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1、10申请公布号CN104193823A43申请公布日20141210CN104193823A21申请号201410417957622申请日20140822C07K16/10200601A61K39/42200601A61P31/1420060171申请人兰州生物制品研究所有限责任公司地址730046甘肃省兰州市盐场路888号72发明人毛晓燕陈继军安晨乔玉玲马瑞74专利代理机构上海翰鸿律师事务所31246代理人李佳铭张文伯54发明名称一种抗狂犬病病毒特异性人源抗体及应用57摘要本发明的目的是提供一种抗狂犬病毒的中和性抗体，尤其是人源化或全人源单克隆抗体，以满足临床上诊断和/或治疗狂犬病的需要。本。
2、发明采用噬菌体抗体库技术，以接种过狂犬病疫苗的32份高效价的健康人外周血为原材料，制备噬菌体抗体库。该抗体库通过三轮筛选，获得7株ELISA阳性抗体。进一步通过RFFIT方法测定其中和活性，其中的R5、R7、R8、R9共四株具有较强的中和活性。本发明的具有高亲和力的人源化的抗狂犬病病毒抗体，可用于替代ERIG和HRIG，对于狂犬病毒严重暴露者进行主动和/或被动免疫治疗。51INTCL权利要求书2页说明书8页序列表8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页序列表8页10申请公布号CN104193823ACN104193823A1/2页21一种人源抗狂犬病病毒中和。
3、性抗体，其特征在于其重链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列为CDR1GGSMRRSNYY，CDR2IYYSGTT，CDR3ASESTVTAKLDN；其轻链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列选自下表14组中的一组CDR1CDR2CDR31LSNIGASYDANDQSYDSSLSAQV2SGSIASNYVQEDNQSYDSSNAV3SSNIGSNYRNNATWDDSLRGPV4SSNIGSNTVNRNHATWDDRLDGLL2如权利要求1的抗体，其特征在于所述的重链可变区的氨基酸序列选自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3所示的序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列选自SE。
4、QIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7所示的序列。3如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO1和SEQIDNO4所示。4如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO2和SEQIDNO5所示。5如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO3和SEQIDNO6所示。6如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO3和SEQIDNO7所示。7如权利要。
5、求16中任一项的抗体，其特征在于，其为单链抗体SCFV、FAB或全分子免疫球蛋白。8编码权利要求16中任一项的抗体的基因序列。9如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO8和SEQIDNO11所示。10如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO9和SEQIDNO12所示。11如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO10和SEQIDNO13所示。12如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷。
6、酸序列和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO10和SEQIDNO14所示。13如权利要求16中任一项的抗体在制备预防或治疗狂犬病的药物中的应用。权利要求书CN104193823A2/2页314如权利要求16中任一项的抗体的狂犬病毒检测试剂中的应用。权利要求书CN104193823A1/8页4一种抗狂犬病病毒特异性人源抗体及应用技术领域0001本发明涉及病毒性疾病的预防和治疗，尤其涉及狂犬病的预防和治疗。背景技术0002狂犬病是由狂犬病病毒RABIESVIRUS，RV引起的世界性人兽共患传染病，人和动物一旦发病死亡率高达100。世界卫生组织WHO最新数据指出，全球每年约有55000人死于狂。
