变化， 比如，“大约100” 表示的可以是90到110之间的任何数值。 此外， 在 “大约第一数值到 第二数值” 的表述中， 大约同时修正第一和第二数值两个数值。 在某些情况下， 近似性语言 可能与测量仪器的精度有关。 0022 除有定义外， 以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。 0023 1材料与方法 0024 1.1实验动物和分组 0025 本发明以18只6-8周龄的雄性Lewis大鼠(体重160-190g)作为实验对象。 所有大鼠 说 明 。
13、书 2/5 页 4 CN 105920002 A 4 均在温度合适及12小时昼夜循环的环境下饲养7天以适应环境， 期间大鼠均可自由获取食 物和水。 本发明将大鼠随机分为3组(预防组， 治疗组， 对照组， 每组n6)。 实验共重复3次， 结果类似。 0026 1.2EAN造模及临床功能评估 0027 本发明将含300微克的溶解后的P0180-199肽段(10mg/ml； Bio-Synthesis Corporation)的300微升乳化物注射于动物的双足垫进行造模。 首先将肽段溶解于磷酸盐 缓冲液中(2毫克每毫升)， 然后用含有结核菌素(strain H37RA)的同等体积的完全弗氏佐 剂(C。
14、FA； Difco)进行乳化， 肽段的终浓度为1毫克每毫升。 免疫后， 本发明对动物的临床症状 进行评分， 量化如下： 0分 正常； 1分 尾部变软； 2分 尾部无法抬起； 3分 体位不能自行纠 正； 4分 共济失调； 5分 后肢轻度麻痹； 6分 后肢中度麻痹； 7分 后肢重度麻痹； 8分 四肢轻 瘫； 9分 四肢重瘫； 10分 死亡。 0028 1.3奥美拉唑处理 0029 奥美拉唑(97纯度)溶于0.08的羧甲基纤维素/磷酸盐缓冲液中。 预防组于免 疫后第一天开始给药， 直到免疫后第16天(疾病高峰期)， 灌胃给药， 剂量为25毫克/公斤体 重/天。 治疗组给药的剂量与预防组相同， 是在出。
15、现症状后开始给药， 也就是从免疫后第7天 到第16天期间给药。 对照组灌胃给同样剂量的载体溶液(0.08的羧甲基纤维素/磷酸盐缓 冲液)。 0030 1.4组织病理学评估 0031 在发病高峰期(免疫后第16天)取坐骨神经。 每组6只大鼠全身麻醉后行心脏灌注， 首先用4摄氏度的磷酸盐缓冲液灌注2分钟， 然后用4的多聚甲醛灌注5分钟。 快速分离取 出坐骨神经置于4多聚甲醛中4摄氏度过夜， 然后石蜡包埋。 0032 石蜡包块切片(6微米)行HE(Solarbio Science&Technology)和快蓝染色以评估 单核细胞浸润及脱髓鞘情况。 利用尼康数字显微镜的图像分析技术对HE染色中浸润的炎。
16、症 细胞数进行计数。 随机取5个视野计算每平方毫米范围内的细胞数目(200倍的放大倍数)。 所有计数都采用的盲法计数。 平均结果表示为细胞数/平方毫米。 本发明用组织学评分来评 价脱髓鞘的严重程度。 每个血管旁的区域都由两名独立的观察者(对于实验分组并不知情) 依据如下半定量病理组织学标准进行评分： 0分， 血管周围区域无炎性细胞浸润和脱髓鞘； 1 分， 血管周围区域轻度的炎性细胞浸润； 2分， 血管周围区域存在炎性细胞浸润和脱髓鞘； 3 分， 整个切片视野均有炎性细胞浸润和脱髓鞘存在。 0033 1.5淋巴细胞增殖实验 0034 像之前描述的一样， 利用MTS进行抗原特异的淋巴细胞增殖实验。。
17、 简单来说， 无菌 取脾后收集脾单个核细胞。 将100微升的密度为2106个细胞/毫升的脾单个核细胞的单 细胞悬液接种于96孔板。 所用培养基为1640完全培养基(含2.05毫摩尔每升的谷氨酰胺， HyClone)， 1(v/v)HEPES溶液(Gibco)， 0.1(v/v) 巯基乙醇(Gibco)， 1(v/v)丙酮酸钠 (Gibco)， and 1(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)， and 10(v/v)胎牛血清(FBS； Gibco)。 刚 接种时即加入P0180-199肽段(10 g/ml； Bio-Synthesis Corporation)刺激细胞或不加。 肽 段的浓度是按。
18、照以往的报道来决定的。 在37， 5二氧化碳条件下孵育72小时后， 在每孔 加入20微升的MTS溶液(Promega)， 继续孵育4小时。 然后用酶标仪(Titertek)读取96孔板在 490nm处的吸光光度值。 因为已经体内给药， 所以本发明没有计算抑制率。 所有数据均表示 说 明 书 3/5 页 5 CN 105920002 A 5 为平均OD值标准误。 每组有4只大鼠进行试验， 重复3次。 0035 1.6ELISA检测细胞因子表达谱 0036 单个核细胞(2106个/ml)伴或不伴P0180-199肽段刺激， 在37和5CO2条件下 培养72小时后收集上清液。 按照说明书应用多因子E。
