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1、10申请公布号CN104130979A43申请公布日20141105CN104130979A21申请号201410359232622申请日20140725CCTCCNOC201410220140528C12N5/20200601C07K16/12200601G01N33/577200601G01N33/56920060171申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市卫岗1号72发明人陆兆新李远宏陈启明吕凤霞别小妹赵海珍74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人李纪昌唐循文54发明名称阪崎肠杆菌单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用57摘要本发明公开了一种阪崎肠杆菌单克隆抗体、杂交。
2、瘤细胞株及应用；通过基因工程的方法以及杂交瘤技术得到了杂交瘤细胞株C232C（保藏号为CCTCCNOC2014102），并获得了以阪崎肠杆菌OMPA为抗原的单克隆抗体，同时设计出了基于该单克隆抗体的酶联免疫检测试剂盒，通过该试剂盒可以简便、快速而又经济的实现食品、临床及环境检测领域中阪崎肠杆菌的免疫学检测，特别适合于大量样本的初步筛查。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页10申请公布号CN104130979ACN104130979A1/1页21一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏于中国典型。
3、培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞株C232C，保藏号为CCTCCNOC2014102。2一种阪崎肠杆菌单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备得到。3一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行（1）阪崎肠杆菌OMPA蛋白的制备采用PCR技术从阪崎肠杆菌基因组中扩增OMPA，克隆至表达载体中，IPTG诱导表达重组蛋白OMPA，经纯化后作为免疫原；（2）动物免疫、细胞融合和杂交瘤细胞的选择采用步骤（1）中的免疫原，对实验动物进行注射免疫，免疫后取实验动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞在融合剂存在的条件下进行细胞融合，测定效价，筛选细胞株，得到稳定分泌单克。
4、隆抗体的杂交瘤细胞株；（3）分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株选择1）通过将参考菌株接种培养于LB或NB液体培养基中，在30或37下培养12H后，分别将参考菌株培养液离心收集菌体，用PBS缓冲液冲洗后加入甲醛进行灭活菌体，调整各菌体浓度至108CFU/ML，获得阪崎肠杆菌及阴性参考菌株的细胞悬液；2）分别将以上参考菌株的细胞悬液包被酶标板，包被浓度为106CFU/ML，检测方法为间接ELISA法，检测和筛选得到杂交瘤细胞株C232C。4一种权利要求2所述的阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用体内诱生腹水法将权利要求1所述的杂交瘤细胞株注射到预先注射石蜡的实验动物腹腔内，回收腹水并从。
5、中获得抗体，再用饱和硫酸铵或亲和层析法纯化腹水中的单克隆抗体。5根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（1）中表达载体为PET32A（），纯化为镍离子亲和层析技术纯化。6根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）中实验动物为BALB/C小鼠。7根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（2）中骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞；融合剂为聚乙二醇，测定效价的方法为间接ELISA法。8根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的参考菌株为粘质沙雷氏菌（SERRATIAMARCESCENSCICC10。
