技术领域
本发明涉及一种利用微生物对含金霉素的固体废弃物进行无害化处理的方 法，属于环境微生物与固体废弃物处理技术领域。
背景技术
金霉素(Chlortetracycline)属于四环素类抗生素，是一种广谱性抗生素， 对多种革兰氏阳性和阴性菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体等具有抑 制作用，广泛应用于畜禽养殖和水产养殖等产业当中。该类抗生素经过畜禽代 谢后，大部分以原形或母核的形式随着畜禽粪便排入环境，会对环境和人体健 康构成潜在危害。畜禽粪便中残留抗生素的环境污染及其控制日益受到关注。 另一方面，金霉素在发酵生产过程中会产生大量的固体废弃物，如金霉素菌渣， 它是金霉素发酵液经过预处理后，过滤剩余的残渣，主要由菌丝体、发酵剩余 的培养基原料、生产菌中间代谢产物、水分以及残留的金霉素等物质组成。其 营养成分丰富，尤其是蛋白质含量较高，约占干重45-55％，同时还含有脂肪、 淀粉、纤维素和多种矿质元素等物质，是一种潜在利用价值较高的固体废弃物。 然而，由于金霉素菌渣中含有金霉素残留等生物毒性物质，被我国列为危险固 体废弃物，只能通过焚烧或填埋方法进行处置。目前，生产企业大多采用焚烧方 法处置，处理成本高，难度大，弃之可惜，而且存在二次污染的潜在风险。
利用生物方法降解环境中的污染物，具有成本低、效率高、无二次污染等 优点，具有很好的发展前景。畜禽粪便中残留的金霉素通过堆肥方法进行生物 处理已有研究报道，而针对金霉素菌渣这种高毒性和强酸性(pH值为2-3)的 固体废弃物，通过生物方法对其进行无害化处理的相关研究，目前尚未见报导。 在全球面临资源和能源匮乏挑战的今天，如果能找的一条安全、经济、环保的 生物处理金霉素固体废弃物的方法，不仅对防治固体废弃物中残留金霉素的环 境污染问题具有现实意义，而且对未来的菌渣资源化利用和循环经济发展具有 重要科学价值与应用前景。
发明内容
针对金霉素菌渣固体废弃物中金霉素残留量高、生物毒性强、降解难度大 和目前所用方法处理成本高等问题，本发明旨在提供一种利用微生物对金霉素 菌渣进行无害化处理的方法。
本发明所述的一种含金霉素的固体废弃物的无害化处理方法，是以金霉素 菌渣为主要原料，添加特定的适量辅料，接种金霉素降解微生物，在特定培养 条件下，对菌渣进行生物降解处理，使菌渣中残留金霉素等生物毒性物质降解 而达到对菌渣无害化处理的系统化方法。
本发明所提供的技术方案是通过以下步骤实现的：
1、降解菌株选用与活化培养
金霉素菌渣初始pH值为2.0-3.0，金霉素含量为0.5-2.5％(占干基)，属于 一种金霉素残留浓度高且酸性强的固体废弃物。因此，菌渣生物降解处理必需 选用能耐受强酸性和高浓度金霉素的菌株，同时对金霉素具有降解能力的菌株。 本发明中选用微生物为小刺青霉、桔青霉、哈刺木霉和草酸青霉等金霉素降解 菌种，尤其以桔青霉LJ318、哈刺木霉LJ245，草酸青霉LJ302和小刺青霉LJ220 作为优选菌株，这些菌株均已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC)。菌株活化使用马丁氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基，活化条 件为：温度28-30℃，150-180r/min震荡培养24-48h，然后转接到更大容器中 继续培养，如此操作2-4代。
2、菌渣原料预处理
本发明所述新鲜菌渣初始含水量为≤80％(重量比)，新鲜菌渣的外形呈不 规则的大块颗粒状，生物处理前，需将菌渣破碎成1-5mm大小的颗粒，可根据 需要选择高温或不经过高温处理。
3、辅料选择与预处理
选择麦片、麸皮、糠皮、木屑、秸秆等农副产品作辅料，121℃灭菌20-30min。
4、原辅材料混合
以破碎后的金霉素新鲜菌渣为主要原料，添加少量辅料共同组成发酵底物， 金霉素菌渣所占比例为87.5-95.0％(按湿基量计算)，辅料添加比例为菌渣重量 的5.0-12.5％，辅料种类可选择1-3种。
5、接种与发酵处理
按原料重2-15％的接种量，将活化后的菌液(1种或多种)接种到菌渣培养 底物中，搅拌均匀，放入发酵容器或设备中。发酵容器或设备的温度设置为 18-35℃，优选28-30℃，相对湿度为90-95％。根据菌渣发酵进展情况，进行搅 拌或通空气处理，并定期取样，测定金霉素残留量、pH值以及水分等指标。
生物发酵处理后的金霉素菌渣中粗蛋白含量为54-61％(占干基)，粗灰分含 量为12-15％(占干基)，水分含量为14-30％。菌渣pH值可由发酵前的2.0-3.0 上升为发酵后的7.1-8.4，菌渣中金霉素降解率最高可达98％以上。
6、菌渣的生物毒性测定
