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1、(10)申请公布号 CN 102488113 A (43)申请公布日 2012.06.13 CN 102488113 A *CN102488113A* (21)申请号 201110419957.6 (22)申请日 2011.12.15 CGMCC No.4430 2010.12.08 A23K 1/18(2006.01) A23K 1/16(2006.01) (71)申请人 天津工业大学 地址 300160 天津市河东区成林道 63 号天 津工业大学纺织学院 (72)发明人 李政 王玉 张健飞 李绩 (54) 发明名称 一种微生物饲料添加剂 (57) 摘要 本发明公开了一种微生物饲料添加剂， 。
2、属于 饲料添加剂领域， 解决了含有多种活菌制剂的高 效微生物饲料添加剂产品及其生产方法和应用的 技术问题。涉及微生物饲料添加剂组成为 ： 黑曲 霉孢子浓度 10 9.0108个克、 绿色木霉孢子浓 度1.09.0108个/克、 枯草芽孢杆菌为1.0 9.0108个 / 克、 酿酒酵母 1.0 8.510 8个 / 克、 鼠李糖乳杆菌 1.3 8.5108个 / 克。本饲 料含有多种有益微生物目酶活力强， 经实验验证 本饲料对于奶牛产奶量及牛奶成分均有显著提高 作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1.一种微生物饲料添加剂， 其特征在于产品中黑曲霉孢子浓度1.09.0108个/克、 绿色木霉孢子浓度 1.0 9.0108个 / 克、 枯草芽孢杆菌为 1.0 9.0108个 / 克、 酿酒 酵母 1.0 8.5108个 / 克、 鼠李糖乳杆菌 1.3 8.5108个 / 克。 2. 根据权利要求 1 所述的生物活性饲料添加剂产品， 其特征在于所述黑曲霉孢子浓度 1.0 3.0108个 / 克、 绿色木霉孢子浓度 1.0 3.0108个 / 克、 枯草芽孢杆菌为 1.0 3.0108个 / 克、 酿酒酵母 1.0 3.5108。
4、个克、 鼠李糖乳杆菌 1.3 4.5108个 / 克。 3. 根据权利要求 1 所述的生物活饲料添加剂产品， 其特征在于所述黑曲霉孢子浓度 5108个 / 克、 绿色木霉孢子浓度 5.0108个克、 枯草芽孢杆菌为 5108个 / 克、 酿酒酵母 6108个 / 克、 鼠李糖乳杆菌 6108个 / 克。 4. 根据权利要求 1-3 所述的生物活性饲料添加剂产品， 其特征在于 ： 所述黑曲霉孢子、 绿色木霉孢子、 枯草芽孢杆菌、 酿酒酵母、 鼠李糖乳杆菌复配比例为黑曲霉孢子 15-25 份、 绿色木霉孢子 10-25 份、 枯草芽孢杆菌 10-25 份、 酿酒酵母 15-25 份和鼠李糖乳杆菌 。
5、25-40 份。 5. 根据权利要求 1-4 所述的生物活性饲料添加剂产品， 其特征在于 ： 所述黑曲霉孢子、 绿色木霉孢子、 枯草芽孢杆菌、 酿酒酵母、 鼠李糖乳杆菌复配比例为黑曲霉孢子 15-20 份、 绿色木霉孢子 10-20 份、 枯草芽孢杆菌 10-20 份、 酿酒酵母 15-20 份和鼠李糖乳杆菌 25-35 份。 6. 根据权利要求 1-5 所述的生物活性饲料添加剂产品， 其特征在于 ： 所述黑曲霉孢子、 绿色木霉孢子、 枯草芽孢杆菌、 酿酒酵母、 鼠李糖乳杆菌复配比例为黑曲霉 15 份、 绿色木霉 孢子 15 份、 枯草芽孢杆菌 15 份、 酿酒酵母 25 份、 鼠李糖乳杆菌 。
