抗CD138单克隆抗体可变区序列及其制备方法.pdf

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1、10申请公布号CN104059151A43申请公布日20140924CN104059151A21申请号201410035749X22申请日20140126201310034972820130130CNC07K16/30200601C12N15/13200601C12N15/63200601A61K39/395200601A61P35/0020060171申请人百奇生物科技（苏州）有限公司地址江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园C10楼申请人苏州大学博生吉医药科技（苏州）有限公司72发明人邹建炫杨林张明陈丹杨春花李静文李顺玲吴纯周延庆孙其玲汪伟74专利代理机构北京中誉威圣知识产权代理有限。

2、公司11279代理人张相午54发明名称抗CD138单克隆抗体可变区序列及其制备方法57摘要本发明提供了抗CD138单克隆抗体可变区序列的十六种核苷酸序列，以及抗CD138单克隆抗体可变区序列的制备方法，并进行测序；其可用于制备重组抗体、SCFV抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和单域抗体，可应用在制备抗体药物上，在肿瘤诊断、病情进展、转移潜能和预后的评价等方面具有很大的潜在价值；是生物医药领域中癌基因发展的一个重要进步，使行业领域内对癌的预测、诊断、治疗、预后的价值会得到更为全面的认识。66本国优先权数据51INTCL权利要求书2页说明书17页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12。

3、发明专利申请权利要求书2页说明书17页附图7页10申请公布号CN104059151ACN104059151A1/2页21抗CD138单克隆抗体可变区序列，其特征在于，包括十六种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为5916611VH,5916611VL,5916612VH,5916612VL,5820811VH,5820811VL,5820812VH,5820812VL,5820821VH,5820821VL,5820822VH,5820822VL,5916621VH,5916621VL,5916622VH,5916622VL。2根据权利要求1所述的抗CD138单克隆抗体可变区序列，其特征在于，所述。

4、的核苷酸序列5916611VH和5916611VL由保藏号为587CT11361的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5916612VH和5916612VL由保藏号为587CT11362的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820811VH和5820811VL由保藏号为480CT5431的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820812VH和5820812VL由保藏号为480CT5432的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820821VH和5820821VL由保藏号为480CT134321的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820822VH和5820822VL由保藏号为480CT134322的杂交瘤细胞制备，所。

5、述核苷酸序列5916621VH和5916621VL由保藏号为587CT73651的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5916622VH和5916622VL由保藏号为587CT73652的杂交瘤细胞制备。3根据权利要求2所述的抗C138单克隆抗体可变区序列，其特征在于，还包括与所述十六种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。4根据权利要求3所述的抗C138单克隆抗体可变区序列，其特征在于，还包括经一个或几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。5根据权利要求4所述的抗C138单克隆抗体可变区序列，其特征在于，所述核苷酸序列5916611VH、5。

6、916611VL、5916612VH、5916612VL、5820811VH、5820811VL、5820812VH、5820812VL、5820821VH、5820821VL、5820822VH、5820822VL、5916621VH、5916621VL、5916622VH和5916622VL可用于制备抗体。6根据权利要求5所述的抗CD138单克隆抗体可变区序列，其特征在于，所述抗体包括以下一种或几种重组抗体、SCFV抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和单域抗体。7一种抗体药物，其特征在于，包含权利要求6所述的抗体以及药学上可接受的载体。8一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1中所述。

7、的核苷酸序列5916611VH,5916611VL,5916612VH,5916612VL,5820811VH,5820811VL,5820812VH,5820812VL,5820821VH,5820821VL,5820822VH,5820822VL,5916621VH,5916621VL,5916622VH,5916622VL。9一种表达宿主，其特征在于，载有权利要求8所述的表达载体。10一种制备权利要求1所述的抗CD138单克隆抗体可变区序列的方法，其特征在于，包括以下几步（1）杂交瘤细胞的制备用骨髓瘤肿瘤细胞或CD138蛋白抗原分别免疫雌性健康的BALB/C小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳。

8、性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；（2）单克隆细胞的筛选将步骤（1）中的杂交瘤细胞在HAT培养基中培养，对ELISA检权利要求书CN104059151A2/2页3测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后筛选出ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存；（3）抗CD138单克隆抗体的制备先鉴定步骤（2）中制备的单克隆细胞的亚类亚型，再将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗CD138单克隆抗体。

