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1、10申请公布号CN104195165A43申请公布日20141210CN104195165A21申请号201410440706X22申请日20140901C12N15/81200601C12N1/19200601C12N9/76200601C12R1/8420060171申请人北京爱必信生物技术有限公司地址101111北京市大兴区北京经济技术开发区科创六街88号3号楼五层605室72发明人王晓霞彭毅74专利代理机构北京北新智诚知识产权代理有限公司11100代理人熊国裕赵郁军54发明名称包含葡萄糖启动子的载体、宿主菌以及重组牛源胰蛋白酶的制备方法57摘要本发明涉及一种在毕赤酵母中通过基因重组的手。
2、段异源表达牛源胰蛋白酶原基因的方法，该重组牛胰蛋白酶原通过采用新型启动子在毕赤酵母中表达并分泌到培养基中，酶原通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶等处理可制备活性牛胰蛋白酶，由此制备的活性牛胰蛋白酶可用于生产重组人胰岛素及人胰岛素类似物。此方法可避免组成型启动子三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子和诱导型启动子醇氧化酶AOX1启动子的缺点。51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表5页附图1页10申请公布号CN104195165ACN104195165A1/1页21一种酵母表达载体，所述酵母表达载体包括启动子及目的基。
3、因，所述启动子为葡萄糖启动子，所述目的基因为编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列。2根据权利要求1所述的表达载体，其中所述启动子与所述目的基因构成一个表达盒。3根据权利要求1所述的酵母表达载体，其中所述葡萄糖启动子为PG6启动子。4根据权利要求3所述的酵母表达载体，其中所述PG6启动子的核苷酸序列为SEQIDNO1的部分或全部核苷酸序列。5根据权利要求1所述的酵母表达载体，所述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。6根据权利要求5所述的酵母表达载体，其中所述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列进一步在C端加入6个组氨酸作为纯化标签。7根据权利要求16中任一权利要求所述的酵母表达载体，其中所述酵母表达载。
4、体为能够用以表达外源蛋白的穿梭载体，这些酵母表达载体均含有表达外源蛋白所必需的元件，优选以PPIC9K、PPIC35K、PPICZA、PPICZB、PPICZC、PPICZA、PPICZB、PPICZC或PAO815为基础改造的载体，所述改造的酵母表达载体包含所述葡萄糖启动子和编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列。8根据权利要求7所述酵母表达载体，所述酵母表达载体为具有筛选标记的酵母表达载体，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为ZEOCIN、GENETICIN或HIS。9含有权利要求1至8中任一权利要求所述的宿主菌。10根据权利要求8所述的宿主菌，其中所述宿主为酵母菌，优选毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS。
5、115，所述宿主包含至少一种所述表达载体。11制备重组牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括1以葡萄糖作为唯一碳源，诱导权利要求10所述宿主菌表达C端带有组氨酸标签的牛胰蛋白酶原；2通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；3以镍柱亲和一步纯化法纯化所得牛胰蛋白酶，纯化中洗脱液通过梯度为20MM至250MM的咪唑溶液洗脱目的蛋白。12权利要求11所述方法，所述的葡萄糖终浓度为0002G10G/L，优选的为1G/L；诱导温度30，优选的为20。13权利要求11所述方法，步骤2的酶切和步骤3的纯化过程可以顺序进行，也可以同时进行。权利要求书CN104195165A1/9页3包含葡萄。
