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1、10申请公布号CN104212919A43申请公布日20141217CN104212919A21申请号201410510971022申请日20140928C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人江苏省疾病预防控制中心地址210009江苏省南京市江苏路172号72发明人郭宏雄还锡萍周莹卢静胡海洋傅更锋徐晓琴邱涛张之王小亮丁萍丁建平刘晓燕李建军闫红静陈国红史灵恩陈禹衡74专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218代理人傅婷婷徐冬涛54发明名称一种用于检测HIV1病毒的LAMP引物组合物及其应用57摘要本发明公开了一种用于检测HIV1病。
2、毒的LAMP引物组合物及其应用。一种用于检测HIV1的LAMP引物组合物，由序列为SEQIDNO1和SEQIDNO5所示的正向内引物FIP混合物，序列为SEQIDNO2和SEQIDNO6所示的反向内引物BIP混合物，序列为SEQIDNO3和SEQIDNO7所示的正向外引物F3混合物，序列为SEQIDNO4和SEQIDNO8所示的反向内引物B3混合物组成。本发明所述的LAMP引物组合物可在制备检测HIV1病毒的检测试剂中应用。本发明引物组合物具有理想的灵敏度、特异性，使用该套引物能够检测我国主要的流行株及亚型。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权。
3、局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表5页附图2页10申请公布号CN104212919ACN104212919A1/1页21一种用于检测HIV1病毒的LAMP引物组合物，其特征在于由以下引物组成由序列为SEQIDNO1所示的C1F3和序列为SEQIDNO5所示的C2F3组成的正向内引物混合物FIP，由序列为SEQIDNO2所示的C1B3和序列为SEQIDNO6所示的C2B3组成的反向内引物混合物BIP，由序列为SEQIDNO3所示的C1FIP和序列为SEQIDNO7所示的C2FIP组成的正向外引物混合物F3，由序列为SEQIDNO4所示的C1BIP和序列为SEQIDNO8所示的C2B。
4、IP组成的反向内引物混合物B3。2权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备检测HIV1病毒的检测试剂中的应用。3一种检测HIV的LAMP试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的LAMP引物组合物。4根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于以HIVDNA为模板时，所述的试剂盒包含由以下组分组成的检测试剂A80PMOL的正向内引物混合物FIP、80PMOL的反向内引物混合物BIP、40PMOL正向外引物混合物F3、40PMOL反向内引物混合物B3、40MMPH88的TRISHCL、20MM的KCL、16MMMGSO4、20MMNH42SO4、02TWEEN20、16M的BETAINE、DNTPS各28。
5、MM。5根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含BSTDNA聚合酶。6根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于以HIVRNA为模板时，所述的试剂盒包含由以下组分组成的检测试剂A80PMOL的正向内引物FIP、80PMOL的反向内引物BIP、40PMOL正向外引物、40PMOL反向外引物、40MMPH88的TRISHCL、20MM的KCL、16MMMGSO4、20MMNH42SO4、02TWEEN20、16M的BETAINE、DNTPS各28MM。7根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含BSTDNA聚合酶和逆转录酶。8根据权利要求4或6所述的试剂盒，其特征在于所述。
6、的试剂盒还包括荧光目测显影剂SYBR。9一种检测HIV1病毒的方法，其特征在于提取待检样本中的核酸，以提取的核酸为模板，利用权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；扩增反应结束后通过以下三种方式之一判定结果方式一通过观察扩增产物浑浊度进行判定，如果扩增产物出现混浊，即说明样本中含有HIV1病毒，反之，则不存在HIV1病毒；方式二对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现梯状条带，则证明待检样本中含有HIV1病毒，反之，则不存在HIV1病毒；方式三LAMP扩增前向扩增体系中加入荧光目测显影剂，LAMP扩增反应结束后观察各反应管颜色变化，在常光下检测结果，如果样品呈绿色，即证明。
