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1、(10)申请公布号 CN 103689218 A (43)申请公布日 2014.04.02 CN 103689218 A (21)申请号 201310653964.1 (22)申请日 2013.12.05 A23K 1/00(2006.01) A23K 1/18(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 杨红建 庞德公 曹斌斌 武甜甜 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 陈波 (54) 发明名称 一种提高饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发 酵丙酸生成的复合菌剂及其应用 (57) 摘要。
2、 本发明公开了属于畜禽饲料技术领域的一种 提高饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发酵丙酸生 成的复合菌剂及其应用。所述复合菌剂由枯草芽 孢杆菌、 产朊假丝酵母和屎肠球菌组成。 本发明提 供的复合菌剂， 可显著提高瘤胃微生物饲粮纤维 消化率， 增加瘤胃微生物发酵总挥发性脂肪酸生 成量高达 21.1%， 糖异生前体物丙酸生成量正向 调控高达 10.5 11.3%。制备方法简单、 可操作 性强， 适用于畜禽养殖业饲料加工， 可显著促进反 刍动物饲粮能量利用效率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6。
3、页 (10)申请公布号 CN 103689218 A CN 103689218 A 1/1 页 2 1. 一种提高饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发酵丙酸生成的复合菌剂， 其特征在于， 该复合菌剂由枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 、 产朊假丝酵母 （Candida utilis）和 屎肠球菌 （Enterococcus faecium） 组成 ； 所述枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 其活 菌数不低于 21010cfu/ 克干重 ； 所述产朊假丝酵母 （Candida utilis） 其活菌数不低于 4109cfu/ 克干重， 所述屎肠球菌 （Entero。
4、coccus faecium） 其活菌数不低于 11010cfu/ 克干重。 2. 根据权利要求 1 所述的复合菌剂， 其特征在于， 所述枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 、 产朊假丝酵母 （Candida utilis） 与屎肠球菌 （Enterococcus faecium） 菌粉按 照重量比为 （1 3） ：（1 3） ：（1 3） 的配伍比例进行混合。 3. 权利要求 1 2 所述复合菌剂在家畜饲料加工中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述应用为在提高饲粮纤维降解率与正 向调控瘤胃发酵糖异生前体物丙酸生成中的应用。 5. 根据权利要求 。
5、3 所述的应用， 其特征在于， 为下述任一方法 ： 1） 泌乳奶牛全混合日粮 ： 按每吨全混合日粮中添加复合菌剂 1000g 混合均匀 ； 2） 育肥牛羊精料补充料 ： 按照每吨精料补充料中添加复合菌剂 1000 2000g 混合均 匀。 权 利 要 求 书 CN 103689218 A 2 1/6 页 3 一种提高饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发酵丙酸生成的 复合菌剂及其应用 技术领域 0001 本发明属于畜禽饲料技术领域， 特别涉及一种提高饲料纤维降解率与正向调控瘤 胃发酵丙酸生成的复合菌剂及其应用。 背景技术 0002 反刍家畜瘤胃微生物通常可将所采食的饲料中纤维、 淀粉和可溶性糖等碳水化。
