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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510225487.8 (22)申请日 2015.05.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105311647 A (43)申请公布日 2016.02.10 (73)专利权人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路800号 (72)发明人 戚中田 任浩 朱勇喆 徐庆强 赵平 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 赵青 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) 。
2、A61P 31/14(2006.01) (56)对比文件 WO 99/63095 A1,1999.12.09, CN 103361443 A,2013.10.23, Jia Guo et alSpinoculation Triggers Dynamic Actin and Cofilin Activity That Facilitates HIV-1 Infection of Transformed and Resting CD4 T Cells. JOURNAL OF VIROLOGY .2011,98249833. 徐庆强.乙型脑炎病毒入侵神经细胞的内吞 机制研究. 中国优秀硕士学位论文全。
3、文数据库 医药卫生科技辑 .2014,全文. 郭杨等.流行性乙型脑炎病毒及其研究进 展. 预防医学情报杂志 .2008,44-46. Ying Pei et alPentagalloylglucose downregulates cofilin1 and inhibits HSV-1 infection. Antiviral Research .2011,98- 108. 审查员 管冰 (54)发明名称 丝切蛋白在防治乙型脑炎病毒感染中的应 用 (57)摘要 本发明涉及生物医学技术领域， 是一种抗乙 型脑炎病毒(JEV)感染的新靶点及应用。 本发明 以人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)作为靶。
4、细胞， 采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达， 来寻找可有效抑制JEV感染人神经母细胞瘤细胞 (SK-N-SH)的宿主因子， 从而保护神经系统的功 能， 预防病毒感染中枢神经系统而引发炎症。 本 发明提供了丝切蛋白在防治乙型脑炎病毒感染 中的 应 用 ， 本发明通过实验发现丝 切蛋白 (Cofilin)在JEV感染SK-N-SH中发挥着重要的作 用， 下调Cofilin的表达， 能明显抑制JEV的感染。 本发明提供了Cofilin在制备预防或治疗乙型脑 炎病毒感染药物中的应用。 权利要求书1页 说明书10页 序列表5页 附图4页 CN 105311647 B 2018.11.30 CN 。
5、105311647 B 1.丝切蛋白在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用； 所述的药物是丝切蛋 白的干扰RNA， 所述的干扰RNA的序列选自以下任一： UGACAGGGAUCAAGCAUGAAU(SEQ ID NO:7)、 CUUCUAACCGCAAUAGUGACU(SEQ ID NO:8)、 GUUUAGUUCUGUGUAUAAAUG(SEQ ID NO:9)。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105311647 B 2 丝切蛋白在防治乙型脑炎病毒感染中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医学技术领域， 是一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点及应用。 背景技术 0002 乙。
6、型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus， JEV)， 属于黄 病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)， 为有包膜的单正链RNA病毒Gubler,D., G .Kuno ,and L .Markoff .Flaviviruses ,p.2007 .1153-1252.In D.M .Knipe and P.M.Howley(ed.),Fields virology,5th ed.,vol.1.Lippincott-Williams&Wilkins, Philadelphia,PA.。 JEV为流行性乙型脑炎的病原体， 主要以。
7、蚊虫为媒介进行传播， 感染后 能够引发脑炎或脑膜炎等严重的急性神经系统症状， 对人类健康威胁巨大。 乙型脑炎主要 流行于东亚、 东南亚以及大洋洲的部分地区， 目前主要的控制手段为疫苗预防以及蚊虫的 消除， 然而全球每年报告的乙型脑炎病例仍有35,000-50,000例， 死亡人数超过10,000例 M i s r a , U . K . a n d J . K a l i t a . O v e r v i e w : J a p a n e s e encephalitis.Prog.Neurobiol.2010.91:108-120.， 由于诊断和报告机制不完善， 实际的 感染和死亡病例要。