9、；（4）抗CD138单克隆抗体可变区序列基因的克隆提取步骤（3）中所用的单克隆细胞的总RNA，获得MRNA,再以所述的MRNA为模板，反转录得到CDNA，最后克隆得到抗CD138单克隆抗体重链可变区和轻链可变区；（5）将步骤（4）中的可变区片段构建到载体中，进行测序鉴定。权利要求书CN104059151A1/17页4抗CD138单克隆抗体可变区序列及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物医药，尤其涉及一种抗CD138单克隆抗体可变区序列及其制备方法。背景技术0002CD138是一种蛋白聚糖，通过与肝素结合生长因子、可溶性基质成分等多种效应器相互作用来调节细胞行为。SYNDECANS家族有4个。

10、成员，分别为SYNDECAN1、2、3、4，其中对SYNDECANICD138的研究最为广泛。0003SYDECAN1CD138分子是跨膜粘结蛋白聚糖家族成员，由胞浆段、跨膜段和胞外段组成。CD138是一类非常复杂的大分子复合物，分子量约8592KD，由核心蛋白和未分枝的糖胺聚糖链共价结合形成的一类糖结合物，亦称蛋白聚糖，蛋白聚糖存在于所有哺乳动物中，是细胞间质、细胞质膜的重要组成成分。0004CD138分子属I型跨膜蛋白，有一个N端信号肽、一个含糖胺聚糖附着处的膜外区、一个疏水跨膜区和一个短的C端胞浆区组成。CD138的跨膜区和胞浆区是高度保守的，胞浆区肽链较短，由13个氨基酸组成，与跨膜区。

11、紧密相连。目前胞浆区部分的功能还不太清楚。0005跨膜蛋白聚糖CD138可表达在各种来源的肿瘤细胞表面，包括骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、何杰金氏病及与某些HIV有关的淋巴瘤。当正常细胞恶变后，细胞膜表面CD138分子的表达常发生改变，并且与肿瘤的恶性程度、预后有一定相关性。CD138是一种粘附分子，它在肿瘤细胞膜表面表达减少或者缺失，使细胞的生长、分化等行为发生紊乱，导致了瘤细胞大量繁殖，表现出极强的侵袭活性和转移特性。0006CD138与肿瘤的发生、发展有一定的相关性，并与肿瘤的分型、分化分期有一定关系，可根据癌组织中CD138表达程度来判断肿瘤分型，并采取相应治疗手段。由于CD138可促。

12、进细胞细胞，细胞基质之间的粘附，肿瘤细胞生长，侵袭和转移的特性，因此可用于肿瘤的免疫或基因治疗，其在肿瘤诊断、病情进展、转移潜能和预后的评价等方面具有很大的潜在价值。因此，随着分子生物学的不断发展，癌基因研究的不断深入，相信该基因对癌的预测、诊断、治疗、预后的价值会得到更为全面的认识。0007鼠源单抗在人体内可引起人抗鼠抗体反应。基因工程抗体技术的发展使得人们可以在基因水平上改造抗体，降低抗体的免疫原性，提高抗体特异性、稳定性和亲和力。对鼠源抗体进行人源化改造，可保留抗体可变区与人源抗体恒定区融合，提高抗体亲和力；或改造抗体结构，构建只保留抗体可变区的SCFV或含抗体可变区和部分恒定区的FAB。

13、，可提高抗体在体内的吸收百分比和半衰期。发明内容0008本发明解决了现有技术中的不足，提供抗CD138单克隆抗体可变区核苷酸序列，同时提供了制备上述核苷酸序列的方法。0009本发明的发明思路用CD138蛋白作为抗原，免疫小鼠后，检测得到相应抗体表达说明书CN104059151A2/17页5呈阳性的小鼠，取阳性小鼠脾脏，分离脾细胞后，融合脾细胞和骨髓瘤细胞，特定培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的MRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的CDNA，再用特异引物PCR获得相应抗体重链可变区和轻链可变区。0010本发明的技术方案为抗CD138单克隆抗体可。

14、变区序列，其特征在于，包括十六种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为5916611VH,5916611VL,5916612VH,5916612VL,5820811VH,5820811VL,5820812VH,5820812VL,5820821VH,5820821VL,5820822VH,5820822VL,5916621VH,5916621VL,5916622VH,5916622VL。0011本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述的核苷酸序列5916611VH和5916611VL由保藏号为587CT11361的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5916612VH和5916612VL由保藏号为587。