6、合 物经过消化代谢转化为丙酮酸， 进入三羧酸循环通过不同的代谢途径分别生成乙酸、 丙酸 和丁酸等挥发性脂肪酸 （VFA） 。对泌乳奶牛来说， 乙酸是乳腺合成乳脂中重要前体物。乙酸 在体内也可以用于合成少量的葡萄糖和酮体， 大部分乙酸在体内主要通过乙酰辅酶 A 在还 原性辅酶 II 作用下合成体脂和乳脂， 并以此方式储存能量 ； 乙酸在体内也可以进入三羧酸 循环分解成 CO2和 H2， 同时释放出 ATP 供能。反刍动物消化吸收碳水化合物的主要方式为 VFA， 而不是葡萄糖， 为保持机体血糖浓度， 瘤胃发酵所生成的糖异生前体物丙酸起着非常 重要的作用， 此外， 丙酸对泌乳奶牛来而言不仅是提高牛奶。
7、中乳糖的重要前体物， 而且在机 体提供能量与提高产奶量方面具有重要的作用。丁酸被瘤胃壁吸收过程中先转化为 - 羟 基丁酸进入肝脏和乳腺组织， 参与体内物质的代谢， 尤其作为肌肉组织的能量来源。因此， 乙酸、 丙酸和丁酸对泌乳奶牛是不可或缺的代谢产物。一般认为瘤胃食糜液中总 VFA 产生 量与饲料消化率直接相关， 而乙酸、 丙酸和丁酸组成比例则主要与饲料中结构性碳水化合 物与非结构性碳水化合物比例有关。 0003 有研究文献报道， 饲料中单一添加酵母饲用微生物可降低瘤胃发酵氧分压， 防止 乳酸过度生成， 提高饲料降解率 ； 单一添加诸如乳酸菌、 肠球菌、 芽孢杆菌、 丙酸杆菌、 埃氏 巨球形菌等。
8、饲用微生物时， 可竞争性抑制病原体的生长， 刺激免疫功能， 调节胃肠道内微生 物平衡 ； 一些乳酸菌可以控制腹泻发病率， 改善体增重与饲料转化率， 乳酸利用菌则可提高 犊牛体增重， 具有改善幼龄犊牛健康与生长状况的功效。但上述有些饲用微生物在饲料中 单一添加时， 虽然可不同程度提高消化率， 但无法实现定向调控瘤胃发酵非糖异生前体物 乙酸和丁酸与糖异生前 体物丙酸的生成比例 （NGR） 。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种提高饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发酵丙酸生成 的复合菌剂及其应用， 所述的复合菌剂可提高饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发酵糖异生 前体物丙酸生成。 0005 一种提高。
9、饲料纤维降解率与正向调控瘤胃发酵丙酸生成的复合菌剂， 该复合菌 剂由枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 、 产朊假丝酵母 （Candida utilis）和屎肠球菌 （Enterococcus faecium） 组成 ； 所述枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 其活菌数不低于 21010cfu/ 克干重 ； 所述产朊假丝酵母 （Candida utilis） 其活菌数不低于 4109cfu/ 克 干重， 所述屎肠球菌 （Enterococcus faecium） 其活菌数不低于 11010cfu/ 克干重。 说 明 书 CN 103689218 A 3 2/。
10、6 页 4 0006 所述枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 、 产朊假丝酵母 （Candida utilis） 与屎 肠球菌 （Enterococcus faecium） 菌粉按照重量比为 （1 3） ：（1 3） ：（1 3） 的配伍比 例进行混合。 0007 上述复合菌剂在家畜饲料加工中的应用。 0008 所述应用为在提高饲粮纤维降解率与正向调控瘤胃发酵糖异生前体物丙酸生成 中的应用。 0009 所述应用， 为下述任一方法 ： 0010 1） 泌乳奶牛全混合日粮 ： 按每吨全混合日粮中添加复合菌剂 1000g 混合均匀 ； 0011 2） 育肥牛羊精料补充料 ： 按照每。