6、187）、肠炎沙门氏菌（SALMONELLAENTERITIDISCICC21482）、凝结芽孢杆菌（BACILLUSCOAGULANSCICC20139）、金黄葡萄球菌（STAPHYLOCCOCUSAUREUSAS12465）、藤黄微球菌（MICROCOCCUSAUREUSAS1191）、蜡样芽胞杆菌（BACILLUSCEREUSAS11846）、阴沟肠杆菌（ENTEROBACTERCLOACAEATCC13047）、大肠杆菌ESCHERICHIACOLIBL21、阪崎肠杆菌CRONOBACTERSAKAZAKIIATCC29544或阪崎肠杆菌CRONOBACTERMUYTJENSIIATC。
7、C51329中的一种或几种。9一种免疫检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的阪崎肠杆菌单克隆抗体。10权利要求9所述的免疫检测试剂盒在检测阪崎肠杆菌中的用途。权利要求书CN104130979A1/6页3阪崎肠杆菌单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阪崎肠杆菌单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。背景技术0002阪崎肠杆菌ENTEROBACTERSAKAZAKII，现克罗诺杆菌CRONOBACTERSPP，是奶粉中新发现的一种食源性条件致病菌。该菌能引起新生儿及婴幼儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等疾病，死亡率高达4080。阪崎肠杆菌能引起各年龄段。
8、人群感染，尤其是对早产儿、出生体重偏低、免疫力低下的婴幼儿造成的危害是不可逆的。国际食品微生物标准委员会将其定为“严重危害特定人群，威胁生命或导致慢性实质性后遗症”的细菌。0003研究发现阪崎肠杆菌广泛的存在于自然界中，目前已经从婴幼儿配方奶粉、奶酪、UHT杀菌乳、谷类食物、香肠、香辛料、蔬菜等食品中发现了阪崎肠杆菌。此外，阪崎肠杆菌还广泛存在于医疗环境中，食品加工厂各种仪器以及环境中。阪崎肠杆菌的广泛存在严重的威胁了人类的生命健康，因此迫切需要建立一些简单、高效、快速、准确的阪崎肠杆菌检测方法。0004目前，应用于阪崎肠杆菌检测领域的方法主要有传统的微生物培养法和PCR检测方法。但是这些方法。
9、都存在检测周期长、操作繁琐等缺点，因而实现难以对污染源的快速诊断。近年来，微生物快速检测技术取得了突飞猛进的发展，其中基于单克隆抗体的免疫学检测方法呈现出了良好的应用前景。免疫学检测方法依赖于抗原和抗体间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量检测。免疫学检测技术具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品、操作简单等特点，特别适合于大批量样本的检测，已广泛应用于食源性致病微生物的快速检测。0005酶联免疫吸附检测方法ENZYMELINKEDIMMUOSORBENTASSAY，ELISA是目前免疫学检测方法中应用最为广泛，技术最为成熟的方法。ELISA以酶或者辅。
10、酶作为标记物，标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，并且利用聚苯乙烯微量反应板吸附抗原或者抗体，使其固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。ELISA具有选择性好、结果判断客观准确、实用性强、样品处理量大等优点，弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试手段的不足。ELISA可以应用于致病菌快速检测，关于沙门氏菌、单增生李斯特菌的ELISA检测方法已经应用于食品的检测中。0006然而国内外针对阪崎肠杆菌单克隆抗体的研究较少，迫切需要一种能够特异性识别阪崎肠杆菌的单克隆抗体制备技术，并将该单克隆抗体应用于ELISA检测技术，以实现对食品、临床及环境中阪崎肠杆菌的检测和监测。阪崎肠杆。
11、菌的外膜蛋白AOUTERMEMBRANEPROTEINA，OMPA在遗传上具有较高的保守性，并且暴露于菌体表面，具有高的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，而且还可诱导细胞介导的免疫应答，因而可作为一种良好的免疫原。说明书CN104130979A2/6页4发明内容0007技术问题0008针对现有检测技术存在的不足，本发明的目的是通过基因工程的方法以及杂交瘤技术得到杂交瘤细胞株，并获得以阪崎肠杆菌OMPA为抗原的单克隆抗体，同时设计出了基于该单克隆抗体的酶联免疫检测试剂盒，为实现对阪崎肠杆菌的快速、灵敏、高通量的快速检测提供了检测手段与方法。0009技术方案0010本发明是通过以下技术手段实现的。