15、CT11362的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820811VH和5820811VL由保藏号为480CT5431的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820812VH和5820812VL由保藏号为480CT5432的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820821VH和5820821VL由保藏号为480CT134321的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5820822VH和5820822VL由保藏号为480CT134322的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5916621VH和5916621VL由保藏号为587CT73651的杂交瘤细胞制备，所述核苷酸序列5916622VH和5916622VL由保藏号为587。

16、CT73652的杂交瘤细胞制备。0012本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，还包括与所述十六种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。0013本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，还包括经一个或几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。0014本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述核苷酸序列5916611VH、5916611VL、5916612VH、5916612VL、5820811VH、5820811VL、5820812VH、5820812VL、5820821VH、5820821VL、5820822VH、5820822VL、5916。

17、621VH、5916621VL、5916622VH和5916622VL可用于制备抗体。0015本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，上述抗体包括以下一种或几种重组抗体、SCFV抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和单域抗体。0016本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种抗体药物，包含上述的抗体以及药学上可接受的载体。0017本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种表达载体，包含上述的核苷酸序列5916611VH,5916611VL,5916612VH,5916612VL,5820811VH,5820811VL,5820812VH,5820812VL,5820821VH,5820821。

18、VL,5820822VH,5820822VL,5916621VH,5916621VL,5916622VH,5916622VL。0018本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种表达宿主，载有权利要求8所述的表达载体。说明书CN104059151A3/17页60019一种制备上述的抗CD138单克隆抗体可变区序列的方法，包括以下几步0020（1）杂交瘤细胞的制备用骨髓瘤肿瘤细胞或CD138蛋白抗原分别免疫雌性健康的BALB/C小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；0021（2）单克隆细胞的筛选将步骤（1）中的杂交瘤细胞在H。

19、AT培养基中培养，对ELISA检测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后筛选出ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存；0022（3）抗CD138单克隆抗体的制备先鉴定步骤（2）中制备的单克隆细胞的亚类亚型，再将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗CD138单克隆抗体；0023（4）抗CD138单克隆抗体可变区序列基因的克隆提取步骤（3）中所用的单克隆细胞的总RNA，获得MRNA,再以所述的MRNA为模板，反转录得到CDNA，最后克隆。

20、得到抗CD138单克隆抗体重链可变区和轻链可变区；0024（5）将步骤（4）中的可变区片段构建到载体中，进行测序鉴定。0025本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果本发明提供了抗CD138单克隆抗体可变区序列的十六种核苷酸序列，以及抗CD138单克隆抗体可变区序列的制备方法，并进行测序；其可用于制备重组抗体、SCFV抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和单域抗体，可应用在制备抗体药物上，在肿瘤诊断、病情进展、转移潜能和预后的评价等方面具有很大的潜在价值；是生物医药领域中癌基因发展的一个重要进步，使行业领域内对癌的预测、诊断、治疗、预后的价值会得到更为全面的认识。附图说明0026图1。

21、为抗CD138单克隆抗体（480CT543）免疫印迹（WB）检测图。0027图2为抗CD138单克隆抗体（480CT13432）免疫印迹（WB）检测图。0028图3为抗CD138单克隆抗体（587CT7365）免疫印迹（WB）检测图。0029图4为抗CD138单克隆抗体（587CT1136）免疫印迹（WB）检测图。0030其中，图14中的14依次分别为抗体浓度8UG/ML,4UG/ML,2UG/ML,1UG/ML。0031图5为抗CD138单克隆抗体（克隆480CT543）IF检测图。0032图6为抗CD138单克隆抗体（克隆480CT13432）IF/FC检测图。0033图7为抗CD138单。

22、克隆抗体（克隆587CT7365）IF/FC检测图0034图8为480CT543克隆抗体可变区VH和VL的RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果图。0035其中泳道1为DL2000DNAMARKER；泳道2为VH基因；泳道3为VL基因；泳道4为RTPCR扩增VH基因阴性对照；泳道5为RTPCR扩增VL基因阴性对照。0036图9为480CT13432克隆抗体可变区VH和VL的RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果图。0037其中泳道1为DL2000DNAMARKER；泳道2为VH基因；泳道3为VL基因；泳道4为RTPCR扩增VH基因阴性对照；泳道5为RTPCR扩增VL基因阴性对照。说明书CN10。

