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1、10申请公布号CN104211786A43申请公布日20141217CN104211786A21申请号201410461064122申请日20140911C07K14/14200601C12N15/46200601C12N15/7020060171申请人黑龙江省兽医科学研究所地址161006黑龙江省齐齐哈尔市建华区西二道街112号申请人侯喜林72发明人侯美如高俊峰侯喜林74专利代理机构哈尔滨市松花江专利商标事务所23109代理人侯静54发明名称牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原及其制备方法57摘要牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原及其制备方法，涉及一种蛋白抗原及其制备方法。本发明为了解决现有的牛轮状病毒检。
2、测方法不能同时满足设备及操作简单、特异性好、可大规模临床普及的问题。牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原由644BP碱基编码，大小为40KDA。方法一、提取牛轮状病毒BRVDQ株的基因组RNA；二、反转录，PCR扩增，纯化后与PMD18T载体连接，得PMD18TVP7质粒；三、对PMD18TVP7和PET30A双酶切，连接，转入宿主菌，得重组菌PET30AVP7/BL21；四、重组蛋白的诱导表达；五、重组蛋白的纯化，即得到牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原。用于牛轮状病毒检测领域。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页。
3、序列表2页附图1页10申请公布号CN104211786ACN104211786A1/1页21牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原，其特征在于该牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原由644BP碱基编码，大小为40KDA，碱基序列如序列表中SEQIDNO1所示。2权利要求1所述的牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行一、提取牛轮状病毒BRVDQ株的基因组RNA；二、将步骤一获得的RNA反转录为CDNA，使用上游引物P1和下游引物P2对CDNA进行PCR扩增，将PCR产物经胶回收纯化后与PMD18T载体进行连接，获得PMD18TVP7质粒；三、对PMD18TVP7质粒和表达载体PET。
4、30A均采用NCO和HIND双酶切，然后通过T4DNA连接酶连接，连接产物转入宿主菌BL21，得到重组菌PET30AVP7/BL21；四、重组蛋白的诱导表达；五、重组蛋白的纯化，即得到牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原。3根据权利要求2所述的牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原的制备方法，其特征在于步骤二中上游引物P1为5AGGCCATGGATGCACAAAACTACGGTAT3，下游引物P2为5CGCAAGCTTTTATTCCCTTGGCCCCAAT3。权利要求书CN104211786A1/5页3牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种蛋白抗原及其制备方法。背景技术0002牛。
5、轮状病毒ROTAVIRUS，RV属于呼肠孤病毒科REOVIRIDAE轮状病毒属ROTAVIRUS，是犊牛非细菌性腹泻的主要病原之一。牛轮状病毒于1968年首次被MEBUS等人发现并证明为新生牛犊腹泻的病原，命名为NCDV株NEBRASKACALFDIARRHEAVIRUS，NCDV。该病毒可引起动物精神沉郁、水样腹泻、酸中毒以及食欲废绝，多感染1545日龄犊牛。1980年，我国首次在水牛、黄牛腹泻粪便中检出轮状病毒，证明该病毒在我国的存在。随后也出现大量犊牛病毒性腹泻的报道。牛轮状病毒流行广、发病率高且对犊牛有较大危害，己成为一种世界性疾病。若继发其它疾病，死亡率会大大增加，给养牛业造成了巨大。
6、的经济损失。0003牛轮状病毒的传统诊断方法如细胞分离方法，由于除A型牛轮状病毒外，其它牛轮状病毒的许多毒株迄今未能适应细胞培养，分离的成功率约在4070。由于此方法操作繁琐，需特殊的培养条件及工艺，分离周期较长，费用较高，故并不适合作为广范的临床检测和诊断方法；电镜技术，此方法虽为检测该病原的“金标准”，但由于电镜法所需实验要求比较严格还需专门设备和人才，并不适宜应用于大规模样品检测，而且粪便中病毒粒子是否破碎，形态是否完全或数量是否足够等方面均会影响电镜结果；现代分子检测手段如聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE，该方法特异性强，不仅可用于检测牛轮状病毒，而且还能够鉴别牛轮状病毒的种群。PAGE作为。