7、样本中含有HIV1病毒，否则为阴性，即不存在HIV1病毒。10根据权利要求9所述的方法，其特征在于LAMP扩增反应程序为632，905MIN；802，52MIN。权利要求书CN104212919A1/5页3一种用于检测HIV1病毒的LAMP引物组合物及其应用技术领域0001本发明属于医学领域，涉及一种用于检测HIV1病毒的LAMP引物组合物及其应用。背景技术0002人类免疫缺陷病毒1型HUMANIMMUNODECIENCYVIRUSTYPE1或HIV1，于1983年在美国首次被发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒LENTIVIRUS，属反转录病毒的一种。在世界范围内HIV1导致了近120。
8、0万人的死亡，超过3000万人受到感染。该病毒具有高度的变异能力,分为四个组，M、N、O、P组。其中M组病毒流行最为广泛，O组见于中非西部，N组只有两例，是在喀麦隆发现的，P组是2009年从一位喀麦隆妇女身上发现的。在M组中，分为A至D，F至H，J至K等11种亚型和70多个重组型。HIV1的高度变异给疫苗研究、治疗和检测带来了许多挑战。0003目前市场上检测HIV1核酸的试剂主要依赖于实时荧光定量REALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCR、依赖于核酸序列的等温扩增NUCLEICACIDSEQUENCEBASEDAMPLICATION，NASBA和分支DNA技术BRA。
9、NCHDNA,BDNA，目前以这些技术为基础已经开发了HIV1病毒核酸的检测试剂。其中定量试剂仅仅限于HIV1感染者体内病毒的定量检测，并不能用于定性检测。目前市场上的HIV1核酸定性检测试剂仅仅限于血液筛查，这些试剂由于在使用过程中出现较多的假阳性和假阴性等问题在临床检测中而未能使用。唯一国际上通过FDA认证的由ROCHE公司开发的HIV1DNA定性试剂仍然依赖于实时荧光定量技术。不管是实时荧光定量、依赖于核酸序列的等温扩增技术、还是分支DNA技术都是依赖于荧光检测的，在检测时需要专门的仪器，根本无法在基层医院或医院门诊使用。不仅如此，ROCHE公司开发的HIV1核酸定性检测试剂主要针对HI。
10、V1M组病毒中的B亚型设计引物，而B亚型并不是我国目前的主要流行株。因此迫切需要以中国流行的HIV1株为靶序列设计能够检测中国流行的HIV的定性检测方法。0004环介导等温扩增技术LOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLICATION,LAMP是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术。是2000年由日本荣研化学株式会社以下简称“荣研公司”开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在1560分钟内实现1091010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察。
11、白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，不像实时荧光定量、NASBA、分支DNA法，都需要昂贵的全封闭仪器。LAMP反应的结果判定也非常简单，LAMP的实验结果可以直接用肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像以荧光为基础的检测方法需要用特殊仪器实时检测荧光，并分析扩增曲线。因此LAMP是一种适合现场、基层的快速检测方法。说明书CN104212919A2/5页4发明内容0005本发明的目的是提供用于检测HIV核酸的LAMP引物组合物。0006本发明的另一目的是提供该引物组合物的应用。
12、0007本发现的目的可通过如下技术方案实现0008一种用于检测HIV1病毒的LAMP引物组合物，由以下引物组成由序列为SEQIDNO1所示的C1F3和序列为SEQIDNO5所示的C2F3组成的正向内引物混合物FIP，由序列为SEQIDNO2所示的C1B3和序列为SEQIDNO6所示的C2B3组成的反向内引物混合物BIP，由序列为SEQIDNO3所示的C1FIP和序列为SEQIDNO7所示的C2FIP组成的正向外引物混合物F3，由序列为SEQIDNO4所示的C1BIP和序列为SEQIDNO8所示的C2BIP组成的反向内引物混合物B3。0009本发明所述的LAMP引物组合物在制备检测HIV1病毒的。
13、检测试剂中的应用。0010一种检测HIV的LAMP试剂盒，含有本发明所述的LAMP引物组合物。0011本发明所述的试剂盒，以HIVDNA为模板时，所述的试剂盒包含由以下组分组成的检测试剂A80PMOL的正向内引物混合物FIP、80PMOL的反向内引物混合物BIP、40PMOL正向外引物混合物F3、40PMOL反向内引物混合物B3、40MMPH88的TRISHCL、20MM的KCL、16MMMGSO4、20MMNH42SO4、02TWEEN20、16M的BETAINE、DNTPS各28MM。0012以HIVDNA为模板时，所述的试剂盒还包含BSTDNA聚合酶。0013本发明所述的试剂盒，以HIV。