23、4059151A4/17页70038图10为587CT7365克隆抗体可变区VH和VL的RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果图。0039其中泳道1为DL2000DNAMARKER；泳道2为VH基因；泳道3为VL基因；泳道4为RTPCR扩增VH基因阴性对照；泳道5为RTPCR扩增VL基因阴性对照。0040图11为587CT1136克隆抗体可变区VH和VL的RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果图。0041其中泳道1为DL2000DNAMARKER；泳道2为VH基因；泳道3为VL基因；泳道4为RTPCR扩增VH基因阴性对照；泳道5为RTPCR扩增VL基因阴性对照。0042图12是480CT543。

24、克隆抗体可变区VH和VL目的片段，构建到PMD18T载体上酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。0043其中泳道1为DL5000DNAMARKER；泳道2、3为PMD18T/VH的2个克隆；泳道4、5为PMD18T/VL的2个克隆。0044图13是480CT13432克隆抗体可变区VH和VL目的片段，构建到PMD18T载体上酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。0045其中泳道1为DL5000DNAMARKER；泳道2、3为PMD18T/VH的2个克隆；泳道4、5为PMD18T/VL的2个克隆。0046图14是587CT7365克隆抗体可变区VH和VL目的片段，构建到PMD18T载体上酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。004。

25、7其中泳道1为DL5000DNAMARKER；泳道2、3为PMD18T/VH的2个克隆；泳道4、5为PMD18T/VL的2个克隆。0048图15是587CT1136克隆抗体可变区VH和VL目的片段，构建到PMD18T载体上酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。0049其中泳道1为DL5000DNAMARKER；泳道2、3为PMD18T/VH的2个克隆；泳道4、5为PMD18T/VL的2个克隆。具体实施方式0050为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。0051实施例0052步骤一杂交瘤细胞的制备0053（1）动。

26、物免疫0054以骨髓瘤肿瘤细胞或CD138蛋白抗原分别免疫3只68周龄的雌性健康的BALB/C小鼠，双腿肌肉、双肩皮下、腹腔多点注射50100UG抗原/只，3次免疫后7天采血测血清中抗体效价，每周采血一次，选择血清14000稀释时的ELISA检测OD值大于10，同时血清WB检测阳性的BALB/C小鼠用于融合，融合前3天，不加佐剂的抗原腹腔加强免疫注射，60UG/只。0055（2）杂交瘤细胞制备0056（21）收集B淋巴细胞0057追加免疫后3天，小鼠摘眼球放血，离心后血清留作阳性对照。按无菌操作取出脾说明书CN104059151A5/17页8脏，并将脾脏放在10ML预温不完全培养基中，剥去周围。

27、结缔组织，置100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，边研磨边滴加不完全培养基冲洗。收集过滤后的细胞悬液于离心管中，离心，弃上清，用不完全培养基悬浮细胞，取1108个细胞，置室温待用。0058（22）小鼠骨髓瘤细胞的制备0059融合前10天，将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37度水浴中10MIN内至冷冻液完全溶解。离心，弃上清，置IMDM完全培养基中，37，5CO2培养。根据细胞生长状况，换液，细胞培养扩大。融合前23D，细胞应处于对数生长期。融合前将对数生长期小鼠骨髓瘤细胞收集到离心管中，计数，取21073107个细胞，离心弃上清，用不完全培养基悬浮细胞，置室温待用。0060（23）细胞融合。

28、0061融合前将50PEG置37，5CO2细胞培养箱中调整温度。将21073107个骨髓瘤细胞悬液和1108个脾脏B淋巴细胞悬液移至一个50ML离心管中，补加30ML不完全培养基，1500RPM，离心10MIN，弃去上清。轻轻弹击管底，使细胞团松散。一边均匀地转动离心管，另一手用1ML吸管吸取1ML预温的PEG融合剂，在离心管底部约2CM处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，PEG加样时间控制在60S，轻摇离心管30S，静置60S，然后立即加入20ML不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用，具体加法是第一MIN加1ML，第二MIN加4ML，随后的3MIN之内将剩余液体加完，置37水浴静置。