8、超过这些数字， 可见乙型脑炎仍然是危害公众健康的重大问题， 因而研 究JEV致病机理和预防手段， 寻找新的抗病毒策略， 已成为亟待解决的前沿课题。 0003 JEV感染具有嗜神经性， 易造成严重的中枢神经系统(CNS)疾病及其并发症， 这也 是导致乙型脑炎患者发展为重症甚至死亡的主要原因Denizot M,Neal JW,Gasque P.Encephalitis due to emerging viruses:CNS innate immunity and potential therapeutic targets.J Infect.2012.65(1):1-16.。 研究表明， JEV感染。
9、主要通过两种方 式引发神经细胞的凋亡： 直接细胞凋亡和间接细胞凋亡。 直接细胞凋亡是由于JEV直接在细 胞内的大量扩增和繁殖， 引起caspase等凋亡信号途径活化从而导致的细胞凋亡； 间接细胞 凋亡为JEV入侵后引发炎症反应， 激活一系列炎症相关信号转导通路和大量的炎症因子， 最 终导致细胞的凋亡Debapriya Ghosh ,AnirbanBasu .Japanese Encephalitis-A Pathological and Clinical Perspective.PLoSNegl Trop Dis.2009.3(9):e437.。 在 JEV感染导致的间接细胞凋亡中， JEV感。
10、染小胶质细胞(Microglia cells)能够引发IL-6， IL-8， TNF 等促炎细胞因子的释放， 导致白细胞迁移浸润脑部中枢神经系统， 加剧炎症反 应； 被JEV感染的星形胶质细胞也能产生干扰素诱导蛋白IP-10， 促进自然杀伤细胞以及单 核细胞迁移浸润脑部中枢神经系统， 促进炎症反应和神经细胞的凋亡Swarup V,Ghosh J, Das S,Basu A.Tumor necrosis factor receptor associated death domain mediated neuronal death contributes to the glial activati。
11、on and subsequent neuroinflammation inJapanese encephalitis.Neurochem Int.2008.52:1310-1321。 JEV侵入中枢神经系统后也能够感染神经干细胞(Neuronal progenitor cells， NPCs)， JEV 感染神经干细胞后不会引发NPCs的凋亡， 而是通过抑制细胞周期来影响NPCs的增殖和分 化， 这可能是导致婴幼儿感染后引发严重的后遗症的原因。 此外， JEV可穿过胎盘屏障感染 胎儿， 从而影响胎儿神经系统的正常发育Das S,Basu A.Japanese encephalitis vir。
12、us 说 明 书 1/10 页 3 CN 105311647 B 3 infects neural progenitor cells and decreases their proliferation .J Neurochem.2008.106:16241636.。 可见JEV最主要的危害在于感染中枢神经系统引发炎 症反应。 因此， 探明JEV感染中枢神经系统的机制并以此寻找新的抗病毒靶点， 对于保护防 治JEV所导致的中枢神经系统感染及炎症至关重要。 0004 为了有效地感染细胞， 病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其运输系统完成对宿主 细胞的入侵， 才能到达细胞特定区域内， 在细胞内进行复制并。
13、释放出有感染性的子代病毒 颗粒。 因此， 作为病毒感染宿主细胞的首要环节， 细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶 标。 研究表明， JEV可利用不同的宿主因子和感染途径来侵入靶细胞， 如JEV可通过其包膜蛋 白与热休克蛋白70相互作用来感染白纹伊蚊细胞(C6/36细胞)Chuang CK,Yang TH,Chen TH,Yang CF,Chen WJ.Heat shock cognate protein 70isoform D is required for clathrin-dependent endocytosis of Japanese encephalitis virus in C6/。
14、36cells.J Gen Virol.2015,96(Pt 4):793-803.以及人肝癌细胞(Huh7细胞)Zhu YZ,Cao MM,Wang WB,et al.Association of heat-shock protein 70with lipid rafts is required for Japanese encephalitis virus infection in Huh7cells.J Gen Virol.2012,93(Pt1): 61-71.。 JEV可借助网格蛋白依赖的内吞途径(clathrin-mediated endocytosis)感染非 洲绿猴肾细胞(Ve。