6、30 份。 7. 根据权利要求 1-6 所述的生物活性饲料添加剂产品， 其特征在于 ： 所述微生物菌剂 中黑曲霉为CGMCC No.3.5269、 枯草芽孢杆菌CGMCC No.1.210、 绿色木霉CGMCC No.3.2942、 酿酒酵母为 CGMCC No.4429、 鼠李糖乳杆菌为 CGMCC No.4430。 权 利 要 求 书 CN 102488113 A 2 1/5 页 3 一种微生物饲料添加剂 0001 技术领域 ： 本发明属于饲料添加剂领域， 特别涉及含有多种活菌制剂的高效微生 物饲料添加剂产品及其生产方法和应用。 0002 背景技术 ： 目前我国奶牛存栏数约1000多万头，。
7、 奶产量900多万吨， 奶牛养殖业的 迅速发展也促进和推动了我国饲料及添加剂行业的发展 ； 但我国奶牛饲料仍停留在三大料 ( 即玉米、 麸皮、 饼粕 ) 的简单混合上， 造成配方中蛋白质饲料单一、 氨基酸搭配不当， 奶的 产量和质量与欧美国家相比都有很大差距。研究开发高效生物活性饲料添加剂， 对于提高 我国奶牛生产的水平， 改善牛奶的质量， 减少奶牛胃肠疾病和乳房炎的发病率， 降低粪尿的 不良气味和粪尿氮的排除量， 减少环境污染和充分提高饲料资源的有效利用 ( 即提高廉价 粗饲料的利用率， 提高饲料中营养物质的利用率等 ) 具有重要的实际应用价值。目场上流 行的活菌制剂大多都是单一菌， 而且主。
8、要应用在单胃动物饲料中， 由于反刍动物 ( 如奶牛 ) 的产品目前只有美国和法国的 2-3 家的单一菌种制剂在我国宣传和做养殖推广实验。枯草 芽孢杆菌、 植物乳杆菌都是可以应用于饲料添加剂行业的益生菌， 益生菌代谢产生的各种 酶制剂及其有益代谢成分在促进消化、 稳定肠道菌群环境、 提高饲料利用率方面具有较好 的效果 ； 泡盛曲霉可以代谢产生包括葡聚糖酶在内的多种酶制剂， 其培养物作为饲料添加 剂可以有效提高饲料的消化吸收效果。研制开发具有科学配比， 且效果明显的的含有多种 有益微生物且酶活力强的复合饲料添加剂对于促进养殖业， 特别是奶牛养殖业具有非常重 要的意义。 发明内容 ： 0003 本发。
9、明解决的技术问题是提供一种高效生物活性饲料添加剂产品， 本发明解决的 另一技术问题是提供高效生物活性饲料添加剂产品生产方法及其应用。 0004 微生物饲料添加剂组成为 ： 0005 黑曲霉孢子浓度 1.0 9.0108个 / 克、 绿色木霉孢子浓度 1.0 9.0108个 / 克、 枯草芽孢杆菌为 1.0 9.0108个 / 克、 酿酒酵母 1.0 8.5108个 / 克、 鼠李糖乳杆 菌 1.3 8.5108个 / 克。 0006 本发明产品的具体生产方法步骤如下 ： 0007 1. 微生物菌剂的培养制备 ： 分别培并干燥得到黑曲霉孢子、 绿色木霉孢子、 枯草 芽孢杆菌、 酿酒酵母和鼠李糖乳。
10、杆菌。 0008 (1) 黑曲霉孢子制备 ： 斜面孢子悬浮液液接种到 10 Brix 麦芽汁固态培养基上， 30培养 2 天半至长满孢子， 低温流化床干燥， 粉碎干燥物。 0009 (2) 绿色木霉孢子制备 ： 斜面孢子悬浮液液接种到 10 Brix 麦芽汁固态培养基 上， 30培养 2 天半至长满孢子， 低温流化床干燥， 粉碎干燥物。 0010 (3) 枯草芽孢杆菌的制备 ： 斜面菌株经活化后， 接入液体种子培养基， 在 37、 180rpm 的摇床培养 24h 后接种至发酵罐中， 在 37、 通风比 1 1(v/v)， 400rpm 培养 2 天 至对数后期。发酵结束后， 加入助滤剂轻质碳。