6、糖启动子的载体、宿主菌以及重组牛源胰蛋白酶的制备方法技术领域0001本发明涉及一种重组表达牛源胰蛋白酶的基因工程菌及其构建方法与应用。具体地，涉及一种采用新型启动子启动牛源胰蛋白酶表达的基因工程菌的构建方法与应用。背景技术0002胰蛋白酶TRYPSIN，EC34214在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。胰蛋白酶是由胰腺分泌的一种内肽酶，最初分泌物为胰蛋白酶原，受肠激酶或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列。
7、中，它成为不可缺少的工具。其中牛胰脏来源的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为233KDA，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。0003胰蛋白酶在临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。在基因工程领域，胰蛋白酶也获得了越来越广泛的应用，特别在重组人胰岛素及人胰岛素类似物的生产过程中，胰蛋白酶为不可或缺的酶，其比活性的高低及稳定性是影响胰岛素原活化收率的一个至关重要的参数。牛源胰蛋白酶作为切割第三代胰岛素的有效工具酶被广泛研究。0004目前制备胰蛋白酶的方。
8、法主要有两类一是提取自动物如猪、牛的胰脏，因其方法相对简单，被广泛采用，但是该方法因不能完全除去其他蛋白质，且产品中的动物源病毒如口蹄疫病毒、疯牛病病毒等不能完全除去，因此其应用存在一定的局限性及风险性；二是生产重组胰蛋白酶，多以猪源性胰蛋白酶为多，牛源性几乎没有，仅见美国礼来和江苏万邦以大肠杆菌表达的包涵体复性的牛胰蛋白酶和印度拜康以毕赤酵母发酵的杂合牛胰蛋白酶的专利。0005本方法以酵母为宿主制备牛源胰蛋白酶，优势在于酵母的真核表达系统所产生的胰蛋白酶结构正确，产量较高，且是以分泌表达的方式存在于培养基中，培养基的成分有利于胰蛋白酶的稳定性，且有利于纯化；本方法采用新型启动子通过加入葡萄糖。
9、诱导牛源胰蛋白酶的表达，由于胰蛋白酶的表达具有毒性，此方法避免了组成型启动子三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子不需要诱导就可直接表达对细胞的伤害作用，也避免了醇氧化酶启动子AOX1诱导需要甲醇，甲醇易燃易爆及对健康有害的缺点。发明内容0006为克服现有技术表达表达牛源胰蛋白酶所用的GAP启动子和AOX1启动子的缺陷，本发明涉及一种表达牛源胰蛋白酶的新型启动子，所述启动子为葡萄糖启动子。0007本发明的另一目的是提供一种酵母表达载体，所述酵母表达载体包括启动子及目说明书CN104195165A2/9页4的基因，所述启动子为葡萄糖启动子，所述目的基因为编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列，所述葡萄糖启动子与所述。
10、目的基因构成一个表达盒，所述的表达盒可以通过体外构建或抗生素浓度及遗传霉素浓度筛选多拷贝。0008本发明中，所述葡糖糖启动子，可以是选自PG1或PG6葡萄糖启动子，优选为PG6葡萄糖启动子，所述PG6葡萄糖启动子具有SEQIDNO1所述的部分或全部核苷酸序列，所述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQIDNO2所示，其编码的牛源胰蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO3所示。0009为了在后续纯化牛源胰蛋白酶是更为简化，本发明中，在所述编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列的C端加入6个组氨酸作为纯化标签。0010本发明中，所述酵母表达载体为能够用以表达外源蛋白的穿梭载体，这些能够用以表达外源蛋白的穿梭载体均含有。
11、表达外源蛋白所必需的元件，优选以PPIC9K、PPIC35K、PPICZA、PPICZB、PPICZC、PPICZA、PPICZB、PPICZC或PAO815为基础改造的载体，所述改造的酵母表达载体包含所述葡萄糖启动子和编码牛胰蛋白酶的核苷酸序列。0011进一步地，所述酵母表达载体为具有筛选标记的酵母表达载体，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为ZEOCIN、GENETICIN或HIS。0012本发明的另一目的，在于提供一种含有本发明所述酵母表达载体的宿主菌，其中所述宿主为酵母菌，优选毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115。含有本发明所述表达载体的宿主菌，其可以是至少含有一种改造的酵母表达载体，。
12、如在一个宿主菌中，可以是只包括含有一种筛选标记并含有编码牛源胰蛋白酶的基因，此时的宿主菌，为含有一种改造的酵母表达载体；或者，在所述宿主菌中，也可以是包括两种筛选标记并含有编码牛源胰蛋白酶的基因，此时的宿主菌，为含有两种改造的酵母表达载体。0013本发明的还一目的，在于提供一种制备重组牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括1以葡萄糖作为唯一碳源，诱导本发明用以所述宿主菌表达C端带有组氨酸标签的牛胰蛋白酶原；2通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；3以镍柱亲和一步纯化法纯化所得牛胰蛋白酶，纯化中洗脱液通过梯度为20MM至250MM的咪唑溶液洗脱目的蛋白。0014具体地，以酵母。
13、作为宿主并采用葡萄糖启动子制备重组牛胰蛋白酶的方法，该方法包括00151、提供编码葡萄糖启动子的核苷酸序列；00162、提供编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列；00173、将上述启动子和目的基因构建成表达盒，代替其他启动子表达盒克隆到不同筛选标记的酵母表达载体中；00184、将上述载体转化至同一酵母宿主；00195、诱导上述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签HISTAG的牛胰蛋白酶原；00206、通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；00217、纯化上述牛胰蛋白酶。0022优选地，步骤1中所述的葡萄糖启动子的序列来源于毕赤酵母菌；0023步骤2中所述编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序。
14、列可以根据所用宿主的密码子偏好性来确定，以增加宿主的表达效率。该方法为本领域技术人员所公知的技术，具体地密码子说明书CN104195165A3/9页5优化由基因合成公司确定本专利中核苷酸序列由金唯智公司按毕赤酵母密码子偏好优化并合成。0024步骤3中的所述酵母表达载体框架可以为任意一种具有筛选标记的酵母表达载体框架，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为ZEOCIN、GENETICIN、HIS等。0025步骤4中的所述酵母宿主作为一种真核表达系统，能够直接表达构象正确的目的蛋白，无需后续的变性和复性过程。因此本发明的方法对酵母宿主的种类没有任何限制，优选的酵母菌株可为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母。
15、、光滑球拟酵母等，更优选的酵母菌株为毕赤酵母。0026步骤5中的诱导酵母宿主表达蛋白的方法采用葡萄糖作为唯一碳源诱导目的蛋白的表达。优选地，葡萄糖的诱导终浓度达到0002G10G/L，更优选的，葡萄糖的诱导终浓度达到1G/L。0027步骤6中的自激活、肠激酶或胰蛋白酶切方法是本领域技术人员所公知的，0028步骤7中的纯化带有组氨酸标签的蛋白质的技术和方法是本领域技术人员所公知的。本发明的纯化方法优选采用镍柱亲和一步纯化法进行，并通过梯度为20MM至250MM的咪唑溶液来洗脱目的蛋白。0029步骤6中的所述酶切和步骤7中的所述纯化过程可以顺序进行，也可以同时进行。0030本发明制备牛胰蛋白酶的方。
16、法具有以下优点00311采用新型启动子启动目的基因牛源胰蛋白酶的表达，避免组成型启动子不需要诱导就可表达牛源胰蛋白酶进而对细胞具有毒性和醇氧化酶启动子利用甲醇诱导存在易燃易爆并对健康有害的缺点。00322、在酵母真核表达系统中进行重组表达，表达产物牛胰蛋白酶原无需经过变性和复性，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的牛胰蛋白酶。00333、表达生成C端带有组氨酸标签HISTAG的牛胰蛋白酶原，使得在后续的酶切和亲和纯化过程中，能够使纯化产物牛胰蛋白酶保留在洗脱液中，纯化产物体积小，不需后续浓缩步骤。00344纯化简单，利用HIS标签一步纯化即可得到产品。00355如根据酵母偏好密码子提供编码牛胰。
17、蛋白酶原的核苷酸序列，还可以进一步提高表达量。00366如在诱导表达过程中使葡萄糖的终浓度达到1G/L，能够更高效的表达牛胰蛋白酶原。附图说明0037图1重组BT的WESTERNBLOT检测图，图中A泳道为牛胰蛋白酶活化后纯化SDSPAGE，B泳道为培养液上清牛胰蛋白酶原纯化，经活化后牛胰蛋白酶分子量明显小于酶原。0038图2重组BT的SDSPAGE电泳检测图，A泳道为20度诱导分泌上清，B泳道为28度诱导分泌上清，从WB图可以看出20度诱导较28度诱导可以获得更多的目标产物。具体实施方式说明书CN104195165A4/9页60039材料0040菌株和质粒克隆菌种ESCHERICHIACOL。
18、ITOP10是基因工程常用菌种；巴斯德毕赤酵母PICHIAPASTORISGS115、KM71、KM71H、X33、SMD1168、SMD1168H；质粒PPIC9K、PPIC35K、PPICZA、PPICZB、PPICZC、PPICZA、PPICZB、PPICZC、PAO815购于INVITROGEN公司。0041酶和试剂0042实施例中涉及分子生物学操作所用的限制性内切酶均购于NEB公司，所用的基因扩增酶购自北京全式金公司，连接酶购自宝生物公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。0043琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司、酵母DNA提取试剂盒购自北京天根公司，。
19、相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。0044实施例中所涉及的编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的测序由金唯智公司完成。0045TAME购于SIGMA公司。0046ZEOCIN购于INVITROGEN公司。0047ANTITRYPSINRABBIT购自ABCAM公司。0048DONKEYANTIRABBIT二抗购自北京博奥森公司0049培养基0050LB、YPD、MD、YPDS、BMGY、BMMY0051抗性培养基为相应培养基加相应抗生素或遗传霉素，如AMPICILLIN、ZEOCIN、G418。0052以上培养基是基因工程领域常用培养基，各培养基的配方可参见分子克隆。
20、第三版下册附录2以及INVITROGEN公司的毕赤酵母操作手册MULTICOPYPICHIAEXPRESSIONKIT第64页第70页；及PPICZA、BANDC第17第18页。0053方法0054聚合酶链反应，PCR产物纯化，基因和质粒的酶切、回收、连接和转化，以及大肠杆菌转化子的筛选，鉴定，这些基因工程常规操作方法，可参见SAMBROOKJ，FRISTSHEF,MANIATISTMOLECULARCLONING；ALABOIATORYMANUAL2NDEDNYCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPIESS,1989,PP16340。重组酵母表达载体质粒的线性化，酵母转化，转。
21、化子的筛选、诱导表达以及表达鉴定，可参见INVITROGEN公司的毕赤酵母操作手册MULTICOPYPICHIAEXPRESSIONKIT第32页第63页。及PPICZA、BANDC第9第14页。0055实施例1巴斯德毕赤酵母基因组的提取及PG6启动子的扩增00561将PICHIAPASTORISX33划线到YPD固体培养基上，30培养2天后挑单菌落接种到YPD液体培养基，培养1天后，按天根公司酵母基因组试剂盒说明书提取基因组。00572以步骤1中提取的基因组为模板，以设计的两条引物为上下游引物，扩增PG6启动子。0058PG6FCGAAGATCTAGACCAGCAGTTTAACTACG划线处。
22、为BGLII限制性内切酶0059PG6RCCTGCCTTCGAACTTTTCTTTGGGCAAGGAAA划线处为BSTBI限制性内切酶说明书CN104195165A5/9页70060PCR反应体系0061组分体积UL10TRANSTAQHIFIBUFFERI5DNTPS25MM4上游引物PG6F10UM2下游引物PG6R10UM2DNA聚合酶TAQHIFI5U/UL05PICHIAX33基因组1无菌水355总体积500062注后面实施例中扩增基因的PCR反应体系与上述表格相同，引物与模板换成相应的引物与模板，10TRANSTAQHIFIBUFFERI换成10TRANSTAQHIFIBUFFER。
23、II0063扩增条件为00640065注后面实施例中基因扩增条件与上述表格相同。0066实施例2PPICZB载体的改造0067将PPICZB用BGLII和BSTBI双酶切，回收2700BP左右片段，将2700片段与实施例1中的PG6产物用BGLII和BSTBI双酶切之后用T4DNALIGASE连接，命名为ZBPG6，连接体系如下0068组分体积UL10T4DNALIGATIONBUFFER1说明书CN104195165A6/9页8PPICZB2PG665T4DNALIGASE05总体积100069将连接产物转化TOP10，菌落PCR筛选阳性克隆，阳性克隆提质粒酶切鉴定后送金唯智测序。0070实。
24、施例3利用ZBPG6构建牛胰蛋白酶BOVINETRYPSIN，BT原表达质粒0071按照毕赤酵母密码子偏好性化学合成编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列，最终核苷酸序列为SEQNO2所示的核苷酸序列。0072反应引物序列为0073上游引物ZBBTF0074AAGCTCGAGAAAAGATTTCCAGTTGATGATGATGATAAGATT划线处为XHOI识别位点0075下游引物ZBBTR0076ATATAGCGGCCGCGTTAGAAGCAATAGTTTGCTTAATCC划线处为NOTI识别位点0077利用上述引物扩增带有XHOI和NOTI酶切位点的BT序列，将PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化，将。
25、ZBPG6和PCR产物分别用XHOI和NOTI双酶切，将两个片段用T4DNALIGASE连接，命名为ZBPG6BT，连接体系如下0078组分体积UL10T4DNALIGATIONBUFFER1ZBPG62BTXHOI、NOTI65T4DNALIGASE05总体积1000790080将连接产物转化TOP10，菌落PCR筛选阳性克隆，阳性克隆提质粒酶切鉴定后送金唯智测序。0081实施例4PPIC9K载体的改造00821将PPIC9K载体用SCAI和XBAI双酶切，琼脂糖凝胶回收2650BP和6600BP左右片段，将2650BP片段用BGLII和BSTBI双酶切，琼脂糖凝胶回收620BP左右片段和1。
26、100BP左右的片段，将PG6启动子用BGLII和BSTBI双酶切并回收。将各片段用连接酶连接。0083连接体系为连接产物命名为9KPG60084说明书CN104195165A7/9页9组分体积UL10T4DNALIGATIONBUFFER26600BPXBAISCAI15620BPSCAIBGLII45PG6BGLIIBSTBI551100BPBSTBIXBAI55T4DNALIGASE1总体积200085连接产物9KPG6转化ECOLITOP10感受态，涂布含AMP抗性的LB平板，待长出菌落后用菌落PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆提质粒酶切鉴定，酶切鉴定阳性质粒送金唯智公司测序，得到测序正确。
27、的质粒。0086实施例5利用9KPG6载体构建牛胰蛋白酶原表达质粒0087按照毕赤酵母密码子偏好性化学合成编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列，最终核苷酸序列为SEQNO2所示的核苷酸序列。0088反应引物序列为0089上游引物9KBTF0090GGCGAATTCTTTCCAGTTGATGATGATGATAAGATTGTTG划线为ECORI识别位点0091下游引物9KBTR0092ATATAGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTAGAAGCAATAGTTTGCTTAATCC划线为NOTI识别位点0093PCR扩增带有ECORI和NOTI酶切位点的9KBT，将9KPG6和9KB。
28、T分别用ECORI和NOTI双酶切，将双酶切片段用T4DNALIGASE连接，命名为9KPG6BT，连接体系如下0094组分体积UL10T4DNALIGATIONBUFFER19KPG629KBTECORI、NOTI65T4DNALIGASE05总体积100095连接体系转化TOP10感受态，菌落PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆提质粒酶切鉴定后说明书CN104195165A8/9页10送金唯智测序。0096实施例6重组牛胰蛋白酶原酵母工程菌的构建00971、按照INVITROGEN公司的毕赤酵母操作手册，将用SACI线性化后的ZBPG6BT酶原表达质粒电转化至PICHIAGS115感受态细胞中。然。
29、后将转化后的PICHIAGS115涂布于ZEOCIN抗性的YPDS固体培养基上，29孵育34天。0098从上述固体培养基上挑取转化子，依次转接到600G/ML、1MG/ML、2MG/MLZEOCIN抗性的YPDS固体培养基上，29培养，以筛选高拷贝的转化子。挑取单菌落接种于5MLYPDS液体培养基中，29，220RPM培养，制成可表达BT酶原的工程菌ZBT。00992、按照INVITROGEN公司的毕赤酵母操作手册，将SALI线性化后的9KPG6BT酶原表达质粒电转化至PICHIAGS115感受态细胞中。然后将转化后的PICHIAGS115涂布于MD固体培养基上，29孵育34天。0100从上述。
30、固体培养基上挑取转化子，依次转接到05MG/ML、15MG/ML、3MG/ML、4MG/MLYPDG418固体培养基上，29培养，以筛选高拷贝的转化子。挑取单菌落接种于5MLYPDS液体培养基中，29，220RPM培养，制成可表达BT酶原的工程菌KBT。01013、按照INVITROGEN公司的毕赤酵母操作手册，将SALI线性化后的9KPG6BT酶原表达质粒电转化Z1感受态，涂布MD平板。从上述MD平板挑取转化子，依次转接到05MG/ML、15MG/ML、3MG/ML、4MG/MLYPDG418固体培养基以筛选高拷贝转化子。待高拷贝转化子生长起来后，挑取单菌落接种于5MLYPD液体培养基中，2。
31、9，220RPM培养，制成大量BT酶原的表达工程菌ZKBT。0102实施例7重组BT酶原表达工程菌的诱导表达0103将上述工程菌按照2接种量接种于10MLYPD液体培养基中，29，220RPM培养，待菌生长起来后，将其按照05接种量接种于1LBMGY液体培养基中，29，220RPM培养，待OD600NM约为8时，离心，弃上清，用1LBMMY液体培养基重悬菌体，装于2L摇瓶中，每500ML菌液装一瓶，瓶口用纱布封闭，20，220RPM，添加葡萄糖至04M/V进行培养，并且每24小时再次补充甲醇至04M/V，直至第4天诱导完毕。重组BT酶原被分泌表达至液体培养基中。采用WESTERNBLOT检测牛。
32、胰蛋白酶情况，结果见图1。0104实施例8重组BT酶原表达产物的酶切0105将诱导表达后的工程菌培养基离心，取上清液，用045UM滤膜过滤，测定OD280下吸收值后将其换算为质量浓度，然后过滤所得溶液按照1001质量浓度的比例，加入肠激酶，室温下酶切25H3H，得到重组BT。0106实施例9重组BT的纯化和鉴定0107将上述酶切产物用NTANI预装柱北京中原公司进行纯化，首先使用20MM咪唑进行洗脱以除去杂蛋白，然后250MM咪唑洗脱目的蛋白BT，收集组分峰，得到含有咪唑的BT溶液。0108将上述含有咪唑的BT溶液用脱盐柱北京中原公司去除咪唑，洗脱液为包含50MMHAC、100MMNACL、5。
33、0MMCACL2、PH为300的溶液，收集组分峰，得到纯品重组BT溶液，冷冻干燥，最终ZBT、KBT、ZKBT三种重组菌每升发酵液分别可获得约512MG、49MG、1520MG重组BT。0109使用SDSPAGE电泳检测重组BT的纯度，结果见图2，可见所得重组BT纯度很高；说明书CN104195165A109/9页11另将所得重组BT经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致。0110实施例10重组BT的酶活性测定0111材料实施例19制备的重组BT溶液，TAME，01121吸取PH为81浓度为0046M的TRIS含001MCACL226ML放入3ML比色皿中，加入用水溶解的浓度为001MTAME0。
34、3ML，用01ML水代替BT原液，以此为空白，在247NM处测OD值。01132重复以上的空白过程，再加入待测BT原液01ML混匀，立即放入分光光度计中每30S计数，至5MIN为止线性增长区间必须在3MIN以上0114C选择图谱中线性部分计算0115U/MGA247/MIN体系体积稀释倍数/054原液浓度加入酶的量体积0116平行测三个样计算平均活性0117重组BT酶活性的3次检测的结果分别为131U/MG、141U/MG、161U/MG；平均重组BT酶活性为14433U/MG。说明书CN104195165A111/5页1200010002序列表CN104195165A122/5页130003序列表CN104195165A133/5页140004序列表CN104195165A144/5页150005序列表CN104195165A155/5页16序列表CN104195165A161/1页17图1图2说明书附图CN104195165A17。