19、LISA检测试剂盒(QIAGEN)同时对6种细 胞因子包括白介素1 、 白介素4、 白介素6、 白介素10、 干扰素和肿瘤坏死因子 经行半定量 检测。 检测是重复进行的， 结果表示为平均OD值SEM(n4)。 0037 2实验结果 0038 2.1奥美拉唑处理组改善EAN的症状、 组织学改变和炎症细胞浸润 0039 奥美拉唑分为两种方式干预EAN(图1)。 在预防组中， 本发明在免疫后即胃管饲载 体或奥美拉唑(25mg/kg/天)。 治疗组中则是在免疫后第7天出现首发症状时开始给药。 与对 照组(CMC)相比， 应用临床症状评分的方式， 预防组和治疗组均减轻了EAN的症状。 预防组的 大鼠与对。
20、照组相比， 在免疫后第6天到第16天均有较好的临床评分(每个时间点， p0.05)。 另外， 治疗组临床症状的改善较预防组晚， 其在第8天开始临床评分低于对照组， 而在免疫 后第10天开始评分差异才有统计学意义(每个时间点， p0.05)。 此外预防组、 治疗组和对 照组三组发病高峰期的得分分别是5.200.30， 5.670.25和7.420.15(图1A和B)。 预防 组延迟了机体损伤后的首发症状(图1A和C)。 预防组首发症状出现在第7.830.17天， 治疗 组是第6.330.21天， 对照组是6.000.26天(图1C)。 奥美拉唑也减少了临床评估运动缺 损曲线的曲线下面积(图1D)。
21、。 总之， 奥美拉唑预防组和治疗组均改善了EAN。 0040 在EAN评分最高期(即免疫后第16天)， 本发明对大鼠的坐骨神经进行了组织病理 学评估。 应用HE染色评估炎症细胞浸润， 应用快蓝染色表示髓鞘脱失。 奥美拉唑干预的两组 均减少了坐骨神经中炎症细胞的浸润数目(图1E和F)。 奥美拉唑干预的两组中脱髓鞘和炎 症细胞浸润的发生率均较对照组低(图1G和H)。 应用半定量评分评估染色组织后， 对照组的 平均组织学评分(2.330.25)明显高于预防组(1.250.17， p0.05)和治疗组(1.33 0.25， p0.05)的评分。 0041 2.6奥美拉唑改善了淋巴细胞增殖活性反应， 改。
22、变了细胞因子表达谱 0042 在免疫16天后取EAN大鼠脾脏的单个核细胞体外培养72小时， 伴或不伴P0180-199 肽段(10 g/ml)刺激， 以评估奥美拉唑对淋巴细胞增殖活性反应的效果(图2A)。 应用MTS试 验发现， 在有P0肽段刺激时， 和对照组(0.910.08)相比， 预防组(0.580.02)和对照组 (0.540.05)的淋巴细胞增殖活性都较低。 没有P0肽段刺激时， 有同样的淋巴细胞增殖活 性模式， 但奥美拉唑干预组与对照组的差异并没有统计学意义。 0043 研究表明， 细胞因子的表达谱影响EAN的转归。 因此本发明应用多因子ELISA对伴 或不伴P0刺激的体外培养的E。
23、AN大鼠脾脏单个核细胞的细胞因子进行了半定量分析。 如图 2B所示， 奥美拉唑预防组和治疗组较对照组减少了单个核细胞的促炎细胞因子(白介素6、 干扰素、 白介素1 和肿瘤坏死因子 )的产生。 其中白介素6、 干扰素和肿瘤坏死因子 的 变化具有统计学差异(图2B， p0.05)， 白介素1 的水平在三组间的变化并无意义。 相反， 抗 炎性细胞因子白介素4和10的水平升高。 但只有白介素4的水平的变化具有统计学意义(图 2B， p0.05)； 而白介素10在各组内的水平差异性较大， 并没有统计学差异。 0044 本发明进一步通过脾脏的RT-PCR证实了奥美拉唑处理组单个核细胞中产生细胞 因子的差异。
24、。 像图2C-H所示， 奥美拉唑干预组的干扰素、 肿瘤坏死因子 、 白介素6和白介 说 明 书 4/5 页 6 CN 105920002 A 6 素17的mRN水平较对照组明显下降(图2C-F， p0.05)， 而白介素4和白介素10的水平则明显 升高(图2G和H， p0.05)。 0045 3实验结论 0046 本发明研究发现， 奥美拉唑下调了EAN脾脏中干扰素、 肿瘤坏死因子 、 白介素6 和白介素17四种促炎性细胞因子的mRNA水平， 同时上调了白介素4和白介素10两种抗炎性 细胞因子的mRNA水平。 而且在脾单个核细胞培养上清液中， ELISA检测的细胞因子表达谱也 有相似的趋势。 该。
25、性质足以支撑奥美拉唑对EAN炎症损伤的治疗作用。 0047 通过临床评分来评估神经症状， 本发明发现奥美拉唑可以明显改善EAN症状， 表现 为减轻瘫痪严重程度， 延迟首发症状的出现， 减低高峰期临床评分和减少临床评分的曲线 下面积。 肌电图研究表明奥美拉唑可以通过改善运动传导速度和复合肌动作电位波幅、 减 少末端运动潜伏期来保护EAN导致的外周神经损伤。 组织病理方面， EAN的特点是炎症细胞 浸润和神经脱髓鞘。 本项研究中， 奥美拉唑的预防组和治疗组较对照组均明显减少了浸润 的炎症细胞的积聚和退髓鞘的程度。 由此可见， 奥美拉唑对EAN动物具有确切的治疗作用。 0048 以上对本发明的实施例进行了详细说明， 但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。 凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、 等同替换和改进等， 均应 包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105920002 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 105920002 A 8 。