15、ro细胞)Nawa M ,Takasaki T ,Yamada K ,Kurane I ,Akatsuka T.Interference in Japanese encephalitis virus infection of Vero cells by a cationic amphiphilic drug,chlorpromazine.J Gen Virol.2003,84(Pt 7):1737-41.， 但感染神经细胞并不需要依赖网格蛋白Kalia M,Khasa R,Sharma M,Nain M,Vrati S.Japanese encephalitis virus infects n。
16、euronal cells through a clathrin- independent endocytic mechanism.J Virol,2013,87(1):148-62.。 目前在啮齿类动物 神经细胞感染实验表明JEV采用小窝(caveola)介导的内吞完成入侵Zhu YZ,Xu QQ,Wu DG,et al.Japanese encephalitis virus enters rat neuroblastoma cells via a pH- dependent,dynamin and caveola-mediated endocytosis pathway.J Virol.2。
17、012,86 (24):13407-22.， 但关于JEV感染人神经系统的具体途径及机制仍不清晰。 0005 病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子以及细胞骨 架系统， 这些宿主细胞转运分子在细胞的跨膜物质运输， 囊泡的形成、 内吞以及分泌中发挥 着重要的作用。 如网格蛋白(clathrin)主要负责受体介导的的内吞过程； Flotillin分子能 够与脂筏内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内； ADP核糖基化因子6分子参与调解细胞质膜 运输和胞内肌动蛋白装配； GTP酶激活蛋白分子GRAF1在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具 有重要的调节作用； epsin蛋白与huntingt。
18、in相关蛋白1(HIP1)都参与调节网格蛋白介导的 内吞囊泡的运输过程； diaphanous相关成蛋白(DIAPH1)调节了细胞骨架肌动蛋白的装配； 丝切蛋白(Cofilin)通过其磷酸化与去磷酸化作用调节了肌动蛋白丝的形成， 从而影响细 胞运动以及分子的运输等Doherty GJ,McMahon HT.Mechanisms of endocytosis.Annu Rev Biochem.2009,78:857-902.。 在这些分子中， 网格蛋白被证实分别参与了JEV感染的 过程， 而其它分子在JEV感染中的作用还未有报道。 0006 丝切蛋白(Cofilin)是存在于真核生物中的一种低分。
19、子量(21kD)的肌动蛋白结合 蛋白， 属于肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族(actin depolymerizing factor,ADF/ cofilin)。 它能够切断肌动蛋白丝并结合到肌动蛋白单体(G-actin)上， 从而加快体内肌动 说 明 书 2/10 页 4 CN 105311647 B 4 蛋白的转换率， 在重塑肌动蛋白骨架中发挥重要作用Barbara W.Bernstein and James R.Bamburg.ADF/Cofilin:a functional node in cellBiology.Trends in Cell Biology,2010,20(4):187。
20、-195.。 Cofilin通过对细胞骨架系统重塑， 调节了细胞的迁移以 及肿瘤细胞的侵袭与分化。 研究也发现， Cofilin参与了多种病原微生物对宿主细胞的感染 过程。 在HIV感染T细胞的过程中， 病毒包膜蛋白与受体CXCR4相互作用能够激活Cofilin， 从 而使病毒颗粒突破外层肌动蛋白的限制从而有效感染T细胞Yoder A1,Yu D,Dong L,et al.HIV envelope-CXCR4signaling activates cofilin to overcome cortical actin restriction in resting CD4T cells.Cell.。
21、2008,134(5):782-92.； 单纯疱疹病毒1型能 够通过EGFR-PI3K信号通路激活Cofilin， Cofilin的磷酸化与去磷酸化的双重作用介导了 病毒侵入到神经细胞中去Zheng K,Xiang Y,Wang X,et al.Epidermal growth factor receptor-PI3K signaling controls cofilin activity to facilitate herpes simplex virus 1entry into neuronal cells.MBio.2014Jan14； 5(1):e00958-13.。 可见 Cofil。
22、in蛋白在参与病毒感染与致病过程中的重要作用。 0007 目前还没有任何关于丝切蛋白分子在JEV感染中作用的报道， 对于该分子进行深 入研究不仅能够提升对JEV感染与致病机制的认识， 也可以为预防与治疗JEV感染提供新的 思路与靶点。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点。 0009 本发明的另一目的在于提供丝切蛋白(Cofilin)分子的新用途， 特别是在抗乙型 脑炎病毒感染中的应用。 0010 本发明的第三目的在于提供干扰Cofilin蛋白分子表达的siRNA。 0011 本发明的主要技术方案是： 0012 本发明， 以人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)。