14、RNA为模板时，所述的试剂盒包含由以下组分组成的检测试剂A80PMOL的正向内引物FIP、80PMOL的反向内引物BIP、40PMOL正向外引物、40PMOL反向外引物、40MMPH88的TRISHCL、20MM的KCL、16MMMGSO4、20MMNH42SO4、02TWEEN20、16M的BETAINE、DNTPS各28MM。0014以HIVRNA为模板时，所述的试剂盒还包含BSTDNA聚合酶和逆转录酶。0015所述的试剂盒还进一步优选包括荧光目测显影剂，所述的荧光目测显影剂选自SYBR。0016一种检测HIV1病毒的方法，提取待检样本中的核酸，以提取的核酸为模板，利用所述的特异性的LAM。
15、P引物组合物进行LAMP扩增反应；扩增反应结束后通过以下三种方式之一判定结果0017方式一通过观察扩增产物浑浊度进行判定，如果扩增产物出现混浊，即说明样本中含有HIV1病毒，反之，则不存在HIV1病毒；0018方式二对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现梯状条带，则证明待检样本中含有HIV1病毒，反之，则不存在HIV1病毒；0019方式三LAMP扩增前向扩增体系中加入荧光目测显影剂，LAMP扩增反应结束后观察各反应管颜色变化，在常光下检测结果，如果样品呈绿色，即证明样本中含有HIV1病毒，否则为阴性，即不存在HIV1病毒。0020LAMP扩增反应程序优选为632，905MIN；802，52MI。
16、N。0021本发明法中，可以从血液样品或从干血斑样品中提取HIV核酸样品，如果要提取DNA，按常规方法或用试剂盒提取DNA的方法均可。如果要提取RNA，按常规方法或用试剂盒提取RNA的方法均可。0022有益效果说明书CN104212919A3/5页50023本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在00241实用性好。普通PCR反应对产生进行凝胶电泳时很容易造成产物扩散，这是分子生物学实验室污染的主要来源之一。而LAMP反应结束后可以通过直接观察浊度或颜色的变化判定检测结果，杜绝了因开盖引起的污染。目前做HIV1核酸检测的方法均需要实时检测荧光，而实时检测荧光需要特殊的仪器。00252实现等。
17、温扩增，不像PCR法或REALTIME实时荧光定量PCR法必需要进行热循环。做PCR和实时荧光定量PCR需要特殊的仪器，尤其后者价格十分昂贵。而LAMP则只需要提供稳定的热源就可以进行。非常适合在基层推广使用。00263准确性高目前HIV的检测试剂在我国市场上应用的检测试剂均为HIV1核酸定量试剂，由于其特异性和假阳性问题，目前市场使用的HIV定性检测试剂仅仅用于部分血站采供血样品的筛查。尽管FDA批准了ROCHE公司生产HIVDNA定性试剂应用实时荧光定量PCR方法，但由于需要全封闭的仪器和昂贵的试剂和耗材目前至少在国内市场还未见使用。传统的PCR法使用两条引物，实时荧光定量PCR使用三条引。
18、物，而在LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。在本试验中，我们的最低检测限达到1000拷贝/ML,每次反应时我们加入8L模板，即每个反应体系仅含有模板8个拷贝的HIV1病毒核酸。00274能够覆盖多种HIV亚型0028HIV1具有高度的变异能力，该病毒被分为三个主要的组M、N、O组,其中M组流行最为广泛。HIV1病毒M组共有11个亚型及近70个重组型。HIV1病毒的基因组主要包括三个区GAG区,POL区,ENV区，在病毒的两侧为LTR区该区不编码蛋白质。其中POL区最为保守，尽管如此，同一亚型的HIV1病毒的POL区基因的变异度也达到近20。因此通。
19、过HIV1病毒的保守区设计能够扩增所有亚型的引物序列仍然存在一定的困难。为了突破这种限制本研究在引物设计及组合中主要采用如下方法00291首先比对从HIV病毒发现后30年间1983年至2013年不同时间测定和提交的各种亚型的HIV全基因组序列，比对后计算保守区同一位点的每个碱基出现的频率，根据出现频率计算每个位点不同碱基出现频率的百分比。如果在同一位点同一个碱基的出现频率接近90，在引物序列中就只使用该碱基。如果在同一位点有多个碱基出现，没有任何一个碱基的出现频率超过90，就同时使用两种出现频率最高的碱基，即在引物序列中引物混合碱基，保证引物序列能够适用于各种变异情况。这种设计保证了我们设计的。
20、引物能够更大程度上检测各种亚型的HIV1病毒及检测的广谱性。00302在同一反应体系中，使用多套引物分别靶向不同的基因区。0031传统核酸检测中，一般只针对一个靶基因区设计一套引物。我们针对HIV病毒的高度可变性，在同一反应体系同时引入两套引物，这两套引物分别扩增不同的靶基因区，大大提高了检测的灵敏度和对多种HIV1亚型的检测能力。使用该套引物能够检测我国主要的流行株CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、C亚型。附图说明0032图1LAMP对不同亚型的HIV1病毒的检测0033其中P为阳性对照，N为阴性对照，1、2为CRF01_AE，3、4为CRF07_BC,5、6为CRF。