11、吨精料补充料中添加复合菌剂 1000 2000g 混 合均匀。 0012 本发明的有益效果 ： 而本发明所提供的复合菌剂， 可显著提高不同粗饲料比例饲 粮干物质消化率高达6.4%， 提高纤维降解率2.245.7%， 显著提高瘤胃微生物发酵总挥发 性脂肪酸生成量 4.6 21.1%， 定向调控瘤胃微生物发酵糖异生前体物丙酸生成比例提高 10.5 11.3%， 在促进反刍动物饲粮能量利用效率方面具有显著的促进功效。 具体实施方式 0013 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。 除非特别指明， 本发明中所 用的实 验方法和技术均为本领域技术人员所公知的方法和技术。 0014 对于本领域技术人员而。
12、言， 在不背离本发明精神和实施的前提下， 对这些实施方 案中的产甲烷抑制剂组分、 含量、 比例等进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。 0015 反刍家畜瘤胃微生物原虫、 细菌、 真菌与古菌通常可将所采食的饲粮中纤维、 淀粉 和可溶性糖等碳水化合物经过一系列消化代谢途径转化为丙酮酸， 进入三羧酸循环通过不 同的代谢途径分别生成乙酸、 丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸 （VFA） 。 饲粮消化率和瘤胃微生物 发酵 VFA 生成量及其比例不仅受所添加饲用微生物的影响而且与饲粮中粗饲料比例具有 密切关系， 以下为在不同饲粮粗饲料比例条件下， 对本发明中复合菌剂的应用效果做出的 实施例如下 ： 0016。
13、 其中所用枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） （以下简称 BS） 菌剂和产朊假丝酵 母 （Candida utilis） ( 以下简称 CU) 菌剂为河北沧州旺发生物技术研究所生产， 屎肠球菌 （Enterococcus faecium） ( 以下简称 EF) 菌剂为郑州金百合生物工程有限公司生产。 0017 实施例 1 0018 高粗料比例条件下复合菌剂对饲粮瘤胃微生物纤维降解与糖异生前体物生成的 应用效果分析 0019 将枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） （以下简称 BS） 、 产朊假丝酵母 （Candida utilis） (以下简称CU)和屎肠球菌。
14、 （Enterococcus faecium） (以下简称EF)三种饲用微生 物， 采用用 L9(33) 正交表 （表 1） 对于这三个饲用微生物配伍添加量组合效果进行了分析测 试与比较。所用枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 菌剂， 为浅黄色固体粉末， 水分含量不 高于 8%， 活菌数不低于 21010cfu/ 克干重 ； 产朊假丝酵母 （Candida utilis） 菌剂， 为白色 固体粉末， 水分含量不高于10%， 活菌数不低于4109cfu/克干重， 屎肠球菌 （Enterococcus faecium） ， 为白色固体粉末， 水分含量不高于 8%， 活菌数不低于 。
15、11010cfu/ 克干重。 说 明 书 CN 103689218 A 4 3/6 页 5 0020 表 1 饲用微生物添加量配伍组合正交试验 L9(33) 表 0021 0022 0023 表中， BS ： 枯草芽孢杆菌， CU ： 产朊假丝酵母， EF ： 屎肠球菌 0024 以泌乳期荷斯坦奶牛为本试验中瘤胃液的供体动物， 将羊草与精料 （每千克精料 含有 ： 玉米粉 404.7 克， 豆粕 176.6 克， 菜籽粕 65.5 克， 棉籽粕 33.3 克， 膨化大豆 32.2 克， 甜菜渣 82.9 克， 棉籽 163.3 克， 石粉 11.6 克， 食盐 7.2 克， 小苏打 14.4 。