7、犬病，主要集中在亚非拉发展中国家。WHO建议，对于严重暴露者应同时进行主动和被动免疫治疗，以获得快速的保护作用。目前，用于被动免疫治疗的制剂主要有马抗狂犬病病毒免疫球蛋白EQUINERABIESIMMUNEGLOBULIN，ERIG和人抗狂犬病病毒免疫球蛋白HUMANRABIESINLMUNEGLOBULIN，HRIG。然而，ERIG和HRIG的供应量有限、价格偏高，在狂犬病呈地方性流行的不发达地区应用难以普及，并且ERIG和HRIG也均存在可导致过敏反应及传播血液性疾病等缺点。0003应用单克隆抗体技术开发抗狂犬病病毒特异性的MCAB防治狂犬病可以克服多抗血清的诸多缺点，临床应用前景广阔。国。
8、外DIETZSCHOLDB等利用经HDRV免疫的志愿者外周血B淋巴细胞和鼠骨髓瘤SHMD33细胞融合形成的杂交瘤细胞J57DIETZSCHOLDB,JVIROL1990；6463087；相同方法制备杂交瘤JA、JBCHAMPIONJM,DIETZSCHOLDB,JIMMUNOLMETHODS2000；235128190。从杂交瘤J57、JA和JB中克隆扩增抗体的重链、轻链序列，插入到重组棒状病毒载体RHV，经表达得到的抗体称为SO57、SOJA、SOJBMORIMOTOK,DIETZSCHOLDB,JIMMUNOLMETHODS2001；25212199206。SO57、SOJA和SOJB被组。
9、合成第一种鸡尾酒疗法组合物，用于和HRIG比较，评价对狂犬病毒PEP的效果PROSNIAKM,DIETZSCHOLDB,JINFECTDIS2003；1885356。JONESD等进一步将SO57、SOJA和SOJB的重链可变区、轻链可变区克隆，插入到人IGG1表达载体，在人PERC6细胞中表达，得到的抗体称为CR57、CRJA、CRJBJONESD,ETALBIOTECHNOLPROG,2003；1911638。在对CR57、CRJA、CRJB三抗体组合中的评价中，研究者发现CRJA保护潜力弱，CR57、CRJB竞争性结合RV糖蛋白，并且发现存在对CR57和CRJB中和逃逸的病毒株。此后BA。
10、KKERAB等研究者构建了两个RV免疫噬菌体文库，从中筛选出一株具有高亲和力的，并且抗原表位与CR57不重叠的RV糖蛋白特异性抗体CR4098BAKKERAB,ETALJVIROL,2005；791490628。CR57和CR4098的组合称为CL184，是进行临床评价的第二种鸡尾酒疗法，目前由荷兰CRUCELL公司开发，在印度完成I期临床研究BAKKERAB,ETALVACCINE,2008,264759225927。0004尽管已有部分抗狂犬病病毒特异性的MCAB进入临床研究阶段的报道，但至今仍没有药物被批准上市。因此，本领域迫切需要开发具有高亲和力的完全人源化的抗狂犬病病毒抗体，用于替代。
11、ERIG和HRIG，已满足对于严重暴露者进行主动和被动免疫治疗的需要。发明内容说明书CN104193823A2/8页50005本发明的目的是提供一种抗狂犬病病毒的中和性抗体，尤其是人源化或全人源单克隆抗体，以满足临床上诊断和/或治疗狂犬病的需要。0006本发明的第一方面，提供了一种人源抗狂犬病病毒中和性抗体，该中和性抗体的重链可变区包含如下的互补决定区0007CDR1GGSMRRSNYY，0008CDR2IYYSGTT，0009CDR3ASESTVTAKLDN；0010该中和性抗体的轻链可变区，包含下表中14组中的互补决定区中的一组0011CDR1CDR2CDR31R8VLLSNIGASYDA。
12、NDQSYDSSLSAQV2R5VLSGSIASNYVQEDNQSYDSSNAV3R7VLSSNIGSNYRNNATWDDSLRGPV4R9VLSSNIGSNTVNRNHATWDDRLDGLL0012在优选的方案中，该中和性抗体的重链可变区氨基酸序列选自SEQIDNO1R8VH、SEQIDNO2R5VH、SEQIDNO3R7VH、R9VH相同所示的序列之一。0013在优选的方案中，所述的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQIDNO4R8VL、SEQIDNO5R5VL、SEQIDNO6R7VL、SEQIDNO7R9VL所示的序列之一。0014在更优选的方案中，该中和性抗体的重链可变区和轻链可变区分别。