12、0011一种杂交瘤细胞株，于2014年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞株C232C，保藏号为CCTCCNOC2014102，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编为430072。0012一种阪崎肠杆菌单克隆抗体，由以上所述的杂交瘤细胞株制备得到。0013一种以上所述的杂交瘤细胞株的制备方法，按照以下步骤进行00141阪崎肠杆菌OMPA蛋白的制备采用PCR技术从阪崎肠杆菌基因组中扩增OMPA，克隆至表达载体中，IPTG诱导表达重组蛋白OMPA，经纯化后作为免疫原；00152动物免疫、细胞融合和杂交瘤细胞的选择采用步骤1中的免疫原，对实验动物进行注射免疫，免疫后取实验动物的脾。
13、脏细胞与骨髓瘤细胞在融合剂存在的条件下进行细胞融合，测定效价，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；00163分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株选择00171通过将参考菌株接种培养于LB或NB液体培养基中，在30或37下培养12H后，分别将参考菌株培养液离心收集菌体，用PBS缓冲液冲洗后加入甲醛进行灭活菌体，调整各菌体浓度至108CFU/ML，获得阪崎肠杆菌及阴性参考菌株的细胞悬液；00182分别将以上参考菌株的细胞悬液包被酶标板，包被浓度为106CFU/ML，检测方法为间接ELISA法，检测和筛选得到杂交瘤细胞株C232C。0019一种以上所述的阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备方法，采。
14、用体内诱生腹水法将权利要求1所述的杂交瘤细胞株注射到预先注射石蜡的实验动物腹腔内，回收腹水并从中获得抗体，再用饱和硫酸铵或亲和层析法纯化腹水中的单克隆抗体。0020以上所述的杂交瘤细胞株的制备方法，步骤1中表达载体可以为PET32A，纯化可以为镍离子亲和层析技术纯化。0021以上所述的杂交瘤细胞株的制备方法，步骤2和步骤4中实验动物可以为BALB/C小鼠。0022以上所述的杂交瘤细胞株的制备方法，步骤2中骨髓瘤细胞可以为SP2/0骨髓瘤细胞；融合剂可以为聚乙二醇，测定效价的方法可以为间接ELISA法。0023以上所述的杂交瘤细胞株的制备方法，步骤3中的参考菌株可以为粘质沙雷氏菌SERRATIA。
15、MARCESCENSCICC10187、肠炎沙门氏菌SALMONELLAENTERITIDISCICC21482、凝结芽孢杆菌BACILLUSCOAGULANSCICC20139、金黄葡萄球菌STAPHYLOCCOCUSAUREUSAS12465、藤黄微球菌MICROCOCCUSAUREUSAS1191、蜡样芽胞杆菌BACILLUSCEREUSAS11846、阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAEATCC13047、说明书CN104130979A3/6页5大肠杆菌ESCHERICHIACOLIBL21、阪崎肠杆菌CRONOBACTERSAKAZAKIIATCC29544或阪崎肠杆菌C。
16、RONOBACTERMUYTJENSIIATCC51329中的一种或几种。0024一种免疫检测试剂盒，含有以上所述的阪崎肠杆菌单克隆抗体。0025以上所述的免疫检测试剂盒在检测阪崎肠杆菌中的用途。0026有益效果0027本发明通过基因工程的方法以及杂交瘤技术得到了杂交瘤细胞，并获得了以阪崎肠杆菌OMPA为抗原的单克隆抗体，设计出了以识别阪崎肠杆菌OMPA抗原的单克隆抗体为基础的诊断阪崎肠杆菌试剂盒，至今尚未有以该抗原制备单克隆抗体而研制的诊断试剂盒的相关报道。0028本发明制备的阪崎肠杆菌OMPA抗原的单克隆抗体特异性强，纯度高，可用于阪崎肠杆菌的免疫学检测。本发明建立的阪崎肠杆菌ELISA检。
17、测方法操作简便、费用低廉、处理量大、缩短了检测周期，提高检测效率，适用于食品及环境检测领域中阪崎肠杆菌的免疫检测，特别适合大量样本的筛查，具有广阔的发展前景。附图说明0029图1为实施例1腹水中单克隆抗体的纯化和纯度SDSPAGE图。具体实施方式0030实施例1阪崎肠杆菌OMPA单克隆抗体的制备00311阪崎肠杆菌OMPA蛋白的制备0032采用PCR技术从阪崎肠杆菌基因组中扩增OMPA，克隆至表达载体PET32A中，IPTG诱导表达重组蛋白OMPA，经镍柱亲和层析柱纯化后即可作为免疫BALB/C小鼠的抗原。00332动物免疫和细胞融合0034以纯化的阪崎肠杆菌外膜蛋白OMPA为免疫原，对56只。
18、鼠龄为812周的BALB/C健康雌性小鼠进行背部和四肢皮下注射免疫。免疫前取未经免疫的BALB/C小鼠血清作为阴性对照NEG。每次免疫时取免疫原与等量的弗氏佐剂制成混合乳化剂，首次免疫后分别于第21、35和47天加强免疫一次，免疫剂量为300L/只，免疫方案见表1。免疫过程中，定期从免疫小鼠的尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检测血清中抗体效价。小鼠血清测定效价较高后，再加强免疫一次，免疫剂量为300L/只。35天后取小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞101混合，用50聚乙二醇1450融合，以HAT选择培养基培养杂交瘤细胞。0035表1免疫方案0036说明书CN104130979A4。