11、酸钙， 经板框过滤， 流化床干燥。 0011 (4) 酿酒酵母的制备 ： 斜面菌种接入三角瓶， 培养至对数期后转接入发酵罐中， 控 说 明 书 CN 102488113 A 3 2/5 页 4 制温度为 28， 通风比为 1 1.5(v/v)， 培养 20 小时左右至对数期。发酵结束后， 加入助 滤剂轻质碳酸钙， 经板框过滤， 流化床干燥。 0012 (5) 鼠李糖乳杆菌的制备 ： 斜面菌种接入三角瓶， 培养至对数期后转接入发酵罐 中， 控制温度为 45， 通风比为 1 0.1(v/v)， 培养 18 小时左右至对数期。发酵完毕经板 框过滤分离获得湿菌体， 加入组成为 10脱脂奶、 5海藻糖、。
12、 5甘油的保护剂， 通过冷冻 干燥获得菌剂， 水分含量低于 10。 0013 2、 菌剂复配 ： 将上述各种菌按照比例进行复配， 菌剂复配比例如下 ： 黑曲霉孢子 15-25份、 绿色木霉孢子10-25份、 枯草芽孢杆菌10-25份、 酿酒酵母15-25份和鼠李糖乳杆 菌 25-40 份。 0014 本发明采用的菌种如下 ： 0015 黑曲霉 (Aspergillus niger)CGMC No.3.5269、 绿色木霉 (Trichoderma viride) CGMCC No.3.2942、 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)CGMCC No.1.210、 酿 。
13、酒 酵 母 (Saccharomyces cervisiac)CGMCC No.4429、 鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus) CGMCC No.4430。 0016 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.4429菌种同专利申请名称为一 株耐高渗酵母菌的应用中保藏菌种， 专利申请号 201110105966， 公开日为 2011.09.14。 0017 鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No.4430 菌株特点如下 ： 在显 微镜下观察， 该菌株为杆状， 宽度小于 1m， 2 到 3。
14、 个杆菌易于连成连接在一起 ； 在固体培 养基上， 该菌菌落为乳白色， 表面光滑， 湿润， 粘稠， 边缘较整齐。 与原始菌相比， 该诱变菌株 在形态上明显小于出发菌株。出发菌株鼠李糖乳杆菌 CGMCCNo.1.2134 购于中国微生物菌 种保藏理委员会普通微生物中心。本发明鼠李糖乳杆菌采用下述流程进行选育 ： 原始出发 菌种试管活化高温驯化硫酸二乙酯(DES)诱变高糖平板筛选亚硝基胍(NTG)诱 变筛选高温菌筛选摇瓶复筛传代稳定性实验 5L 发酵罐试验。将目的菌株 CGMCC No.4430 做 5L 乳酸发酵罐实验， 结果表明 ： 与出发菌株相比， CGMCC No.4430 葡萄糖耐受浓 。
15、度可以达到 270g/L， 与原始菌相比提高了 95 ； 发酵结束后， 乳酸含量为 60g/L， 与原始菌 相比提高了 158。 0018 鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No.4430 保藏单位是中国普通 微生物菌种保藏管理中心。地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研 究所， 邮编 100101。 0019 本发明中黑曲霉孢子、 绿色木霉孢子采用血球板计数法， 其它菌种采用微生物平 板计数方法检测活菌数。 0020 本发明中菌剂复配的较优比例为 ： 黑曲霉孢子 15-20 份、 绿色木霉孢子 10-20 份、 枯草芽。
16、孢杆菌 10-20 份、 酿酒酵母 15-20 份和鼠李糖乳杆菌 25-35 份。 0021 发明产品采用科学研究的菌剂复配比例技术有效确保产品中各种微生物菌剂的 合理组成和比例， 使得产品中微生物产生的酶在奶牛饲喂中可以有效促进饲料的消化吸 收 ； 复配技术使得产品在奶牛饲料的消化吸收率大幅提高， 单位用量饲料的产出比例比对 照有了显著提高， 奶牛的产量和质量得以提高和保障。 0022 发明产品的性能稳定， 使用安全， 与其它饲料添加剂均无配合禁忌。 本发明产品在 质量稳定可控， 无环境污染， 面目可以提免疫力能够提高养殖效益。 产品完全符合绿色饲料 说 明 书 CN 102488113 A。
17、 4 3/5 页 5 添加剂的要求。有明显提高目增重和饲料转化率效果。 0023 本发明产品中鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母对动物胃肠道的消化有辅助作用， 酿酒酵 母在瘤胃中为瘤胃微生物的生长繁殖提供了有益的氨在酸、 B 族维生素和其它微量元素， 增 加瘤胃微生物蛋质的合成量。鼠李糖乳杆菌在奶牛的小肠释放， 可以消耗动物肠道内的氧 气， 使肠道内有害的致病菌如好氧菌 ( 主要是大肠杆菌、 沙门氏菌等 ) 受到抑制， 还能抑制 氨和胺的合成， 益增强免疫力， 达到改善奶牛胃肠道微生物生态平衡， 有利于健康和提高生 产性能的目的 ； 枯草芽孢杆菌在肠道代谢产生的酶类和黑曲霉、 绿色木霉发酵培养物中含 有的。
18、有效剂量的纤维素酶、 葡聚糖酶、 木质素分解酶和淀粉酶有利于奶牛等反刍动物饲料 中纤维类饲料的消化吸收， 改善反刍动物肠道的微生态平衡， 提高饲料利用率， 提高奶牛产 奶量， 提高牛奶的品质， 提高奶牛肌体免疫力， 减少肠道疾病， 净化饲养环境。 该饲料添加剂 可应用于奶牛养殖业， 可以显著提高牛奶产量和质量。 0024 本发明产品能够提高奶牛肌体免疫力， 减少隐性乳房炎、 肠道疾病的发病率。目 前， 我国奶牛群中隐性乳房炎发病率是比较高的， 奶牛一旦患有乳房炎就必须注射抗生素 治疗， 注射了抗生素的奶牛 7 天之内所产出的牛奶都不能出售 ( 牛奶中会残留抗生素对人 体有危害)。 使用本发明产。
19、品可以降低奶牛隐性乳房炎发病率， 饲喂试验表明本发明产品降 低乳房炎发病率70(与对照组比较)， 明显减少奶牛乳房炎的发生， 减少抗生素的使用和 含抗生素奶的产出， 间接提高了养殖者的效益。 0025 本发明产品对提高我国奶牛生产的水平， 充分提高饲料资源的有效利用 ( 即提高 廉价相饲料的利用率， 提高饲料中营养物质的利用率等 ) 等方面都具有很高的价值。 0026 本发明也适合其他反刍动物如肉牛、 羊的饲喂。 具体实施方式 ： 0027 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明， 但不以任何方式限制 本发明。 0028 实施例 1 ： 高效活性饲料添加剂产品 0029 产品组成如。
20、下 ： 黑曲霉孢子浓度1.03.0108个/克、 绿色木霉孢子浓度1.0 3.0108个 / 克、 枯草芽孢杆菌为 1.0 3.0108个 / 克、 酿酒酵母 1.0 3.5108个 / 克、 鼠李糖乳杆菌 1.3 4.5108个 / 克。 0030 菌剂复配 ： 将上述各种菌剂按照如下比例进行复配 ： 0031 黑曲霉 15 份、 绿色本霉孢子 15 份、 枯草芽孢杆菌 15 份、 酿酒酵母 25 份、 鼠李糖乳 杆菌 30 份。 0032 实施例 2 ： 高效活性饲料添加剂产品 0033 产品组成如下 ： 黑曲霉孢子浓度 5108个 / 克、 绿色木霉孢子浓度 5.0108个 / 克、 枯。
21、草芽孢杆菌为 5108个 / 克、 酿酒酵母 6108个 / 克、 鼠李糖乳杆菌 6108个 / 克。 0034 菌剂复配 ： 将上述各种菌剂按照如下比例进行复配 ： 0035 黑曲霉 20 价、 绿色木霉孢子 10 份、 枯草芽孢杆菌 20 份、 酿酒酵母 18 份、 鼠李糖乳 杆菌 32 份。 0036 实施例 3 ： 例 1 和 2 中所述高效活性饲料添加剂产品生产方法 0037 产品生产方法主要包括微生物菌剂的生产和复配工艺。 说 明 书 CN 102488113 A 5 4/5 页 6 0038 微生物菌剂的生产 ： 0039 黑曲霉和绿色木霉孢子的制备方法 0040 1. 斜面培养。
22、方法 0041 斜面培养基10mL加入试管， 121， 20min灭菌后， 摆斜面， 冷却， 接种。 30培养到 黑色孢子铺满斜面。 0042 2.K 式培养瓶孢子 0043 取 10 Brix 麦芽汁加入 2琼脂， 装入 500mL K 式培养瓶， 121， 20min 灭菌后， 铺斜面冷却。接入孢子悬浮液 1mL， 保证悬浮液接种于整个培养基表面 ； 侧放入恒温箱， 30培养到黑色孢子铺满斜面。 0044 3. 固态放大培养 0045 将 K 式瓶孢子制成孢子悬浮液， 孢子浓度大于 1.0108个 /mL。取 200kg 固态培 养基 ( 麸皮 140kg、 10 Brix 麦芽汁 60L。
23、)， 充分混匀后放入浅盘， 在 121下灭菌 1 小时。 待放凉后， 接入孢子悬浮液， 搅拌均匀。培养温度控制在 30， 湿度 80-90， 每隔 10 小时 翻料一次， 培养时间 3 天 ； 待培养料长满孢子即可结束培养 0046 干燥粉碎 ： 发酵结束后， 将浅盘放在流化床干燥， 干燥温度控制在 60， 待物料水 分含量将低于 10以下时， 用粉碎机将固体培养料进行粉硫， 物料粉碎孔径在 100 目以上。 0047 枯草芽孢杆菌的制备方法 0048 培养基组成 (g/L) ： 葡萄糖 60， 酵母提取物 20， 磷酸氢二钾 0.5， 七水硫酸镁 0.5， pH6.8。 0049 (1) 一。
24、级种子培养 ： 500mL 摇瓶装液量为 100mL， 灭菌后接入一环枯草芽孢杆菌， 在 摇床上， 180 转 / 分， 培养温度 37， 培养时间 24 小时至对数期 ； 0050 (2)二级种子培养 ： 将一级种子按照10(v/v)的接种量接入30L的种子罐中， 装 液量 21L， 培养温度 37， 搅拌速度 200 转 / 分， 通风量 (V/V)1 0.5， 罐压 0.05Mpa， 培养 时间 24 小时至对数期。 0051 (3) 发酵罐培养 ： 将种子罐中的种子以 10 (v/v) 接种量接入 300L 发酵罐， 装液 量210L， 培养温度37， 搅拌速度200转分， 通风量(V。
25、/V)10.5.罐压0.05Mpa， 培养时间 24 小时， 培养结束菌浓度在 5.0109个 /mL。 0052 (4) 离心分离 ： 采用板框过滤分离获得菌体。 0053 (7) 真空冷冻干燥 ： 添加保护剂后采用喷雾干燥工艺处理获得干粉菌剂 ； 保护剂 组成为脱脂奶 10、 乳糖 5、 甘油 5。 0054 酿酒酵母菌的制备方法 ： 0055 从斜面转接酵母菌到液体摇瓶， 液体摇瓶经三级扩培后转接入发酵罐进行扩大培 养， 培养完毕低温浓缩、 载体混合， 流体床干燥工艺获得活性酵母菌剂。 0056 酵母细胞的培养 ： 采用斜面菌种逐级扩培获得酵母细胞 ； 0057 (1)一级种子培养 ： 。
26、将酵母斜面菌种接入500mL摇瓶中， 培养基装量100mL， 旋转式 摇床 120 转分， 培养温度 30， 培养时间 18 小时 ； 0058 (2)二级种子培养 ： 将一级种子按照10的接种量接入500mL二级种子摇瓶中， 培 养条件与一级种子相同 ； 0059 (3) 三级种子培养 ： 将二级种子以 10接种量接入 5000mL 三级种子摇瓶中， 培养 说 明 书 CN 102488113 A 6 5/5 页 7 基装量 1000mL， 旋转式摇床 100 转分， 培养温度 30， 培养时间 18 小时 ； 0060 (4)一级种子罐培养 ： 将三级种子以5接种量接入总容积为150L的一。
27、级种子罐， 发酵培养基装量 100L， 培养温度 30， 搅拌速度 100 转 / 分， 通风量 (V/V)1 0.5， 罐压 0.05Mpa， 培养时间 16 小时 ； 0061 (5)发酵罐培养 ： 将一级种子罐菌种以5接种量(v/v)接入总容积为3吨二级种 子罐， 发酵培养基装量 2 吨， 培养条件培养温度 30， 搅拌速度 100 转 / 分， 前期通风量 (V/ V )1 05， 罐压 0.05Mpa， 前期培养时间 12 小时 ； 后期罐压 0.05Mpa， 搅拌速度 50 转分， 培 养时间 8 小时， 培养末期的酵母浓度达到 3.0109个 /mL。 0062 (6) 浓缩 ：。
28、 发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的 45， 得到酵母菌浓缩液。 0063 (7) 添加载体 ： 向酵母菌浓缩液中添加混合好的载体， 混合均匀 ； 浓缩液与载体的 重量比为 0.5-0.7 1， 载体组成为 ： CaCO3 40 份， 糊精 20 份， 玉米蛋白粉 20 份。 0064 (8) 干燥 ： 流化床干燥， 干燥温度 50。 0065 培养基采用 10麦芽汁培养基或采用添加硫酸铵等无机盐的糖蜜培养基， 具体培 养生产工艺参见肖冬光 酿酒活性干酵母的生产与应用技术 。 0066 鼠李糖乳杆菌菌剂的制备 ： 0067 斜面菌种接入三角瓶， 培养至对数期后转接入发酵罐中， 控制温度为 45。
29、， 通风比 为 1 0.1(v/v)， 培养 18 小时左右至对数期。发酵完毕经板框过滤分离获得湿菌体， 加入 组成为 10脱脂奶、 5海藻糖、 5甘油的保护剂， 通过冷冻干燥获得菌剂， 水分含量低于 10。 0068 产品效果实验 ： 0069 试验牛的选择与试验设计 ： 试验于 2010 年 9 月 7 日 -10 月 7 日在宁夏吴忠市金积 牛场进行， 本实验采取随机配对原则， 将40头牛随机的分为试验组和对照组， 每组20头牛， 在日粮中按每头每日添加产品40g， 饲喂60天， 结果表明实验组日增重972.7g， 对照组日增 重 746.8g， 差异极显著 (P 0.01)。饲喂 5 天后， 其粪便干物质和饲喂前相比， 减少 30。 0070 使用高效生物活性饲料添加剂 1 个月后， 发现牛奶产量比较稳定， ( 不喂的组下降 幅度较大， 因为试验牛已过了泌乳高峰期 )， 乳脂率也增加了， 效果很好。从奶牛外表来看， 喂高效生物活性饲料添加剂的奶牛的毛亮， 食欲好， 乳房炎发病率降低。 说 明 书 CN 102488113 A 7 。