13、具有如SEQIDNO1R8VH和SEQIDNO4R8VL所示的氨基酸序列。0015在更优选的方案中，该中和性抗体的重链可变区和轻链可变区分别具有如SEQIDNO2R5VH和SEQIDNO5R5VL所示的氨基酸序列。0016在更优选的方案中，该中和性抗体的重链可变区和轻链可变区分别具有如SEQIDNO3R7VH、R9VH相同和SEQIDNO6R7VL所示的氨基酸序列。0017在更优选的方案中，该中和性抗体的重链可变区和轻链可变区分别具有如SEQIDNO3R7VH、R9VH相同和SEQIDNO7R9VL所示的氨基酸序列。0018该人源抗狂犬病毒中和性抗体可以是有活性的抗体片段形式，例如单链抗体SC。
14、FV、FAB、FAB、FAB2等形式；也可以是全分子免疫球蛋白形式。0019本发明的第二方面，提供一种DNA分子，该DNA分子编码中和性抗体如序列SEQIDNO13所示的重链可变区和如序列SEQIDNO47所示的轻链可变区。0020在优选的方案中，该DNA分子编码中和性抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO8R8VH所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO11R8VL所示。0021在优选的方案中，该DNA分子编码中和性抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO9R5VH所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO12R5VL所示。0022在优选的方案中，该DNA分子编码中和。
15、性抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO10R7VH、R9VH相同所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO13R7VL说明书CN104193823A3/8页6所示。0023在优选的方案中，该DNA分子编码中和性抗体的重链可变区的核苷酸序列如如SEQIDNO10R7VH、R9VH相同所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO14R9VL所示。0024本发明的第三方面，提供了本发明的人源抗狂犬病病毒中和性抗体在制备预防或治疗狂犬病的药物中的应用。0025本发明的第四方面，提供了本发明的人源抗狂犬病病毒中和性抗体在狂犬病毒检测试剂中的应用。0026本发明采用噬菌体抗体库技术，以接。
16、种过狂犬病疫苗的32份高效价的健康人外周血为原材料，经淋巴细胞提取、总RNA提取、反转录CDNA、PCR获得重链和轻链可变区基因、并通过重叠延伸PCRSPLICINGOVERLAPEXTENSIONPCR，SOEPCR获得SCFV，SCFV与噬粒PS100酶切、连接，最后电转感受态ECOLITG1细胞，获得噬菌体抗体库。该抗体库通过三轮筛选，获得7株ELISA阳性抗体。进一步通过RFFIT方法测定其中和活性，其中的R5、R7、R8、R9共四株具有较强的中和活性。本发明的完全人源化的抗狂犬病病毒特异性的单克隆抗体，适合作为预防和治疗狂犬病的候选药物进一步开发。具体实施方式0027本文所用的术语“。
17、抗体”是能够通过至少一个抗原识别位点，和靶分子包括糖、多聚核酸、脂类、多肽等特异结合的免疫球蛋白。完整的抗体是有相同结构特征的约15000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链L和两个相同的重链H组成。每条轻链通过一个共价二硫键和重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区VH，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区VL，另一端有恒定区；轻链的恒定区和重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区和重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链的重链的可变区之间形成界面。0028本文所用的术语“单克隆抗体”是指包含参与选择性结合某。
18、一抗原氨基酸结构自然或者经改建的同一抗体群。单克隆抗体具有高度特异性，针对某一单一抗原位点。0029本文所用的术语“可变区”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区CDR或超变区中的三个片段中。可变区较保守的部分称为构架区FR。天然重链和轻链的可变区中各自包括四个FR区，它们大致上呈折叠构型，由形成连接环的三个CDR区相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成抗体的抗原结合部位参见KABAT等，NIH。
19、PUBLNO913242，卷，647669页1991。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。0030脊椎动物抗体免疫球蛋白的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类称为和中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白IGA，IGD，IGE，IGG和IGM，其中一些还可进一步说明书CN104193823A4/8页7分为亚类同类型，如IGG1，IGG2，IGG3，IGG4，IGA1和IGA2。对应于不同免疫球蛋白重链恒定区分别称为、。不同免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
20、。0031本文所用的“人源化抗体”是指小鼠或其他动物来源的抗体片段的人类抗体，“人源抗体”是指来源于人的抗体，目前制备人源化抗体或人源抗体主要有以下三种方法00321鼠源抗体改造用人类抗体的FC片段和部分FAB替换鼠源抗体片段，减少小鼠来源的抗体片段，以减轻人类对抗体的不良反应。00332转基因方法将人类抗体基因转移到小鼠或其他动物体内，用抗原免疫转基因动物，产生人类抗体。00343克隆展示技术CLONINGDISPLAY包括噬菌体展示PHAGEDISPLAY、细菌表面展示BACTERIALSURFACEDISPLAY、酵母展示YEASTDISPLAY、核糖体展示RIBOSOMEDISPLAY。
21、。简单的说，克隆展示技术首先构建包含人类重链可变区基因和轻链可变区基因的组合文库，通过细胞体系或非细胞体系核糖体展示表达该组合文库，再用特异性抗原筛选得到人类抗体。0035本发明采用噬菌体抗体库技术筛选抗狂犬病病毒的中和性抗体。噬菌体抗体库技术是本领域技术人员公知的，具体可参考SIEGELDLTRANSLATIONALAPPLICATIONSOFANTIBODYPHAGEDISPLAYJIMMUNOLRES，2008，4213118131；毛晓燕等人源天然SCFV噬菌体抗体库的构建及鉴定J中国生物工程杂志，2010，3051822；毛晓燕等从人源天然SCFV噬菌体抗体库中筛选A型肉毒毒素特异性。
22、抗体J中国免疫学杂志，2011，2712109310960036本发明的噬菌体抗体颗粒的中和活性采用快速荧光灶抑制试验RAPIDFLUORESCENTFACUSINHIBITIONTEST，RFFIT来测定。RFFIT测试方法是本领域技术人员公知的，具体可参考吕新军等狂犬病病毒中和抗体检测快速荧光灶抑制试验的建立J中国卫生检验杂志，2010，202439440，4580037本发明所用的材料和试剂ECOLITG1购自STRATGENE公司、MK1307辅助噬菌体购自INVITROGEN公司、PET26B载体购自NOVAGEN公司、噬粒PS100由本科室自行构建。灭活狂犬病毒3AG病毒为地鼠肾细。
23、胞培养，由兰州生物制品研究所有限责任公司保存；狂犬病病毒CVS11株、BSR细胞株来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。HRPANTIM13抗体购自GE公司，FIFT标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体购自北京康思尔泰医学科技发展中心。人抗狂犬病病毒免疫球蛋白标准品购自中国食品药品检定研究院，纯化马抗狂犬病毒血清和抗A型肉毒毒素噬菌体抗体颗粒来自兰州生物制品研究所有限责任公司。PCRPURICATIONKIT、切胶回收试剂盒均购自QIAGEN公司。基因测序委托华大基因进行。0038下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等人，分子克隆实验室手册NEWYOR。
24、KCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0039实施例一、抗狂犬病病毒SCFV噬菌体抗体库的构建与拯救0040抗狂犬病病毒SCFV噬菌体抗体库为本室自主构建，是以接种过狂犬病疫苗的32份高效价的健康人外周血为原材料，经淋巴细胞提取，总RNA提取，反转录CDNA，PCR获得重链和轻链可变区基因，并通过重叠延伸PCRSPLICINGOVERLAPEXTENSIONPCR，SOEPCR说明书CN104193823A5/8页8获得SCFV，SCFV与噬粒PS100酶切、连接，最后电转感受态ECOLITG1细胞，得到初级抗体库。。