19、/6页600373杂交瘤细胞的选择0038在融合后的814天，采用间接ELISA法测定细胞上清液中抗体效价。取100L的融合细胞的培养上清液加至预先包被有106CFU/ML阪崎肠杆菌菌体的酶标板中，37温育30MIN。用PBST内含005TWEEN20的001MPH74磷酸盐缓冲溶液洗涤酶标板3次，每次3MIN。于每孔中加入100L辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IGG，37温育30MIN。PBST洗涤酶标板3次，每次3MIN。再加入底物溶液购自INVITROGEN公司100L，室温避光反应5MIN。每孔滴加50L终止液2MH2SO4终止反应，酶标仪测定450NM下的吸光值。有限稀释法对阳性克隆进行。
20、34次克隆，直到阳性克隆孔100分泌单克隆抗体。通过有限稀释法纯化后，结果发现共获得35株可稳定分泌的杂交瘤细胞株。00394分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株选择00401菌悬液制备0041将粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESCENSCICC10187、肠炎沙门氏菌SALMONELLAENTERITIDISCICC21482、凝结芽孢杆菌BACILLUSCOAGULANSCICC20139、金黄葡萄球菌STAPHYLOCCOCUSAUREUSAS12465、藤黄微球菌MICROCOCCUSAUREUSAS1191、蜡样芽胞杆菌BACILLUSCEREUSAS11846、阴沟肠杆菌ENTERO。
21、BACTERCLOACAEATCC13047、大肠杆菌ESCHERICHIACOLIBL21DE3、阪崎肠杆菌CRONOBACTERSAKAZAKIIATCC29544和阪崎肠杆菌CRONOBACTERMUYTJENSIIATCC51329分别接种于LB或NB液体培养基中，在30或37条件下培养约12H后，分别将上述菌株培养液于5000R/MIN离心5MIN，收集菌体，用10ML001MPH74PBS缓冲液洗涤菌体3次，悬浮菌体并加入终浓度为05甲醛于4保持2D灭活菌体，调整各菌体浓度至108CFU/ML。以此获得阪崎肠杆菌及阴性参考菌株的细胞悬液。00422单克隆抗体的特异性测定0043分别。
22、以上述菌株的菌悬液包被酶标板，包被浓度为106CFU/ML。具体测定方法同以上测定用的间接ELISA法。经检测和筛选最终获得了1株特异性较强且能稳定分泌的杂交瘤细胞株，分别命名为32B6，分泌的单克隆抗体命名为2B6表2。每株细胞均进行克隆并冻存68支。将32B6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞株C232C，保藏号CCTCCNOC2014102。0044表2间接ELISA法测定杂交瘤细胞株特异性检测结果0045说明书CN104130979A5/6页70046注CRS阪崎肠杆菌ATCC29544；CRM阪崎肠杆菌ATCC51329；SEM粘质沙雷氏菌CICC10187；SAE肠。
23、炎沙门氏菌CICC21482；BAC凝结芽孢杆菌CICC20139；SAA金黄葡萄球菌AS12465；MIA藤黄微球菌AS1191；BAC蜡样芽胞杆菌AS11846；ENC阴沟肠杆菌ATCC13047；ESC大肠杆菌BL21DE3；NEG培养液阴性对照；PBS磷酸盐缓冲液。00475单抗的大量制备及纯化00481单抗的大量制备0049采用体内诱生腹水法。在接种能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株前一周，预先给雌性BALB/C小鼠腹腔注射灭菌的液体石蜡，每只05ML。调整杂交瘤细胞株细胞密度至106107个/ML，每只小鼠腹腔注射05ML。约710天以后，小鼠腹腔明显膨大，行动缓慢，此时即可收集小。
24、鼠腹水中的单克隆抗体。00502单抗纯化0051将收集的腹水12000G离心15MIN，弃去表层油脂，上清备用。采用PROTEING蛋白亲和层析柱，将上清液中的单克隆抗体与10倍体积的001MPH74PBS缓冲液混合稀释后上样。用001MOL/LPH76的磷酸缓冲液510CV洗脱杂蛋白，杂蛋白洗脱完后再用01MOL/LPH27的甘氨酸盐酸缓冲液25CV洗脱，分别收集洗脱峰，再用001MPH74PBS缓冲液透析过夜，期间换液3次，收集透析袋内的液体，20保存备用。并进行SDSPAGE电泳分析图1。0052实施例2阪崎肠杆菌的间接ELISA法酶联免疫试剂盒00531组建检测阪崎肠杆菌间接ELISA。