本发明采用生物指示法测定菌渣毒性，选用微生物作为毒性测试菌，以金 黄色葡萄球菌和藤黄微球菌作为优选菌种，采用比浊法对菌渣的生物毒性进行 测定。发现添加0.1-30.0mg/ml的原菌渣提取液，培养16h时，对测试菌生长 的抑制率在80％以上，而添加0.1-30.0mg/ml发酵处理后的菌渣提取液，在相同 培养条件下，对测试菌生长没有抑制作用，甚至对测试菌的生长具有一定的促 进作用。
本发明提供的利用微生物发酵生物降解菌渣中金霉素残留的方法，操作简 便，能耗低，发酵过程容易控制，绿色环保。
本发明的有益效果：
1、利用本发明提供的方法，可降解菌渣中残留的金霉素等生物毒性物质， 减少金霉素残留对环境造成的污染与危害。
2、用本发明提供的方法处理金霉素菌渣，不需要对酸性极强的新鲜菌渣进 行pH值调节，可直接对新鲜菌渣进行生物降解处理。通过生物发酵过程，使菌 渣pH值由处理前的2.0-3.0提高到处理后的7.1-8.4，即由强酸性转变到中性 到微碱性，减少了新鲜菌渣对容器的酸性腐蚀，同时使处理后的菌渣便于储存、 运输和资源再利用。
3、用本发明提供的方法处理金霉素菌渣，其处理后菌渣含水量由原菌渣的 60-80％变为处理后的14-30％，起到了固废减量化的目的。
4、本发明提供的利用生物降解处理菌渣的方法，与目前采用的焚烧与填埋 处理菌渣方法相比，具有成本低、反应条件温和、操作简单、能耗低、发酵过 程容易控制、绿色环保、降解金霉素效率高等优点。菌渣经生物降解处理后， 其金霉素含量大幅度降低。处理后的金霉素菌渣有望作为一种新的潜在蛋白质 资源进行资源回用和深度开发利用。
5、本发明提供的生物降解方法可望应用于四环素和土霉素菌渣的生物降 解处理，以及畜禽粪便和周边土壤污染环境的生物修复处理，对于发酵制药行业 其他菌渣的处理也具有较好的借鉴价值。
附图说明
图1为金霉素高效降解菌株对菌渣中金霉素的降解率曲线。
图2为添加菌渣提取液培养16h对金黄色葡萄球菌生长的抑制率曲线。
具体实施方式
本发明的具体实施方式由以下实例加以说明，但本发明不局限于这些实施 例。
实施例1金霉素新鲜菌渣的主要成分测定
对金霉素新鲜菌渣的初始含水量、pH值和金霉素残留量进行了测定，由测 定结果得知金霉素新鲜菌渣初始含水量≤80％(60-80％)(重量比)，pH为2.0-3.0， 金霉素含量为0.5-2.5％(占干基)。
含水量测定方法：采用105℃烘干法。
pH值测定方法：采用酸度计测定。
金霉素含量测定方法：采用高效液相色谱(HPLC)法。具体操作为：准确 称取2.0000g菌渣，研磨，加20mL丙酮提取液，超声30min，用0.22μm滤膜过 滤。利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量并计算出的降解率。
HPLC条件为：
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙二酸溶液(0.01mol/L)∶乙腈∶ 甲醇体积比为10∶3∶2；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：10μL；检测 波长：375nm。
实施例2一种金霉素菌渣生物处理方法
该方法主要包括如下步骤：
1、降解菌株选择与菌株活化培养
根据金霉素新鲜菌渣pH值低和金霉素残留量高的特征，选用哈茨木霉 (Hypocrea lixii)，草酸青霉(Penicillium oxalicum)，桔青霉(Penicillium citrinum)和小刺青霉(Penicillium spinulosu)等金霉素降解菌种，以哈刺木霉 (Hypocrea lixii)LJ245(CGMCC NO.5753)，桔青霉(Penicillium citrinum)LJ318 (CGMCC NO.5850)，草酸青霉(Penicillium oxalicum)LJ302(CGMCC NO.7019) 和小刺青霉(Penicillium spinulosu)LJ220(CGMCC NO.5754)作为优选菌株。配 制马丁氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基，对菌株进行活化培养，培养条件为 28-30℃，150-180r/min震荡培养24-48h，然后转接到体积更大容器中继续培 养，如此操作2-4代。
马丁氏培养基配制：蛋白胨6.0g，葡萄糖10.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，溶于1000ml蒸馏水中，分装，115℃灭菌15-20min。
马铃薯葡萄糖培养基配制：将马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加水 1000ml，煮沸20-30分钟，用纱布过滤，加入20g葡萄糖，补足水分至1000ml， 分装，115℃灭菌15-20min。
2、菌渣原料预处理
金霉素新鲜菌渣原料外形为不规则的大块颗粒，在生物处理之前，需将菌 渣破碎成1-5mm大小的小颗粒。
3、辅料选择与预处理
选择麦片、麸皮、糠皮、木屑、秸秆等农副产品等作辅料，121℃灭菌 20-30min。
4、原辅材料混合
以破碎后的金霉素新鲜菌渣为主要原料，添加少量辅料共同组成发酵底物， 金霉素菌渣所占比例为87.5-95.0％(按湿基量计算)，辅料添加比例为菌渣重量 的5.0-12.5％，辅料种类可选择1-3种。
5、接种与发酵处理
将活化后菌液(1种或多种)按2-15％接种量接种到菌渣培养底物中，搅拌 均匀后，放入发酵容器或设备中。发酵温度设置为18-35℃，优选28-30℃，相 对湿度为90-95％。根据菌渣发酵进展情况，进行搅拌或通空气处理，定期取样 测定金霉素残留量。
6、成分测定
采用高效液相色谱法对菌渣中金霉素残留量进行测定，并计算金霉素降解 率。图1为高效降解菌株对菌渣中金霉素的降解率曲线。由图1可知，在前7 天金霉素降解速率较快，在发酵的第7天金霉素降解率可达到80％以上，在发酵 30-40天，降解率在98％以上。
另外，对发酵处理后菌渣中的水分和粗蛋白含量等指标进行了测定。由测 定结果得知，发酵处理后菌渣中水分含量为14-30％，粗蛋白含量为54-61％(占 干基)，粗灰分含量为12-15％(占干基)。由此可知，发酵处理后菌渣是一种潜 在利用价值高的蛋白质资源。
7、菌渣的生物毒性测定
本发明采用生物指示法测定菌渣毒性，选用微生物作为毒性测试菌，以金 黄色葡萄球菌和藤黄微球菌作为优选菌种。根据我国2010年版《中华人民共和 国兽药典》附录XI中介绍的抗生素微生物检定法，采用比浊法，测定菌渣对受 试菌如金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌毒性程度。
具体操作方法为：用磷酸盐缓冲液提取菌渣，获得菌渣提取液。在III号培 养基中，分别加入不同梯度的菌渣提取液，并以添加相同量的磷酸盐缓冲液做 对照(CK)，分别加入测试菌，在28-35℃的摇床中培养，定期取样测定培养液 的吸光值(OD600)，并计算OD600抑制率。抑制率计算公式为：
抑制率(％)＝(对照OD600-处理OD600)/对照OD600×100
图2为添加菌渣提取液培养16h对金黄色葡萄球菌生长的抑制率。由图2 可知，在培养基中分别添加浓度为0.1-30.0mg/ml的原菌渣提取液，培养16h，各 浓度对金黄色葡萄球菌生长均有较大抑制作用，抑制率均在80％以上；而添加 0.1-30.0mg/ml发酵处理后菌渣的提取液，培养16h，其对金黄色葡萄球菌生长 没有抑制作用，反而表现出一定的促进生长作用。
III号培养基配方为：蛋白胨5.00g，牛肉浸出粉1.50g，酵母浸出粉3.00g， 氯化钠3.50g，磷酸氢二钾3.68g，磷酸二氢钾1.32g，葡萄糖1.00g，水1000ml。
磷酸缓冲液配方：磷酸氢二钾2.00g，磷酸二氢钾8.00g，蒸馏水1000ml。
实施例3一种金霉素菌渣生物处理方法
该方法主要包括如下步骤：
1、菌种制备
将降解金霉素的微生物菌种如小刺青霉、桔青霉、哈刺木霉和草酸青霉等， 分别接种于马丁氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基中，置于28-30℃， 150-170r/min震荡条件下培养24-48h，然后转接入体积更大容器中继续培养， 如此操作2-4代。马丁氏培养基与马铃薯葡萄糖培养基配制方法同实施例2。
2、菌渣原料预处理
将金霉素新鲜菌渣由大块颗粒，破碎成1-5mm大小的颗粒。然后放入高压 蒸汽灭菌锅中，在121℃处理20min-30min。以不经过高温处理菌渣作对照。
3、辅料准备等后面步骤同实施例2。
采用高效液相色谱对菌渣中金霉素残留量进行测定。由测定结果得知，菌 渣经高温处理后，菌渣中的金霉素含量降低。以高温处理和未处理菌渣为主要 原料，接种微生物进行发酵处理，发现经高温处理后菌渣中金霉素残留量低于 未经过高温处理的菌渣。高温处理后的菌渣经发酵后，金霉素残留量可降低到 检出限0.1mg/Kg以下。
实施例4金霉素菌渣发酵过程中pH值变化
对菌渣生物发酵过程中的pH值进行了测定，由测定结果(见表1)得知， 新鲜原菌渣的初始pH值为2.0-3.0，随着发酵进程，菌渣pH值可升高至7.1-8.4。
表1菌渣发酵过程中pH值变化
pH值的测定方法：精密称量取样品2.0000g，加入蒸馏水10ml，超声30min， 取上清液，用酸度计测定pH值。