23、作为靶细胞， 采用RNA干扰技术下调靶 细胞宿主蛋白的表达， 来寻找可有效抑制JEV感染人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)的宿主因 子， 从而保护中枢神经系统的功能。 本实验选择了一组参与或调节宿主细胞跨膜转运以及 细胞骨架重塑的分子来进行筛选， 这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输， 囊泡的内吞与分 泌以及对细胞骨架的调节过程中发挥着重要作用， 它们往往也是在病毒感染过程中易被病 毒 “劫持” 并利用的分子。 这些分子包括： ADP核糖基化因子6(ARF6)、 丝切蛋白(Cofilin)、 网 格蛋白重链(CLTC)、 epsin蛋白1(EPN1)、 diaphanous相关成蛋白(DIAPH。
24、1)、 epsin蛋白2 (EPN2)、 Flotillin蛋白1(FLOT1)、 Flotillin蛋白2(FLOT2)、 GTP酶激活蛋白(GRAF1)、 huntingtin相关蛋白1(HIP1R)。 通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列， 利用现有 的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析， 选择编码区作为siRNA设计的靶序列， 然后设计siRNA， 通过下调这些分子， 来观察对JEV感染的影响。 0013 我们发现丝切蛋白(Cofilin)在JEV感染SK-N-SH中发挥着重要的作用， 下调 Cofilin的表达， 能明显抑制JEV的感染。 0014 本发。
25、明的第一方面， 提供了丝切蛋白(Cofilin)作为一种抗乙型脑炎病毒感染的 新靶点。 0015 本发明的第二方面， 提供了丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒 说 明 书 3/10 页 5 CN 105311647 B 5 感染药物中的应用。 0016 进一步地， 本发明还提供丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎药物中 的应用。 0017 本发明所述的丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的 应用， 该药物具体是指能够抑制或下调Cofilin的表达量的试剂。 0018 所述的抑制下调Cofilin的表达量的试剂可以是siRNA、 sh。
26、RNA、 包含siRNA、 shRNA 的重组载体(如质粒)等。 0019 本发明的第三方面， 本发明提供了丝切蛋白(Cofilin)的干扰RNA在制备预防或治 疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用， 或丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎药 物中的应用， 所述的药物为干扰RNA(siRNA)， 其序列如下： 0020 UGACAGGGAUCAAGCAUGAAU(SEQ ID NO:7)、 0021 CUUCUAACCGCAAUAGUGACU(SEQ ID NO:8)、 0022 GUUUAGUUCUGUGUAUAAAUG(SEQ ID NO:9)。 0023 其中， 以如SEQ ID。
27、 NO:8所示的siRNA下调Cofilin的表达量效果最佳， 且降低乙型 脑炎病毒对SK-N-SH细胞的感染最为明显。 0024 本发明筛选到能够抑制乙型脑炎病毒感染SK-N-SH细胞的一个新的宿主细胞分子 Cofilin。 Cofilin基因下调以后， 不影响细胞正常的生理功能， 但明显抑制了乙型脑炎病毒 对SK-N-SH细胞的感染。 0025 因此本发明为临床预防和治疗因乙型脑炎病毒感染所导致的中枢神经系统炎症 提供了新的靶点和治疗方案。 附图说明 0026 图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测， 图中主坐标轴表示干扰效 率， 次坐标轴表示对细胞毒性的影响； 0027 CT。
28、RL： 不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)； 0028 NT： 转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)； 0029 siRNA： 转染针对各目的基因的siRNA的SK-N-SH细胞组(实验组)。 图2为免疫荧光 法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响， 其中A为下调各分子后对病毒感染性影响的免 疫荧光检测图， 荧光所示为JEV包膜蛋白阳性的细胞， B为下调各分子后对病毒感染的抑制 率图； 0030 CTRL： 不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)； 0031 NT： 转染non-targeting siRNA的SK。