29、10MIN，1500转/分，离心10MIN，弃去上清，加入含有HAT的完全培养基，制成细胞悬液，铺到96孔细胞培养板上，置37，5CO2细胞培养箱中。0062步骤二筛选阳性单克隆杂交瘤细胞0063上述的细胞在HAT培养基中培养，未融合的骨髓瘤细胞和未融合的淋巴细胞逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。37，5CO2细胞培养箱中培养710天。用抗原包被酶标板，37包被2H，然后用2BSA封闭。吸取96孔板中生长克隆的细胞上清加到封闭好的酶标板中，37孵育1H。洗涤5遍后，加入HRP标记的羊抗鼠IGG，37孵育1H。洗涤后加入TMB显色液，然后加2M硫酸终止反应。在酶标仪上进。

30、行读数。将ELISA检测阳性的克隆挑入24孔细胞培养板培养，3天后进行ELISA复筛，将筛选出的ELISA阳性克隆进行WB复筛，WB阳性细胞进行亚克隆。经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆扩大培养后定株、冻存。0064步骤三抗CD138单克隆抗体的制备0065（1）单克隆抗体的生物学鉴定0066将定株的单克隆细胞的细胞上清用美国BD公司MOUSEMONOCLONALANTIBODYISOTYPINGKIT鉴定单抗的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，生产的腹水通过层析纯化后的得到抗体，采用WESTERNBLOT鉴定抗体的特异性，ELISA鉴。

31、定单抗的亲和力，具体操作如下0067（11）WESTERNBLOT检测抗体的特异性0068取已处理的细胞裂解液，在凝胶上进行垂直SDSPAGE，120V90MIN，电泳结束后，取下凝胶，置于PVDF膜上，将蛋白用半干法转染到PVDF膜上，10V，120MIN。将转印后的PVDF膜在5脱脂奶粉中室温封闭2H。将抗体溶解于3ML封闭液中，4过夜。用洗涤液洗涤3次，每次5MIN，用封闭液来稀释HRP标记的羊抗鼠IGG，室温下孵育2H。用洗涤液洗涤3次，说明书CN104059151A6/17页9化学发光试剂与PVDF膜共孵育，到暗室作X胶片曝光，通过显影和定影，将结果反映在胶片上。扫描胶片，分析结果，。

32、其结果参照图17所示。0069（12）单克隆抗体亲和常数测定0070用包被液将抗原稀释，分别加入酶标板，100微升/孔，372H，PBS洗涤5次，拍干，加2BSA封闭液200微升/孔，4度过夜，洗涤5次，拍干。将抗体从4UG/ML开始进行梯度稀释后加入到包被好的酶标板中，100微升/孔，371H，洗涤5次，拍干，加入HRP标记的羊抗小鼠IGG抗体，工作液100微升/孔，371H，洗涤5次，拍干。加入TMB显色液，37反应510MIN，加终止液50微升/孔，立即在酶标仪上以450NM波长测定OD值，按照公式计算出单克隆抗体亲和常数。0071步骤四抗CD138单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆0。

33、072所用细胞株为采用上述方法获得的能分泌高亲和力、高特异性的抗CD138或CD138抗体的杂交瘤细胞株，对应的保藏编号以及其分泌的抗体分子亚型如下表1所示0073表10074保藏编号抗体分子亚型587CT11361IGG1587CT11362IGG1480CT5431IGG1480CT5432IGG1480CT134321IGM480CT134322IGM587CT73651IGM587CT73652IGM0075取对数生长期的8个杂交瘤细胞2106，用QIAGEN公司的试剂盒RNEASYMINIKIT（货号QIAGEN74106）提取总RNA，取少量用NANODROP定量及1非变性琼脂糖凝。

34、胶电泳检测，随后用SUPERSCRIPTIIIFIRSTSTRANDSYNTHESISSYSTEMFORRTPCR试剂盒（货号INVITROGEN18080051）反转录CDNA，用特异引物扩增抗CD138抗体基因的轻链或重链可变区。将含有相应重链可变区或轻链可变区片段的PCR反应产物经1琼脂糖凝胶电泳，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒（捷瑞GK2042）纯化目的产物后，1琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的纯度。之后，将回收得到的相应重链可变区和轻链可变区克隆至测序载体PMD18T，并进行测序，对测序结果进行同源性和结构分析。0076具体操作步骤如下0077（1）RTPCR扩增CD138抗体轻链和。