7、BRV鉴定方法，不需特殊的设备及操作简单，可用于大量样品的同时检测。其不足主要由于病毒的RNA较易被空气或药品中的RNA酶降解，使结果不准确，出现假阴性；BRV经典的PCR检测方法为逆转录PCRRTPCR，牛A群轮状病毒常以其结构蛋白VP7各型别均保守的2段核苷酸序列为引物，快速，特异的对病毒进行鉴别，但由于RNA的提取过程复杂且易污染，更适于实验室诊断，对于大规模的临床普及，仍有难度；血清学检测方法无疑是临床检测中较为理想的诊断手段，其中ELISA诊断方法无需昂贵的仪器设备，成本低，灵敏性及特异性高，无放射性污染等优点，易于在基层推广，而以表达衣壳蛋白建立的间接ELISA方法，又具有克服抗原。
8、排毒、散毒潜在危险的优势。发明内容0004本发明为了克服上述问题，提供一种牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原及其制备方法。0005本发明牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原由644BP碱基编码，大小为40KDA，碱基序列如序列表中SEQIDNO1所示。0006本发明牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原的制备方法，按以下步骤进行0007一、提取牛轮状病毒BRVDQ株的基因组RNA；二、将步骤一获得的RNA反转录为CDNA，使用上游引物P1和下游引物P2对CDNA进行PCR扩增，将PCR产物经胶回收纯化后说明书CN104211786A2/5页4与PMD18T载体进行连接，获得PMD18TVP7质粒；三、对PMD18TV。
9、P7质粒和表达载体PET30A均采用NCO和HIND双酶切，然后通过T4DNA连接酶连接，连接产物转入宿主菌BL21，得到重组菌PET30AVP7/BL21；四、重组蛋白的诱导表达；五、重组蛋白的纯化，即得到牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原。0008步骤二中上游引物P1为5AGGCCATGGATGCACAAAACTACGGTAT3，下游引物P2为5CGCAAGCTTTTATTCCCTTGGCCCCAAT3。0009随着现代分子免疫学和分子生物学等先进技术的开发利用，为新一代生物工程诊断试剂的研制开发开辟了新途径。以基因工程、细胞工程等先进的技术手段获得的诊断抗原或抗体，其突出特点在于均一性好，纯度。
10、高，特异性强，性能稳定，并易于保存和批量生产，由此建立诊断技术和方法易于国际标准化，是未来疫病诊断发展的主要方向。同时，以生物技术生产的诊断抗原，可避免繁琐的细胞培养来制备大量的抗原物质。0010BRVVP7蛋白由326个氨基酸组成，分子量为37KDA，占轮状病毒蛋白总量的30，是病毒结构蛋白含量中第二多的，为病毒的外衣壳蛋白，VP7是轮状病毒的主要中和抗原，决定其G血清型，能够诱导病毒中和抗体，能够激发较强的免疫应答，因此对外衣壳蛋白VP7基因的进行克隆、表达及其表达产物纯化。其纯化的蛋白产物，无论是作为一种疾病的诊断抗原，还是作为一种激发机体免疫应答的免疫制剂，均是极为有用的新型生物制剂。。
11、这制剂的进一步应用，将对BRV的诊断与防治提供重要的物质基础。0011本发明制备的重组BRVVP7蛋白具有与天然的VP7蛋白相近的免疫生物学技术特性，而且可以规模化生产，该方法避免采取体外培养病毒抗原、差速离心和密度梯度离心纯化病毒的生产方法，提高了工作效率，减少了非特异性反应。以此生产的抗原，可避免以活病毒做抗原散播病毒的危险。0012以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原，建立检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法，利用建立的间接ELISA方法与病毒中和试验同时检测牛血清，VP7蛋白ELISA方法与病毒中和试验的符合率达872。附图说明0013图1为具体实施方式一步骤二中PC。
12、R扩增结果的电泳图；图2为对具体实施方式一步骤二获得重组质粒PMD18TVP7进行酶切鉴定的结果图；图3为具体实施方式一步骤五纯化后的重组蛋白的SDSPAGE电泳图；图4为具体实施方式一重组蛋白的WESTERNBLOT鉴定结果。具体实施方式0014具体实施方式一本实施方式牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原的制备方法，按以下步骤进行0015一、牛轮状病毒BRVDQ株基因组RNA的提取0016牛轮状病毒BRVDQ株经过TRIZOL的裂解后，加入2倍体积的氯仿和2倍体积的异丙醇抽提，加入25倍的无水乙醇沉淀核酸，再用体积百分比浓度为70的冰乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，加适量无菌去离子水溶解沉淀，得到BRVD。
13、Q株基因组RNA，20保存备用。说明书CN104211786A3/5页50017所述牛轮状病毒BRVDQ株为DQ75，已在文章新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定谢金鑫等，黑龙江八一农垦大学学报，2010年10月，第22卷第5期中公开，可由文章作者处获得。0018二、RTPCR扩增VP7基因0019将步骤一获得的RNA反转录为CDNA，具体步骤按反转录酶的说明书进行所述反转录酶购买自PROMEGA公司。获得的CDNA的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，使用上游引物P1和下游引物P2对CDNA进行PCR扩增，按照TAQDNA聚合酶的说明书进行所述TAQDNA聚合酶购买自FERMENTAS公司。获得。