21、08_说明书CN104212919A4/5页6BC，7、8为B亚型，9、10为C亚型，11、12为CRF02_AG0034图2LAMP检测HIV1病毒的特异性0035A,用HIV1特异性的LAMP引物检测HIV、HCV、HBV的琼脂糖电泳图其中M为MARKER，N为阴性对照，P为阳性对照；1、2为HIV，3，4为HCV，5，6为HBV；0036B,颜色判定LAMP检测HIV1病毒的特异性显色图其中N为阴性对照，P为阳性对照，1、2为HIV，3，4为HCV，5，6为HBV。0037图3LAMP检测HIV1病毒的灵敏度0038N为阴性对照，P为阳性对照，1，2，3，4，5，6分别为拷贝数为1106。
22、拷贝/ML，1105拷贝/ML，1104拷贝/ML，1000拷贝/ML，100拷贝/ML，50拷贝/ML。实验时，每25微升反应体系中加入8微升的模板。具体实施方式0039实施例1LAMP反应体系的配制0040一种用于检测HIVDNA的LAMP试剂盒，由检测试剂A、BSTDNA聚合酶8个单位/L和荧光目测显影剂SYBR组成；检测试剂A由以下组分组成80PMOL的正向内引物FIP、80PMOL的反向内引物BIP、40PMOL正向外引物、40PMOL反向外引物、40MMPH88的TRISHCL、20MM的KCL、16MMMGSO4、20MMNH42SO4、02V/VTWEEN20、16M的BETA。
23、INE、DNTPS各28MM。0041反应时取检测试剂A125L，加入1L的BSTDNA聚合酶8个单位/L,8LDNA模板，1L荧光目测显影剂SYBR，加无菌去离子水补足至25L。0042实施例2逆转录LAMP反应体系的配制0043一种用检测HIVRNA的RTLAMP试剂盒，由检测试剂A、8个单位/L的BSTDNA聚合酶、1个单位/L的逆转录酶和荧光目测显影剂SYBR组成。检测试剂A由以下组分组成80PMOL的正向内引物FIP、80PMOL的反向内引物BIP、40PMOL正向外引物、40PMOL反向外引物、40MMPH88的TRISHCL、20MM的KCL、16MMMGSO4、20MMNH42。
24、SO4、02TWEEN20、16M的BETAINE、DNTPS各28MM。0044反应时取检测试剂A125L，加入1L的BSTDNA聚合酶8个单位/L,05L的逆转录酶1个单位/L，8LRNA模板，1L的荧光目测溶液，加无菌去离水补足至25L。0045实施例3HIV1LAMP反应对不同HIV1亚型检测能力的试验0046取已知HIV亚型的HIV血浆样品按常规方法提取HIVRNA，所提核酸作为模板，反应时取检测试剂A125L，加入1L的BSTDNA聚合酶8个单位/L,05L逆转录酶每L05个单位，8LRNA模板，1L荧光目测显影剂SYBR，加无菌去离子水补足至25L。反应程序为6390MIN，80。
25、5MIN。结果显示阳性对照、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、C、CRF02_AG反应管变为绿色，而阴性对照均未变色。说明LAMP方法能够检测中国主要的HIV1亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、C、CRF02_AG图1。0047实施例4HIV1LAMP反应特异性试验0048分别取HIV、HCV、HBV阳性样品和正常人血浆，提取RNA核酸，所提核酸作为模板，反应时取检测试剂A125L，加入1L的BSTDNA聚合酶8个单位/L,05L逆转说明书CN104212919A5/5页7录酶每L05个单位，8LRNA模板，1L荧光目测显影剂SYBR，加无菌。
26、去离子水补足至25L。反应程序为6390MIN，805MIN结果显示只有阳性对照和HIV阳性样品反应管呈绿色，HCV、HBV和正常人血浆均未变色，说明该LAMP试验能够用于检测血浆中HIV样品，具有较好的特异性图2。0049实施例5HIV1LAMP反应灵敏度试验0050为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将已知HIV1病毒拷贝数的血浆样品该样品血浆事先用ROCHECOBASAMPLIPREP/COBASAMPLICORTAQMAN测定用正常人血清进行10倍比稀释，按常规提取核酸的方法提取HIV1DNA，所提DNA作为模板，反应时取检测试剂A125L，加入1L的BSTDNA聚合酶8个单位/L,8LDNA模板，1L荧光目测显影剂SYBR，加无菌去离子水补足至25L。反应程序为6390MIN，805MIN结果显示LAMP方法的检测灵敏度达到每ML1000个拷贝，即每L1个拷贝图3。说明书CN104212919A1/5页800010002序列表CN104212919A2/5页90003序列表CN104212919A3/5页100004序列表CN104212919A104/5页110005序列表CN104212919A115/5页12序列表CN104212919A121/2页13图1说明书附图CN104212919A132/2页14图2图3说明书附图CN104212919A14。