35、重链可变区说明书CN104059151A7/17页100078引物设计0079根据8个克隆亚型的可变区的序列，分别在信号区和恒定区合成5和3端引物用于扩增CD138抗体重链可变区，引物序列如下0080VHF（5ACTAGTCGACATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT3），含有SAL酶切位点；0081VHR（5CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG3），含有HIND酶切位点。0082根据8个克隆亚型的可变区的序列，分别在信号区和恒定区合成5和3端引物用于扩增CD138抗体轻链可变区，引物序列如下0083LHF（5ACTAGTCGACATGAA。

36、GTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3），含有SAL酶切位点；0084LHR（5CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA3），含有HIND酶切位点。0085杂交瘤细胞总RNA提取0086用QIAGEN公司的试剂盒（货号74106）提取总RNA，具体步骤如下00871、收集对数生长期杂交瘤细胞各2106个，800RPM离心5MIN，去上清，沉淀即细胞可保存于80，或直接用于RNA提取。00882、每份细胞（2106）样品中加入350ULRTL溶液，涡旋30S。00893、向以上体系中加入70乙醇，用1ML移液枪轻轻吹打均匀。00904、将以上体系混合液转入RNEA。

37、SYSPINCOLUMN，8000XG离心15S，去滤液。00915、向以上RNEASYSPINCOLUMN中各加入700ULRW1溶液，8000XG离心15S，去滤液。00926、向以上RNEASYSPINCOLUMN中各加入500ULRPE溶液，8000XG离心15S，去滤液。00937、向以上RNEASYSPINCOLUMN中各加入500ULRPE溶液，8000XG离心2MIN，去滤液。00948、将RNEASYSPINCOLUMN转移到无RNA酶的2ML收集管中，全速离心1MIN。00959、将RNEASYSPINCOLUMN转移到无RNA酶的的15MLEP管中，加入3050UL无RN。

38、A酶的H2O，8000XG离心1MIN，洗脱RNA。0096反转录PCR0097用INVITRGEN的RTPCR第一链合成SUPERSCRIPTIII试剂盒（货号18080051），以杂交瘤细胞总RNA为模板，反转录CDNA，具体步骤如下00981、引物与模板变性0099按表2，配成10UL体系，65，5MIN，随后冰上放置1MIN，利于引物与RNA模板结合。0100表20101成分体积ULRNAX100NG说明书CN104059151A108/17页11引物OLIGODT201DNTP1无RNA酶H2O8X01022、复性0103按表3，配成10UL体系，加入引物与RNA模板变性的体系，50。

39、，50MIN；85，5MIN。0104表30105成分体积UL10RTBUFFER225MMMGCL2401MDTT2RNASEOUT1SUPERSCRIPTIIIRT101063、RNA消化0107向以上每个体系中加入1ULRNASEH,37,20MIN。0108抗体可变区特异引物PCR0109按表4和表5中的体系，以反转录得到的CDNA为模板，用特异引物合成抗体重链和轻链可变区。0110表40111成分体积ULH2O37410PFUBUFFERMG25DNTP10MM1PFU04TAQ02SENSEPRIMER20UM1说明书CN104059151A119/17页12ANTISENSEPR。

40、IMER20UM1CDNA40112表501130114步骤五PCR产物克隆和测序0115将PCR得到的重链可变区和轻链可变区核苷酸片段产物胶回收后，分别构建到测序载体上，并测序，具体步骤如下。01161、胶回收PCR产物0117PCR产物跑1琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收目的条带，用捷瑞胶回收试剂盒（货号GK2042）回收。步骤如下0118每100MG琼脂糖凝胶加入400ULBINDINGSOLUTIONB，60水浴锅中放置至凝胶块完全融化；0119将上述混合液转移至套有2ML收集管的GENCLEAN柱中，室温放置2MIN，6000RPM离心1MIN，去废液；0120加入500ULWASHSOL。

41、UTION,12000RPM，室温离心1MIN，去废液；0121重复上一步；0122将GENCLEAN柱放回收集管，12000RPM，室温离心1MIN；0123将GENCLEAN柱放至15MLEP管，加入3050ULELUTIONBUFFER，37放置2MIN，12000RPM，室温离心1MIN以洗脱目的片段。01242、酶切0125酶切体系（FERMENTASFASTDIGEST）如表67所示0126表60127成分体积UL说明书CN104059151A1210/17页13质粒X1UG10FDBUFFER5酶11酶21H2O43X01280129表70130成分体积UL抗体目的片段1710F。