29、-N-SH细胞组(阴性对照组)； 0032 siRNA： 转染针对各目的基因的siRNA的SK-N-SH细胞组(实验组)。 图3为Cofilin下 调后对JEV感染的影响， 其中A为Western Blot检测Cofilin蛋白的表达图， B为荧光定量PCR 法检测JEV病毒量图； 0033 CTRL： 不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)； 0034 NT-CTRL： 转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)； 0035 Cofilin： 转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:8)的SK-N-SH细胞组。 0036。
30、 图4为转染Cofilin分子的不同干扰序列后的干扰效率及对JEV感染性的影响图， A 说 明 书 4/10 页 6 CN 105311647 B 6 为Cofilin基因的mRNA水平检测图， B为JEV病毒量检测图； 0037 CTRL： 不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)； 0038 NT-CTRL： 转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)； 0039 Cofilin-7： 转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:7)的SK-N-SH细胞组； 0040 Cofilin-8： 转染针对Cofilin基因的siR。
31、NA(SEQ ID NO:8)的SK-N-SH细胞组； 0041 Cofilin-9： 转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:9)的SK-N-SH细胞组。 具体实施方式 0042 现结合实施例和附图， 对本发明作详细描述， 但本发明的实施不仅限于此。 0043 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。 下列实施例中未注明具 体条件的实验方法， 通常按照常规条件如Sambrook等人 分子克隆： 实验室指南 (New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件， 或按照常规条件， 或 按照制造厂商所。
32、建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 0044 实施例1： 0045 1设计、 合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。 0046 1.1针对各个目的基因， 检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列， 利用现有的 网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析， 选择编码区作为siRNA设计的靶序列。 参照siRNA设计原则， 并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比， 确 保无同源性； 排除antisense链的5 端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA； 排除任何 一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。 并利。
33、用设计软件进行预评估测定， 选择3 个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程， 每一基因共合成3条干扰序列， 见表1。 0047 1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。 0048 表1. siRNA靶点的设计 说 明 书 5/10 页 7 CN 105311647 B 7 0049 0050 0051 2 siRNA序列筛选与干扰效果鉴定 0052 2.1 RNA转染 0053 转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书 0054 1)提前12-16小时将SK-N-SH细胞(购自ATCC公司， 保藏号： ATCC HTB-11)铺在24孔 细胞培养板上培养，。
34、 使得转染时细胞密度为80-90。 0055 2)取2 LLipofectamine 2000加入50 Lopti-MEM中并轻柔混匀， 室温孵育5分钟； 另取5 L浓度为5 M的干扰RNA和50 Lopti-MEM混合。 孵育结束后， 将稀释的Lipofectamine 说 明 书 6/10 页 8 CN 105311647 B 8 2000转染试剂加入稀释的RNA中， 并轻柔吹吸混匀。 室温孵育20min后， 加入SK-N-SH细胞中， 补加400 Lopti-MEM， 使得RNA终浓度为50nM。 0056 3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。 0057 2.2实时荧光定量PC。
35、R(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平 0058 1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA， 具体步骤如下： 0059 转染48小时后， 去培养上清， 在细胞中加入1ml TRIzol， 充分混合室温裂解细胞3- 5分钟。 加入1/5体积的氯仿， 手动剧烈混合15秒。 于4、 12,000转离心15分钟。 取上层水相 并转移到新的EP管中， 加入等体积异丙醇， 充分混合， 室温沉淀10分钟。 于4、 12,000转离 心10分钟。 弃上清， 加入1ml预冷的75乙醇。 于4、 12,000离心5分钟。 充分弃上清， 室温晾 干RNA沉淀， 加入DEPC处理水溶解沉淀， 得到总R。
36、NA。 0060 2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA， 具体步骤如下： 0061 在PCR管中加入如下反应体系， 0062 5PrimeScript Buffer 2 L 0063 PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 L 0064 Random 6mers 0.5 L 0065 Total RNA 500ng 0066 Rnase Free dH2O up to 10 L 0067 轻柔混合混匀， 置于37反应15分钟， 然后置于85加热5秒钟灭活逆转录酶。 0068 3)荧光定量RT-PCR检测 0069 利用takara的SYBR Pr。
37、emix Ex Taq试剂盒进行反应， 反应体系如下， 0070 SYBR Premix Ex Taq 10 L 0071 Forward Primer 0.4 L 0072 Revers Primer 0.4 L 0073 DNA模板 2 L 0074 dH2O 7.2 L 0075 Total 20 L 0076 利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增， 95预变性2min， 进行40个PCR循 环， 955秒， 6030秒。 0077 3细胞毒性实验 0078 采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响， 具体步骤如下： 0079 收集对数生长期细胞， 以每孔。
38、5000个的密度接种于96孔板。 待细胞过夜贴壁后， 转 染各siRNA， 培养48小时后检测细胞增殖情况。 弃去原有培养基， 每孔加入含10 L CCK-8的 新鲜培养基110 L， 培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。 实验独立重 复3次， 计算平均值。 0080 4 JEV病毒感染SK-N-SH细胞 0081 4.1 SK-N-SH细胞的JEV病毒感染实验 0082 SK-N-SH细胞转染RNA后72小时， 进行JEV病毒感染实验。 将培养上清吸出， 用预温 PBS润洗2次， 以MOI0.5的病毒量接种JEV， 37孵育2h后弃去病毒液， 并用预温PBS润洗3 次，。
39、 加入新鲜培养基继续培养。 说 明 书 7/10 页 9 CN 105311647 B 9 0083 4.2免疫荧光染色检测JEV抗原表达 0084 SK-N-SH细胞感染病毒后继续培养48h， 采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达， 具 体步骤如下： 0085 1)细胞固定： 将96孔板中的培养液移去， 加入PBS清洗细胞2次， 每孔加入100 l预 冷甲醇， 于-20条件下固定20min， 用预冷的PBS清洗细胞3次。 0086 2)透膜： 固定后的细胞每孔加入100 l 0.1TritonX-100， 室温孵育15min， 用预 冷PBS洗涤3次。 0087 3)封闭： 每孔加入100 l 。
40、3BSA， 于室温下孵育1h。 0088 4)一抗孵育： 每孔加入JEV特异性鼠源单抗(1:500稀释)100 l， 室温孵育1h， 用预 冷的PBS洗涤3次。 0089 5)二抗孵育： 每孔加入AF 488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100 l， 室温避光孵 育1h， 用预冷的PBS避光洗涤2次。 0090 6)标记细胞核： 每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000， PBS稀释)， 室温避光孵育 15min， 用预冷的PBS避光洗涤3次。 0091 7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。 0092 4.3蛋白免疫印迹。 0093 (1)用蛋白裂解液分别提取。
41、对照组与Cofilin干扰组SK-N-SH细胞的总蛋白。 0094 (2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳， 并 截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。 0095 (3)蛋白的非特异性位点用5的脱脂牛奶封闭， 然后用Cofilin抗体封闭， 4过 夜， 用TBST缓冲液洗三遍， 洗去一抗。 0096 (4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时， 继而用TBST缓冲液洗三遍。 0097 (5)最后， 利用显色液显色并拍照分析. 0098 4.4RT-PCR检测细胞中JEV病毒量 0099 SK-N-SH细胞感染病毒后继续培养48h， 采用TRIzol提取对照组。
42、与干扰组细胞的总 RNA， 并逆转录获得cDNA， 通过RT-PCR检测JEV病毒量。 具体步骤同2.2所示。 0100 实验结果： 0101 1设计、 合成并筛选有效的siRNA 0102 针对各个目的基因序列， 我们设计了多个RNA干扰靶点序列， 并利用设计软件进行 预评估测定， 选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程， 每一基因共合成3条干扰 序列， 如表1所示。 0103 采用体外转染的方法， 将各个基因的干扰RNA转染到SK-N-SH细胞中去， 48h后通过 RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率， 最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列进行后续实 验， 其干扰效率如表2所示。
43、， 其中加粗数据表示为干扰效率最高， 其对应序列为抑制相应基 因表达的最佳siRNA序列。 0104 表2RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率 说 明 书 8/10 页 10 CN 105311647 B 10 0105 0106 注： CTRL： 不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组) 0107 NT： 转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组) 0108 siRNA： 转染针对各目的基因的siRNA的SK-N-SH细胞组(实验组)。 0109 2 siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测 0110 挑选出的针对各。
44、宿主分子的有效siRNA转染SK-N-SH细胞， 转染后48h通过RT-PCR 法检测各干扰RNA的干扰效率， 同时采用CCK8检测转染后对SK-N-SH细胞毒性的影响。 说 明 书 9/10 页 11 CN 105311647 B 11 0111 结果如图1所示， 转染有效siRNA组与CTRL组相比， 转染各siRNA后能够明显抑制相 应基因的表达水平(P0.01)。 转染Cofilin siRNA(SEQ ID NO:8)的抑制效率可达到 62.21。 0112 细胞毒性实验表明， 各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P0.05)， 对细 胞正常的生理功能未产生影响， 可用于后续。
45、实验。 0113 3 siRNA干扰后对JEV病毒感染的影响 0114 转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后， 感染相同剂量 的JEV病毒， 感染48h后， 采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响， 发现与 对照组相比， 转染CofilinsiRNA(SEQ ID NO:8)使Cofilin基因下调后， JEV包膜蛋白抗原阳 性的细胞数明显减少， 提示Cofilin基因的下调能够降低JEV对SK-N-SH细胞的感染(图2A)。 通过计算病毒量发现， Cofilin基因下调后对病毒的抑制率最高， 达到62.67， 而下调其余 宿主分子后， 对JEV感染的抑制。
46、率较低(图2B)。 0115 为明确Cofilin对JEV感染的抑制作用， 在转染Cofilin分子siRNA后， 通过免疫印 迹法检测Cofilin蛋白分子的表达， 并在感染JEV后通过RT-PCR检测JEV病毒量。 结果显示， 转染Cofilin分子siRNA(SEQ ID NO:8)后， 能够明显抑制Cofilin蛋白分子的表达(图3A)。 与对照组相比， Cofilin蛋白表达下调后， SK-N-SH细胞中的病毒量也显著下降(图3B)， 与免 疫荧光法检测结果相一致。 这些结果表明， 与对照细胞相比， 下调Cofilin基因后JEV对SK- N-SH细胞的感染能力明显下降， 病毒量减少。
47、。 0116 进一步， 分别转染三条Cofilin分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。 结果表明 不同的siRNA对Cofilin分子的下调效率不同(图4A)， 其中siRNA(SEQ ID NO:8)的干扰效率 最高， 与前面的结果相一致。 检测干扰后对JEV感染性的影响发现， CofilinsiRNA(SEQ ID NO:7)与CofilinsiRNA(SEQ ID NO:9)对Cofilin基因表达的抑制率分别为38与39(图 4A)， 对JEV感染的抑制率分别为46与45(图4B)； 随着CofilinsiRNA(SEQ ID NO:8)对 Cofilin基因表达抑制率增高至66(图4A)， 对JEV感染的抑制率也增高至70(图4B)， 这 些结果提示随着对Cofilin分子的下调效率的增高， 对JEV感染的抑制率也在升高， 表明 Cofili。