14、的PCR产物经胶回收纯化后与PMD18T载体进行连接，获得重组质粒PMD18TVP7。0020步骤二中上游引物P1为5AGGCCATGGATGCACAAAACTACGGTAT3，下游引物P2为5CGCAAGCTTTTATTCCCTTGGCCCCAAT3。0021三、对PMD18TVP7质粒和表达载体PET30A均采用NCOI和HINDIII双酶切，然后通过T4DNA连接酶连接，连接反应按T4DNA连接酶的说明书进行，连接产物转入宿主菌BL21，测序正确的菌即为阳性重组菌PET30AVP7/BL21。0022四、蛋白诱导表达0023将50L重组菌PET30AVP7/BL21的菌液接种于5ML含K。
15、AN的LB液体培养基中，37振荡培养过夜。然后取100L过夜培养的菌液接种于10ML含KAN的LB液体培养基中，37以200RPM振荡培养至OD600值为0607时，取样1ML作为诱导前对照。然后，加入IPTG至终浓度1MMOL/L，继续以200RPM振荡培养，分别在2H、3H、4H、5H和6H取样1ML。于12000RPM离心1MIN，收集菌体沉淀，加入50L001MOL/LPBS，加入等量2SDS加样缓冲液重悬沉淀，100煮沸5MIN，用12的SDS聚丙烯酰胺电泳检测表达情况。0024五、重组蛋白的纯化00251向组菌PET30AVP7/BL21的菌液中加入IPTG至终浓度1MMOL/L，。
16、以200RPM振荡培养，当菌液的OD600值达到06时，8000RPM离心10MIN收集菌体；00262弃去上清，每克湿菌加3ML灭菌的去离子水，悬浮混匀后加入3L50MMOL/L的蛋白酶抑制剂购买自AMRESCO公司和80L溶菌酶，于室温在水平摇床缓慢摇动15MIN。00273用超声波破碎菌体，功率400W，破碎6S，间隔6S，重复100次，然后以12000RPM离心10MIN，收集沉淀。00284向沉淀中加入1ML灭菌去离子水和等体积2SDS加样缓冲液，煮沸5MIN。0029512000RPM离心10MIN，取上清全部上样，做不连续垂直电泳，开始的时候电压为100V，当染料到分离胶后电压升。
17、到200V，直到染料跑出分离胶为止。00306取下凝胶置于冰冷的025M的KCL溶液中5MIN，待凝胶带显色后，用手术刀片切下含有目的带的凝胶。00317将切下的凝胶放入透析袋中，加入3MLTRIS甘氨酸电泳缓冲液，80V水平电泳2H，然后再将透析袋反向电泳2MIN。00328用001MOL/LPBS缓冲液对洗脱的蛋白于4透析，用PEG20000浓缩蛋白，用基因定量仪测定其浓度，取20L蛋白进行SDSPAGE电泳，其余于70冻存备用。0033六、重组蛋白的WESTERNBLOT鉴定0034先进行SDSPAGE电泳后，然后使用半干式电转印仪进行蛋白质免疫印迹反应，将说明书CN104211786A。
18、4/5页6蛋白转移至NC膜上进行WESTERNBLOT分析，其具体步骤如下00351转膜在半干式电转印仪的阴极板上依次放置下物浸过转印缓冲液的滤纸3张、凝胶、硝酸纤维素膜、浸过转印缓冲液的滤纸3张，尽可能的排尽气泡，盖上阳极盖，恒压9V，通电1H，00362封闭将NC膜放入平皿中，根据滤膜面积以01ML/CM2量加入封闭液，排尽气泡，然后密闭平皿，在水平摇床上缓缓摇动，室温封闭2H或4过夜。00373洗涤PBST在摇床上洗3遍，每次10MIN。00384抗体的结合用封闭液将一抗按适当比例稀释，将已封闭好的膜置于抗体溶液中，排尽气泡，室温摇动2H或4过夜。00395洗涤PBST在摇床上洗3遍，每。
19、次10MIN。00406二抗的结合用封闭液将HRP标记的兔抗牛IGG按一定比例稀释，将已封闭的膜置抗体溶液中，室温摇动1H。00417洗涤PBST在摇床上洗3遍，每次10MIN。00428显色加入DAB后进行显色。00439终止反应当NC膜有颜色条带出现时，充分显色510MIN，将膜转移至去离子水中终止显色反应，以免背景颜色过高。004410膜置滤纸上干燥，分析结果。0045步骤二中PCR扩增结果的电泳图如图1所示，其中M为DNA标准DL2000，1、2为表达产物。0046对步骤二获得重组质粒PMD18TVP7进行酶切鉴定，如图2所示，其中M为DNA标准DL2000，1为酶切产物。0047步骤。
20、五纯化后的重组蛋白的SDSPAGE电泳如图3所示，其中M为蛋白质分子质量标准，1为诱导前的PET30AVP7，2为诱导5H的PET30A空载体，3为诱导5H的PET30AVP7。0048重组蛋白的WESTERNBLOT鉴定结果如图4所示，其中M为蛋白质分子质量标准，1为诱导的空载体对照；2为诱导后产物。0049以上实验结果证明本发明方法获得了牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原。0050以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原，建立检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法，利用建立的间接ELISA方法与病毒中和试验同时检测78份牛血清，检测结果见表1，所检血清ELISA阳性为47份，阴性31份；中和试验阳性41份，阴性37份。VP7蛋白ELISA方法与病毒中和试验的符合率达872。0051表10052说明书CN104211786A5/5页70053说明书CN104211786A1/2页800010002序列表CN104211786A2/2页9序列表CN104211786A1/1页10图1图2图3图4说明书附图CN104211786A10。