42、DBUFFER2酶105酶2050131酶切条件37,30MIN；85,5MIN；胶回收质粒酶切体系中长片段，抗体目的片段酶切体系直接用于连接。01323、连接0133连接体系如表80134表80135成分体积UL载体胶回收大片段15抗体目的片段710LIGASEBUFFER1LIGASE050136连接条件16,4H。01374、转化0138向连接体系加入100ULDH5感受态细胞，冰浴30MIN；013942热击90S，冰浴3MIN；0140加入500ULLB培养基，37,120RPM，复苏50MIN；01414000RPM离心2MIN，去上清，留100UL上清重悬细胞沉淀，涂相应抗性LB。

43、平板。待说明书CN104059151A1311/17页14平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370培养1216小时可出现菌落。01425、菌落PCR鉴定0143挑每块转化板上单克隆46个，点到相应抗性LB平板后，做菌落PCR鉴定，PCR反应产物跑1琼脂糖凝胶检测有无目的长度片段。其检测结果如图811所示，菌落PCR体系如表910所示0144表90145成分体积H2O158UL10PFUBUFFERMG22ULDNTP10MM1ULTAQ02ULSENSEPRIMER20UM05ULANTISENSEPRIMER20UM05UL克隆1个0146表100147014801496、提质粒0150挑菌落P。

44、CR鉴定为阳性的单克隆摇菌，20甘油保菌后，用BIOMIGAPLASMIDMINIPREPKIT（货号为BIOMEGAPD121102）提质粒。具体步骤如下0151取4MLLB新鲜菌液，室温下1000RPM离心1MIN，收集菌体，尽可能吸去上清；0152加入250ULBUFFERA1（已加入RNASEA），涡旋震荡充分悬浮细菌；说明书CN104059151A1412/17页150153加入250ULBUFFERB1，轻轻反转10次以混合均匀，静置5MIN至溶液粘稠而澄清；0154加入350ULBUFFERN1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀；0155将离心管转至高速离心机，。

45、在室温下13000RPM离心10MIN（若上清中有白色沉淀，可再次离心）；0156小心吸取离心后的上清液至带有收集管的离心柱中（避免吸起沉淀），室温下13000RPM离心1MIN，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回收集管中；0157向DNA柱中加入500ULBUFFERKB，室温下离心1MIN，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回收集管中；0158向离心柱中加入500ULDNAWASHBUFFER（已加入无水乙醇），室温下，13000RPM离心1MIN，倒掉收集管中废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复此步骤一次；0159将离心柱放回高速离心机中，13000RPM室温下开盖离心510MIN，。

46、以彻底去除残留的乙醇；0160将离心柱转移至一个新的15ML离心管中，向DNA柱的正中间加入50UL60预热的ELUTIONBUFFER，室温放置2MIN，13000RPM离心1MIN，洗脱质粒DNA；01617、酶切鉴定0162将提取的质粒DNA用相应限制性内切酶酶切鉴定，体系如表11所示0163表110164成分体积UL质粒X500NG10FDBUFFER2酶105酶205H2O17X0165酶切条件37，30MIN；85，5MIN，跑1琼脂糖凝胶电泳鉴定是否有目的条带。01668、质粒PCR鉴定0167酶切鉴定阳性的质粒再PCR鉴定是否有目的条带，反应体系如表1213所示0168表12说。

47、明书CN104059151A1513/17页1601690170表1301710172PCR产物跑1琼脂糖凝胶电泳，其检测结果如图1215所示，若有阳性条带，则送测序。0173以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。0174序列表017559166（11）VH核苷酸序列为0176GAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGACTTCGGTTACTCATTCA。

48、CTAGTT说明书CN104059151A1614/17页17ATTACATGCACTGGGAGCAGCAGAGACATGGACCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTAACAACCAGAAATTCGAGGGCAAGGCCACATCGACTGTAGACAAATCTTCCCCAAACAGCCTGCAGTCACATCCACCAGTATTGCCTACATGGAACTCTGCATATTACTGTTCAAGTGGGATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCCTATTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACA。

49、GTCTCCTCA017759166（12）VH核苷酸序列为0178GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCTTTAGTGAAGATGTCCTGTGAGTCCAGTGGCATCACCTTTACCAGGTCCTGGGTGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGAAATTTTTCCTGGAAATAGTGATACTAGATATAACGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGGAGCCTGACACATGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAAAAATGCCTACTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA017958208（11）VH核苷酸序列为0180CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAGACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGG。