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1、(10)授权公告号 CN 102577983 B (45)授权公告日 2013.11.06 CN 102577983 B *CN102577983B* (21)申请号 201210080583.4 (22)申请日 2012.03.23 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路 1 号 (72)发明人 陈智勇 易自力 覃静萍 蒋建雄 艾辛 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所 43114 代理人 袁靖 CN 101889552 A,2010.11.24,说明书第2页 第 0011-0012 段 , 第 3 页第 00。
2、38- 说明书 第 4 页第 0041 段 . CN 102090338 A,2011.06.15,说明书第3页 实施例 1. US 20080282424 A1,2008.11.13, 全文 . WO 2011019984 A2,2011.02.17, 全文 . (54) 发明名称 五节芒快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明公开了五节芒快速繁殖方法， 以五节 芒的幼穗为外植体， 选用五节芒处于颖花原基形 成期的幼穗， 灭菌， 切成穗段， 接种在愈伤组织 诱 导 培 养 基 ： MS+2.0-6.0mg/L 2， 4-D+0-0.2mg/ L 6-BA， 250-300lux 光照下， 242。
3、培养， 7 天 左右产生愈伤组织 ； 愈伤组织接种在分化培养 基 MS+1.0-4.0mg/L 6-BA， 2000lux 光照下， 温度 242培养， 直至形成丛生芽， 增殖系数为 4 以 上 ；以 MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根， 生根率达95以上， 只需35天左 右形成完整植株。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王涛 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102577983 B CN 。
4、102577983 B *CN102577983B* 1/1 页 2 1. 五节芒快速繁殖方法， 其特征在于， 该方法包括如下步骤 ： 1） 外植体的选择与灭菌 ： 选用五节芒的幼穗， 将幼穗外包裹的多层叶或叶鞘去除， 仅保 留幼穗外的旗叶， 用无菌水清洗 3 4 次后， 在无菌操作台上用 70% 酒精处理 15-30 秒， 再 用 0.1% 的升汞消毒 18 20 分钟， 用无菌水冲洗 6 7 次备用 ； 2）胚性愈伤组织的诱导 ： 将灭菌处理后带旗叶的幼穗， 在超净台剥去旗叶， 将幼穗 切成穗段， 接种在 MS+2.0-6.0mg/L2,4-D+0-0.2mg/L6-BA 的愈伤组织诱导培。
5、养基 ； 在 250-300lux 光照下培养， 保持温度 242， 诱导产生愈伤组织 ； 3）丛生芽诱导及增殖 ： 愈伤组织接种在 MS+1.0-4.0mg/L6-BA 的分化培养基 ； 在 2000lux 光照下培养， 保持温度 242， 直至形成丛生芽 ； 4） 生根培养 ： 以 MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC 诱导芽和根 ； 步骤 1） 中所述外植体的选择取幼穗时叶枕距为 0-2cm ； 步骤 1） 中所述的外植体选用五节芒处于颖花原基形成期的幼穗 ； 步骤 2） 中将幼穗切成 0.3-0.5cm 长度的穗段 ； 步骤 2） 中接种瓶内每瓶。
6、接种 2-5 个穗段 ； 步骤 3） 中愈伤组织生长至直径 0.5-0.8cm， 挑选淡黄色并致密的愈伤组织， 接种在分 化培养基。 权 利 要 求 书 CN 102577983 B 2 1/3 页 3 五节芒快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明属于植物细胞工程领域， 涉及植物组织工程技术， 具体地说是一种五节芒 的组织快繁方法。 背景技术 0002 五 节 芒 (Miscanthus floridulus) 属 于 禾 本 科 (Poaceae) 芒 属 (Miscanthus Andersson)( 陈守良， 1997)， 是一种高光效的 C4 植物， 具有生物质产量高、 抗逆性强、 。
7、纤维 素含量高、 燃烧充分等特点， 被认为是一种开发潜力巨大的生物质能源植物， 在我国主要分 布在热带和亚热带地区 ( 萧运峰， 1995)。目前， 五节芒在组织培养有少量报道， 胡恒康等 ( 植物生理学通讯， 2009) 利用种子为外植体， 萌发的小苗切去胚根诱导出丛生芽。刁英等 在一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法中， 以幼穗为外植体， 诱导胚性愈伤组织， 幼 穗取材长度及消毒方法与本发明不同， 并且本发明诱导愈伤组织过程中使用的培养基等均 未见报道。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种五节芒的快速繁殖方法。 0004 五节芒快速繁殖方法， 包括如下步骤 ： 0005 1) 外。
8、植体的选择与灭菌 ： 选用五节芒的幼穗， 将幼穗外包裹的多层叶或叶鞘去 除， 仅保留幼穗外的旗叶， 用无菌水清洗 3 4 次后， 在无菌操作台上用 70酒精处理 15-30 秒， 再用 0.1的升汞消毒 18 20 分钟， 用无菌水冲洗 6 7 次备用 ； 0006 2) 胚性愈伤组织的诱导 ： 将灭菌处理后带旗叶的幼穗， 在超净台剥去旗叶， 将幼 穗切成穗段， 接种在 MS+2.0-6.0mg/L 2， 4-D+0-0.2mg/L 6-BA 的愈伤组织诱导培养基 ； 在 250-300lux 光照下培养， 保持温度 242， 诱导产生愈伤组织 ； (6-8 天左右产生愈伤组 织 ) ； 00。
9、07 3) 丛生芽诱导及增殖 ： 愈伤组织接种在 MS+1.0-4.0mg/L 6-BA 的分化培养基 ； 在 2000lux 光照下培养， 保持温度 242， 直至形成丛生芽 ； 增殖系数为 4 以上 ； 0008 4) 生根培养 ： 以 MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC 诱导芽和根。生根 率达 95以上。 0009 步骤 1) 中所述外植体的选择取幼穗时叶枕距为 0-2cm。 0010 步骤 1) 中所述的外植体选用五节芒处于颖花原基形成期的幼穗。 0011 步骤 2) 中将幼穗切成 0.3-0.5cm 长度的穗段。 0012 步骤 2) 中接种。
10、瓶 (5.66.99.1cm( 口径 胸径 高 ) 内每瓶接种 2-5 个穗 段。 0013 步骤 3) 中愈伤组织生长至直径 0.5-0.8cm， 挑选淡黄色并致密的愈伤组织， 接种 在分化培养基。 0014 本发明提出的五节芒的组织培养方法， 采用幼穗外植体， 保证了遗传稳定性 ； 避免 说 明 书 CN 102577983 B 3 2/3 页 4 幼穗直接与酒精和升汞接触， 以免幼穗褐化， 降低出愈率 ； 同时， 本发明方法仅需 35 天左右 形成完整植株， 3 5 个月内可获得大量完整植株。 附图说明 0015 图 1 为五节芒幼穗诱导愈伤组织的图片 ； 0016 图 2 为五节芒胚性。
11、愈伤组织分化的图片 ； 0017 图 3 为五节芒增殖培养的图片 ； 0018 图 4 为五节芒生根培养的图片。 具体实施方式 0019 以下结合实施例进一步说明本发明， 而不是限制本发明。 0020 实施例 1 0021 取材 ： 五节芒 (M.floridulus)02117 采自湖南郴州， 保存于湖南农业大学芒属植 物资源圃内。 0022 1、 外植体的选择与灭菌 ： 选用五节芒优良单株， 切取叶枕距为 0 的处于颖花原基 形成期的幼穗。首先将幼穗外部叶清除干净， 仅留旗叶， 用无菌水清洗 3 次后， 在无菌操作 台上用 70酒精处理 15 秒左右， 再用 0.1的升汞消毒 18 分钟，。
12、 用无菌水冲洗 6 次备用 ； 0023 2、 胚性愈伤组织的诱导 ： 将灭菌处理后带旗叶的幼穗， 在超净台上去除旗叶， 将幼 穗切成 0.3cm 左右的穗段， 接种在愈伤组织诱导培养基 ： MS+2， 4-D2.0mg/L+6-BA0.1mg/L。 接种瓶内每瓶接种 5 个穗段， 在培养室下 300lux 光照， 保持温度 242， 培养 7 天左右诱 导出愈伤组织 ； 0024 3、 丛生芽诱导及增殖 ： 愈伤组织生长至直径为 0.5cm 左右， 挑选淡黄色并较为致 密的愈伤组织， 接种在 MS+6-BA2.0mg/L 的分化培养基。在 2000lux 光照下培养， 保持温度 24+2， 。
13、直至形成丛生芽， 增殖系数为 4.6 以上 ； 在生根培养基 ： MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/ LIBA+1.0mg/L CCC 诱导芽和根， 生根率达 95以上， 只需 35 天左右形成完整植株 ； 0025 4、 试管苗的移栽 ： 选取根系生长良好的试管苗， 放入清水中把根部的琼脂清洗干 净， 移栽到天然泥土中， 注意保水保湿， 移栽 1 个月后， 移栽成活率达到 90以上。 0026 实施例 2 0027 取材 ： 五节芒 (M.floridulus)04405 采自安徽马鞍山， 保存于湖南农业大学芒属 植物资源圃内。 0028 1、 外植体的选择与灭菌 ： 选用五节芒优良。
14、单株， 切取叶枕距为1.5cm的幼穗。 首先 将幼穗外部叶清除干净， 仅留旗叶， 用无菌水清洗 4 次后， 在无菌操作台上用 70酒精处理 20 秒左右， 再用 0.1的升汞消毒 20 分钟， 用无菌水冲洗 6 次备用 ； 0029 2、 胚性愈伤组织的诱导 ： 将灭菌处理后带旗叶的幼穗， 在超净台上去除旗叶， 将幼 穗切成 0.4cm 左右的穗段， 接种在愈伤组织诱导培养基 ： MS+2， 4-D4.0mg/L+6-BA0.2mg/L。 接种瓶内每瓶接种 4 个穗段， 在培养室下 250lux 光照， 保持温度 242， 培养 7 天左右诱 导出愈伤组织 ； 0030 3、 丛生芽诱导及增殖。
15、 ： 愈伤组织生长至直径为 0.7cm 左右， 挑选淡黄色并较为致 密的愈伤组织， 接种在 MS+6-BA4.0mg/L 的分化培养基。在 2000lux 光照下培养， 保持温度 说 明 书 CN 102577983 B 4 3/3 页 5 24+2， 直至形成丛生芽， 增殖系数为 4.8 以上 ； 在生根培养基 ： MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/ LIBA+1.0mg/L CCC 诱导芽和根， 生根率达 95以上， 只需 35 天左右形成完整植株 ； 0031 4、 试管苗的移栽 ： 选取根系生长良好的试管苗， 放入清水中把根部的琼脂清洗干 净， 移栽到天然泥土中， 注意保水保湿。
16、， 移栽 1 个月后， 移栽成活率达到 90以上。 0032 实施例 3 0033 取材 ： 五节芒 (M.floridulus)02155 采自湖南常德， 保存于湖南农业大学芒属植 物资源圃内。 0034 1、 外植体的选择与灭菌 ： 选用五节芒优良单株， 切取叶枕距为 2cm 的处于颖花原 基形成期的幼穗。首先将幼穗外部叶清除干净， 仅留旗叶， 用无菌水清洗 4 次后， 在无菌操 作台上用 70酒精处理 30 秒左右， 再用 0.1的升汞消毒 20 分钟， 用无菌水冲洗 7 次备 用 ； 0035 2、 胚性愈伤组织的诱导 ： 将灭菌处理后带旗叶的幼穗， 在超净台上去除旗叶， 将幼 穗切成。
17、 0.5cm 左右的穗段， 接种在愈伤组织诱导培养基 ： MS+2， 4-D6.0mg/L+6-BA0mg/L。接 种瓶内每瓶接种 3 个穗段， 在培养室下 250lux 光照， 保持温度 242， 培养 7 天左右诱导 出愈伤组织 ； 0036 3、 丛生芽诱导及增殖 ： 愈伤组织生长至直径为 0.8cm 左右， 挑选淡黄色并较为致 密的愈伤组织， 接种在 MS+6-BA4.0mg/L 的分化培养基。在 2000lux 光照下培养， 保持温度 242， 直至形成丛生芽， 增殖系数为 4.2 以上 ； 在生根培养基 ： MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/ LIBA+1.0mg/L CCC 诱导芽和根， 生根率达 95以上， 只需 35 天左右形成完整植株 ； 0037 4、 试管苗的移栽 ： 选取根系生长良好的试管苗， 放入清水中把根部的琼脂清洗干 净， 移栽到天然泥土中， 注意保水保湿， 移栽 1 个月后， 移栽成活率达到 90以上。 说 明 书 CN 102577983 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102577983 B 6 。