25、经检测，初级抗体库的库容量约为90108。0041按初级抗体库容量50倍的比例分别接种H初级抗体库菌液、H初级抗体库菌液到2YTAG中，37220RPM培养到OD6000507；以MOI110120的比例加辅助噬菌体M13K07于上述培养物中，混匀，37感染30MIN后；离心,重悬细胞于2YTAK培养液中，30培养过夜，离心收集上清；用PEGNACL沉淀上清，即获得H、H噬菌体抗体工作库。经检测，H噬菌体工作抗体库滴度为221012；H噬菌体工作抗体库滴度为391012。0042实施例二、抗狂犬病病毒噬菌体抗体库的筛选0043使用常规方法制备灭活和纯化的狂犬病毒。经灭活、纯化后狂犬病毒蛋白含量。
26、300G/ML，用于噬菌体抗体颗粒的筛选。0044使用纯化的狂犬病毒包被免疫管，进行三轮筛选。三轮抗原包被浓度依次为30、10及5G/ML，洗涤次数依次为5、10、20轮。筛选获得的噬菌体颗粒重新感染ECOLITG1后涂布于2YTAG平板，挑取克隆使用2YTAG在96孔板培养过夜，加入MK1307辅助噬菌体感染后使用2YTAK培养过夜。取上清加入包被了2G/ML纯化狂犬病毒的ELISA板，使用辣根过氧化物酶标记的鼠抗M13抗体显色，OD450检测吸光度。0045通过三轮筛选，库富集了50倍，富集了6060倍，两库均得到明显富集，结果见表1。0046表1噬菌体抗体库三轮筛选结果00470048实。
27、施例三、ELISA分析筛选备选抗体单克隆0049从富集筛选后用于滴定噬菌体抗体的平板上挑克隆于100L的2YTAG中，同时挑取PS100空载体作为阴性对照，3个只加培养基作为空白对照，37培养过夜。转10L的培养物于新的含90L的2YTAG的96孔板中，37培养1H。每孔加入M13K07使培养液中的噬菌体滴度达到109CFU/ML，约25L，MOI为1020。37静置孵育30MIN。4000G离心10MIN，仔细弃上清，重悬细胞于100L的2YTAK中，30过夜培养。0050次日，4000G离心10MIN，用上清进行ELISA检测。用纯化的狂犬病毒包被96孔板，2G/ML，100L/孔，4包被。
28、过夜。用PBST洗3次。加入封闭液PBS4脱脂牛奶200L/孔，37，2H。弃封闭液，每孔加入100L的噬菌体抗体50L的噬菌体抗说明书CN104193823A6/8页9体50L的PBS4脱脂牛奶，37放置1H。用PBST洗5次。加入100L的15000稀释的HRPANTIM13，37，1H。用PBST洗5次，加入A、B底物显色，当出现明显的颜色梯度时，终止反应。OD450读值。0051经过筛选、测序及序列比对后，共得到确定为不同氨基酸序列的备选抗体7株。结果见表2。0052表2ELISA阳性克隆对应的主板号00530054实施例四、备选抗体噬菌体抗体颗粒的制备0055上述7个备选抗体克隆，经。
29、扩增后分别取适当体积加入50ML的2YTAG培养液中至OD6000102之间。37，220RPM培养，至OD6000507之间，一般培养1H15H。将菌液混匀后按125的比例加M13K07辅助噬菌体于上述培养物中，37静止感染30MIN。4000G离心10MIN，弃上清，重悬细胞于500ML的2YTA100G/MLK50G/ML培养基中，30，220RPM培养过夜。0056将过夜培养物取出，4，4000G离心20MIN，上清中加入1/5体积的20PEG25MNACL溶液，混匀，冰浴中静置1H。10000G离心20MIN，沉淀即为噬菌体抗体颗粒。用PBS1BSA，1/20的初始体积，悬浮沉淀，分。
30、装于EP管中。12000RPM离心5MIN，弃沉淀，上清分装EP管后4储存1周，也可70冻存。0057实施例五、RFFIT方法验证验证备选抗体中和活性005851病毒80感染剂量0059取另外1块96孔板作为稀释板，选择1行，每孔加入70LDMEM培养液，将CVS11病毒种子取出70L加入第1孔，连续进行12倍比稀释，共11个稀释度。将各稀释度的病毒上清分别取出50L加入96孔检测板上相应孔内。制备浓度1106CELL/ML的BSR细胞悬液，96孔检测板上相应孔内每孔加入50L，混匀，于37、5CO2孵箱培养24H。常规进行FAT检测。006052噬菌体抗体颗粒和病毒的稀释0061噬菌体抗体颗。
31、粒的稀释待测抗狂犬病病毒噬菌体抗体颗粒、阴性对照样品抗肉毒毒素噬菌体抗体颗粒、抗狂犬病病毒标准血清采用相同的稀释方法，取1块96孔板作为检测板，检测孔加入100LDMEM培养液；将50L噬菌体抗体颗粒加入第一孔100LDMEM培养液中，混匀，取出50L加入检测板上进行后续13倍比稀释，最后1孔弃去50L混合液。0062病毒对照的稀释连续6孔内每孔加入50LDMEM培养液，取50L病毒种子加入第1孔，混匀，取出50L进行后续12倍比稀释，最后1孔弃去50L混合液。006353噬菌体抗体颗粒和病毒的中和0064除病毒对照和细胞对照孔外，其余各孔均加入50L按照80感染量稀释好的病毒；病毒对照孔内分。
32、别加入50L12倍比稀释的病毒；轻拍96孔板边缘，使孔内液体混说明书CN104193823A7/8页10匀，置375CO2孵箱内孵育1H。006554加入BSR细胞检测剩余病毒0066中和作用后每孔加入50L制备好的BSR细胞悬液加1/400庆大霉素，轻拍96孔板边缘，使孔内液体混匀，置375CO2孵箱内孵育24H，未被抗狂犬病病毒噬菌体抗体颗粒中和的CVS11仍然可以感染BSR细胞，经过培养可以在FAT检测中以荧光斑的形式表现出来。006755RFFIT结果判定分析方法荧光抗体检测FAT0068将检测板从孵箱内取出，弃去培养液，每孔加100LPBS液洗1次。每孔加50L80冷丙酮，置于20冰。
33、箱，固定1530MIN为了使病毒被充分灭活，建议固定时间不低于此限制。将丙酮弃去，室温下干燥5MIN，将检测板密封塑料盒内，剩余步骤可以在BSL2实验室外操作。0069按照说明将FITC标记抗体RABIESDFAREAGENT用PBS液1150稀释，再按照11000比例加入伊文思蓝EVANSBLUESTABILISEDSOLUTION1，然后每孔加入50L上述混合液，置于湿盒内，37孵育1H。将上述混合液弃去，每孔加100LPBS液洗3次，第1次时加完PBS液即可倒掉，第2次时加完PBS液放置15S后倒掉，第3次时加完PBS液放置1MIN后倒掉。在滤纸上轻轻拍打，使孔内液体流净，注意不要用力拍。
34、打，以防细胞脱落。每孔加入50L，然后将孔内液体倒掉，在滤纸上轻轻拍打，仅使孔底余留少量封闭剂即可，在荧光显微镜下观察和记录结果。0070检测结果如表3所示，R5，R7，R8，R9抗体有中和活性。0071表3RFFIT验证噬菌体抗体颗粒的结果00720073实施例六、测序及序列分析0074将RFFIT结果显示有中和活性的单克隆进行测序鉴定，应用DNASTAR软件对测序序列进行分析，将正确序列于VBASE2抗体基因数据库中进行核对，确定其是否为功能序列并确定其所属基因家族。最后将核对后的DNA序列翻译成氨基酸序列，并于MEGALIGN中进行氨基酸序列比对，总结出不同克隆之间氨基酸序列的差异，尤其。
35、是其CDR区中的CDR3区序列的不同。0075对有中和活性的R5，R7，R8，R9号克隆进行测序，并将测序结果翻译为0076氨基酸序列，结果如下表所示0077表4、噬菌体抗体核苷酸、氨基酸序列0078克隆号核苷酸序列氨基酸序列R5VHSEQIDNO9SEQIDNO2说明书CN104193823A108/8页11R5VLSEQIDNO12SEQIDNO5R7VHSEQIDNO10SEQIDNO3R7VLSEQIDNO13SEQIDNO6R8VHSEQIDNO8SEQIDNO1R8VLSEQIDNO11SEQIDNO40079R9VHSEQIDNO10SEQIDNO3R9VLSEQIDNO14SE。
36、QIDNO70080用VBASE对其中的CDR区域进行分析，R5，R7，R8，R9号克隆重链、轻链的CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列汇总如下表0081表5、噬菌体抗体CDR区氨基酸序列0082CDR1CDR2CDR3R5VHGGSMRRSNYYIYYSGTTASESTVTAKLDNR7VHGGSMRRSNYYIYYSGTTASESTVTAKLDNR8VHGGSMRRSNYYIYYSGTTASESTVTAKLDNR9VHGGSMRRSNYYIYYSGTTASESTVTAKLDNR5VLSGSIASNYVQEDNQSYDSSNAVR7VLSSNIGSNYRNNATWDDSLRGPVR8VLL。
37、SNIGASYDANDQSYDSSLSAQVR9VLSSNIGSNTVNRNHATWDDRLDGLL0083对测序结果的氨基酸序列和CDR区特征序列的分析表明，R5、R7、R8、R9四株抗体密切相关，其重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3完全相同，其中R7/R9的重链可变区氨基酸序列相同，而R5、R8的重链可变区氨基酸序列与R7/R9相比，分别仅有3个氨基酸的差异。与之相对，R5、R7、R8、R9的轻链可变区氨基酸序列有较大差异。说明书CN104193823A111/8页1200010002序列表CN104193823A122/8页130003序列表CN104193823A133/8页140004序列表CN104193823A144/8页150005序列表CN104193823A155/8页160006序列表CN104193823A166/8页170007序列表CN104193823A177/8页180008序列表CN104193823A188/8页19序列表CN104193823A19。