16、克， 维生素与微量元 素预混料 8.3 克） 按 70:30 比例混合均匀， 配制成高粗料比例全混合日粮作为饲粮底物， 用 分析天平称取 0.5 克饲粮底物至厌氧发酵瓶中。按照表 1 向厌氧发酵瓶中添加各配伍组 合处理组相应的枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 、 产朊假丝酵母 （Candida utilis） 与 屎肠球菌 （Enterococcus faecium） ， 添加 50mL pH6.85 的液体厌氧发酵培养基 （培养基组 成见表 2） ， 接种 25mL 泌乳奶牛瘤胃液 （其中含有瘤胃食糜混合微生物， 包括内源性细菌， 真 菌， 古菌及原虫等） ， 进行厌氧发。
17、酵 72 小时后， 测定饲粮底物体外干物质消失率 （IVDMD） ， 底 物中性洗涤纤维降解率 （NDFD） ， 底物中酸性洗涤纤维降解率 （ADFD） 以及发酵液中乙酸、 丙 酸、 异丁酸、 丁酸、 异戊酸、 戊酸浓度， 并计算总挥发性酸浓度 (tVFA)。计算非生糖挥发性脂 肪酸与糖异生挥发性脂肪酸比值 ： NGR=（乙酸 +2 丁酸 + 戊酸） /（丙酸 + 戊酸） 。整个试 验， 每个配伍组合安排 4 个发酵瓶重复， 重复三个发酵批次。 0025 表 2、 液体培养基组成 0026 溶液组分溶液体积， mL A 溶液200 B 溶液200 C 溶液200 D 还原液40 E 刃天青溶液。
18、1.0 蒸馏水400 0027 表中， A 溶液为微量元素溶液， 每升含 132 克 CaCl2 2H2O， 100 克 MnCl2 4H2O， 10 克 CoCl2 6H2O， 80 克 FeCl3 6H2O ； B 溶液为碳酸盐缓冲溶液， 每升含 4 克 NH4HCO3， 35 克 NaHCO3； C 溶液为磷酸盐缓冲溶液， 每升含 5.7 克 Na2HPO4， 6.2 克 KH2PO4， 0.6 克 MgSO47H2O ； D 还原 说 明 书 CN 103689218 A 5 4/6 页 6 液每升含 1.6 克 NaOH， 6.25 克 Na2S9H2O。E 刃天青溶液， 每升含 1。
19、 克刃天青指示剂。 0028 表 3、 高粗饲料比例饲粮条件下测试结果 0029 0030 表中， IVDMD ： 体外干物质消失率 ； NDFD ： 中性洗涤纤维降解率 ； ADFD ： 酸性洗涤纤 维降解率 ； tVFA ： 总挥发酸生成量 ； ACE ： 乙酸所占比例 ； PRO ： 丙酸所占比例 ； BUT ： 丁酸所占 比例 ； NGR ： 非生糖挥发酸与糖异生挥发酸之比。 0031 表 3 试验结果表明， 在高粗饲料比例饲粮条件下， 不同饲用微生物配伍组合处理 组瘤胃微生物发酵 72h 后 IVDMD 均有不同程度的升高， 其中， 配伍组合处理组 7 与 9 中提升 效果最为显著，。
20、 相比于对照组提升了 6.0% ； 不同饲用微生物配伍组合处理可不同程度提高 各处理组的 NDFD， 处理组 5 中提升效果最为显著， 相较于对照组提升了 10.9% ； 不同饲用微 生物配伍组合处理可不同程度提 高各处理组的总挥发酸生成量， 处理组 3 中提升效果最 为显著， 相较于对照组提升了 21.1% ； 添加复合菌剂饲料添加剂后总挥发酸中乙酸所占比 例不同程度降低， 处理组 3 与 9 中降低效果最为显著， 相较于对照组降低了 4.3% ； 丙酸所占 比例则随复合菌剂饲料添加剂的使用而不同程度升高， 处理组 3 中提升效果最为显著， 相 较于对照组提升了10.5%。 丁酸所占比例在添。