25、法酶联免疫试剂盒，使其包括以下几个组分00541包被的含有阪崎肠杆菌标准品溶液浓度分别为109CFU/ML、108CFU/ML、107CFU/ML、106CFU/ML、105CFU/ML、104CFU/ML、0CFU/ML的酶标板；00552包被缓冲液为00101MPH96的碳酸氢钠溶液；00563洗涤液为含有00501吐温20、PH为7276的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比。00574封闭液为含有055BSA、PH为7276的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比。00585阪崎肠杆菌OMPA单克隆抗体工作液；00596用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液；00607底物显色液由A液。
26、1040H2O2和B液组成质量浓度为055的3,3,5,5四甲基苯丙胺溶液；00618终止液为055MH2SO4溶液。00622阪崎肠杆菌间接ELISA法酶联免疫试剂盒检测流程说明书CN104130979A6/6页80063以市售婴幼儿配方奶粉为例，用上述组建的阪崎肠杆菌的酶联免疫试剂盒测定食品中的阪崎肠杆菌，具体步骤如下00641取检样110G加入已预热至3044装有50500MLBPW的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，3040培养612H。00652设置标准品孔、空白孔和样本孔，用包被缓冲液分别包被不同浓度的标准品和样本100L；4过夜包被或者3037包被054H。00663洗涤液洗涤。
27、酶标板35次，每次15MIN也可用洗板机洗板，再添加封闭液50200L，3037温育052H。00674洗涤液洗涤酶标板35次，每次15MIN也可用洗板机洗板，再添加阪崎肠杆菌OMPA单克隆抗体工作液100L，37温育1H。00685随后每孔加入辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔抗抗体10100L，3037温育051H。00696每孔加入底物A、B各10100L，3037避光孵育510MIN。00707每孔加入终止液10100L，515MIN内，在450NM波长处测定各孔的OD值。00718结果判定绘制标准曲线在EXCEL工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲。
28、线，按曲线方程计算各样本浓度值。00723交叉反应测定0073将粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESCENSCICC10187、肠炎沙门氏菌SALMONELLAENTERITIDISCICC21482、凝结芽孢杆菌BACILLUSCOAGULANSCICC20139、金黄葡萄球菌STAPHYLOCCOCUSAUREUSAS12465、藤黄微球菌MICROCOCCUSAUREUSAS1191、蜡样芽胞杆菌BACILLUSCEREUSAS11846、阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAEATCC13047、大肠杆菌ESCHERICHIACOLIBL21DE3菌液稀释成106CFU/M。
29、L，利用阪崎肠杆菌间接ELISA法酶联免疫试剂盒测定吸光值，并以阪崎肠杆菌CRONOBACTERSAKAZAKIIATCC29544和阪崎肠杆菌CRONOBACTERMUYTJENSIIATCC51329菌液作为阳性对照，同时设定空白孔，试验重复3次取平均值。结果阪崎肠杆菌CRONOBACTERSAKAZAKIIATCC29544和阪崎肠杆菌CRONOBACTERMUYTJENSIIATCC51329的OD450分别为0935和0861，而其它菌株OD450均小于020。表明本发明提供的阪崎肠杆菌间接ELISA法酶联免疫试剂盒具有优异的特异性。0074实施例3阪崎肠杆菌间接ELISA法酶联免疫。
30、试剂盒在食品中的应用0075以婴幼儿配方食品、谷类食品等70份样品作为样本，利用上述间接ELISA法酶联免疫试剂盒，并与阪崎肠杆菌国家标准GBT4789402008进行对比。试验结果表明按照阪崎肠杆菌国家标准中的方法检出9份阳性样本，61份阴性样本，检出率为1286；而间接ELISA法酶联免疫试剂盒仅检出9份阳性样本中的8份，其余62份样本均为阴性，检出率为1143。据此推算出阪崎肠杆菌间接ELISA法酶联免疫试剂盒的准确率为9857。0076本发明提供的阪崎肠杆菌间接ELISA法酶联免疫试剂盒可以简便、快速而又经济的实现食品、临床及环境检测领域中阪崎肠杆菌的免疫学检测，特别适合于大量样本的初步筛查。说明书CN104130979A1/1页9图1说明书附图CN104130979A。