21、加复合菌剂饲料添加剂后亦不同程度提升， 其 中处理组 2、 3 与 5 中提升效果最为显著， 相较于对照组提升了 4.1%。NGR 水平则因添加复 合菌剂饲料添加剂而不同程度降低， 当底物为C3F7时， 处理组3中降低效果最为显著， 相较 于对照组降低了 15.3%。 0032 实施例 2 ： 低粗料比例条件下复合菌剂对饲粮瘤胃微生物纤维降解与糖异生前体 物生成的应用效果分析 0033 以泌乳期荷斯坦奶牛为试验动物， 将羊草与精料 （每千克精料含有 ： 玉米粉 404.7 说 明 书 CN 103689218 A 6 5/6 页 7 克， 豆粕 176.6 克， 菜籽粕 65.5 克， 棉籽粕。
22、 33.3 克， 膨化大豆 32.2 克， 甜菜渣 82.9 克， 棉籽 163.3 克， 石粉 11.6 克， 食盐 7.2 克， 小苏打 14.4 克， 预混料 8.3 克） 按 30:70 比例配制成低 粗料比例全混合日粮作为饲粮底物， 用分析天平称取 0.5 克饲粮底物至厌氧发酵瓶中。按 照表 1， 向厌氧发酵瓶中添加各配伍组合处理组相应的枯草芽孢杆菌、 产朊假丝酵母与屎肠 球菌， 添加 50mL pH6.85 的液体厌氧发酵培养基 （培养基组成参见实施例 1 中表 2 所示） ， 接 种25mL泌乳奶牛瘤胃食糜混合微生物， 进行厌氧发酵72小时后， 测定饲料底物体外干物质 消失率 （。
23、IVDMD） ， 底物中性洗涤纤维降解率 （NDFD） ， 底物中酸性洗涤纤维降解率 （ADFD） 以 及发酵液中乙酸、 丙酸、 异丁酸、 丁酸、 异戊酸、 戊酸浓度， 并计算总挥发性酸浓度(tVFA)。 计 算非生糖挥发性脂肪酸与糖异生挥发性脂肪酸比值 ： NGR=（乙酸 +2 丁酸 + 戊酸） /（丙酸 + 戊酸） 。整个试验， 每个配伍组合安排 4 个发酵瓶重复， 重复三个发酵批次。 0034 表 4、 低粗饲料比例饲粮条件下测试结果 0035 0036 0037 表中， IVDMD ： 体外干物质消失率 ； NDFD ： 中性洗涤纤维降解率 ； ADFD ： 酸性洗涤纤 维降解率 ； 。
24、tVFA ： 总挥发酸生成量 ； ACE ： 乙酸所占比例 ； PRO ： 丙酸所占比例 ； BUT ： 丁酸所占 比例 ； NGR ： 非生糖挥发酸与糖异生挥发酸之比。 0038 表 4 试验结果表明在低粗饲料比例饲粮条件下， 不同饲用微生物配伍组合处理组 瘤胃微生物发酵 72h 后 IVDMD 均有不同程度的升高， 处理组 9 中提升效果最为显著， 相较于 对照组提升了 6.4%。不同饲用微生物配伍组合处理可不同程度提高各处理组的 NDFD， 处理 组9中提升效果最为显著， 相较于对照组提升了15.5%。 添加复合菌剂饲料添加剂可不同程 说 明 书 CN 103689218 A 7 6/6。
25、 页 8 度提高各处理组的 ADFD， 处理组 9 中提升效果最为显著， 相较于对照组提升了 45.7%。不同 饲用微生物配伍组合处理可不同程度提高各处理组的总挥发酸生成量， 处理组 9 中提升效 果最为显著， 相较于对照组提升了20.7%。 添加复合菌剂饲料添加剂后总挥发酸中乙酸所占 比例不同程度降低， 处理组 9 中降低效果最为显著， 相较于对照组降低了 3.2% ； 丙酸比例则 随复合菌剂饲料添加剂的使用而不同程度升高， 处理组 9 中提升效果最为显著， 相较于对 照组提升了 11.3%。丁酸比例在添加复合菌剂饲料添加剂后亦不同程度提升， 其中处理组 5 中提升效果最为显著， 相较于对照。
26、组提升了 8.1%。NGR 水平因添加复合菌剂饲料添加剂而 不同程度降低， 处理组 9 中降低效果最为显著， 相较于对照组降低了 13.2%。 0039 综合上述实施例 1 和 2， 测试结果表明， 本发明复合菌剂复合菌剂中枯草芽孢杆 菌、 产朊假丝酵母与屎肠球菌在添加量配伍比例为 （1 3） ：（1 3） ：（1 3） 时， 可显著 提高不同粗饲料比例饲粮干物质消化率高达 6.4%， 提高纤维降解率 2.2 45.7%， 显著提 高瘤胃微生物发酵总挥发性脂肪酸生成量 4.6 21.1%， 定向调控瘤胃微生物发酵糖异生 前体物丙酸生成比例提高 10.5 11.3%， 在促进反刍动物饲粮能量利用效率方面具有显著 的促进功效。 说 明 书 CN 103689218 A 8 。