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1、10申请公布号CN104120193A43申请公布日20141029CN104120193A21申请号201410309229322申请日20140701C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号72发明人吴青君赵巍巍张治军徐宝云谢文王少丽张友军74专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司11129代理人吴泳历54发明名称用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法57摘要本发明涉及一种用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法，属于植物病毒。
2、检测领域。本发明以番茄斑萎病毒为研究对象，建立了更加快速、简便、准确、灵敏的植物病毒定量检测方法，包括如下步骤1根据标准质粒建立标准曲线；2获得待测样品CDNA；反转录合成CDNA；并以CDNA为模板、TSWV113F/TSWV113R引物进行荧光定量PCR，得到待测样品的CT值；3利用标准曲线计算待测样品中番茄斑萎病毒的拷贝数。该方法能够在45小时内对样品中的番茄斑萎病毒进行准确定量，不仅节约了时间、简化了实验步骤，还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施，防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。51INTCL权利要求书2页说明书7页序列表3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书2页说明书7页序列表3页附图3页10申请公布号CN104120193ACN104120193A1/2页21一种对疑似感染番茄斑萎病毒的待测植物样品进行斑萎病毒绝对定量的方法，包括如下步骤1制备斑萎病毒质粒标准品标准曲线，步骤如下以确定感染番茄斑萎病毒的植物为阳性样品，提取总RNA，反转录成阳性样品CDNA；以阳性样品CDNA为模板、以番茄斑萎病毒特异性引物TSWV482F/TSWV482R扩增番茄斑萎病毒特异性片段；回收该特异性片段并克隆到常用骨架载体中得到质粒标准品；测质粒标准品的浓度，根据质粒的拷贝数COPIES/UL6021023COPIES/MOL质粒浓度G/。
4、UL/质粒分子质量G/MOL，得出质粒标准品的病毒拷贝数；梯度地稀释质粒标准品，以荧光定量引物TSWV113F/TSWV113R对不同浓度的质粒标准品进行荧光定量PCR，得出各浓度质粒标准品的CT值；以各浓度质粒标准品对应的病毒拷贝数的对数值为横坐标，以CT值为纵坐标建立标准曲线；所述番茄斑萎病毒特异性引物TSWV482F/TSWV482R，序列为5TCTGGTAGCATTCAACTTCA3，5CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3；所述荧光定量引物TSWV113F/TSWV113R的序列为5CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG3/5TCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC。
5、3；2提取所述待测植物样品的总RNA，反转录合成CDNA；并以CDNA为模板、TSWV113F/TSWV113R引物进行荧光定量PCR，得到待测植物样品的CT值；将所述CT带入所述标准曲线中计算待测植物样品中番茄斑萎病毒的拷贝数。2根据权利要求1所述的方法，所述荧光定量PCR的体系为模板1UL，2SUPERREALPREMIXPLUS10UL，10UMOL/L荧光定量引物TSWV113F/TSWV113R各05UL，50ROXREFERENCEDYE5UL，RNASEFREEDDH2O3UL，总体积20UL。3根据权利要求2所述的方法，所述荧光定量PCR的反应条件为95预变性15MIN，95变。
6、性10S，60退火32S，72延伸32S，40个循环。4根据权利要求1所述的方法，所述测质粒标准品的浓度采用NANODROP2000C。5根据权利要求1所述的方法，所述常用骨架载体指PMDTM18T。6权利要求15任一所述的方法在番茄斑萎病毒绝对定量中的应用。7用于检测番茄斑萎病毒的特异性PCR引物，其核苷酸序列为TSWV482F5TCTGGTAGCATTCAACTTCA3；TSWV482R5CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3。8用于检测待测样品是否携带番茄斑萎病毒的方法，包括如下步骤1提取待测样品的RNA，反转录合成CDNA定量到1NG/UL；2以反转录合成的CDNA为模板进行PC。
7、R反应，得到扩增产物；PCR反应的引物为TSWV482F/TSWV482R5TCTGGTAGCATTCAACTTCA3/5CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3；3琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物的大小为482BP，则待测样品中携带番茄斑萎病毒；若扩增产物的大小不是482BP，则待测样品中未携带番茄斑萎病毒；所述PCR反应的体系为CDNA模板2UL、TSWV482F05UL、TSWV482R05UL、2ESTAP权利要求书CN104120193A2/2页3MASTERMIX10UL、DDH2O7UL，总体积20UL；所述PCR反应的条件为94预变性5MIN，94变性30S、58退火。
8、45S、72延伸45S，40个循环，最后72延伸5MIN。权利要求书CN104120193A1/7页4用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法技术领域0001本发明属于植物病毒检测领域，具体地涉及一种用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法。背景技术0002番茄斑萎病毒TOMATOSPOTTEDWILTVIRUS，TSWV是布尼亚病毒科BUNYAVIRIDAE番茄斑萎病毒属TOSPOVIRUS代表性成员之一，该病毒粒子近似球形，直径大约为80110NM，其中外膜为2025NM，核壳体直径为60NM，具有膜包被的三分体单链RNALRNA，MRNA，SRNA基因组，编码。
9、4种结构蛋白，三个片段的5和3末端共有8个保守互补碱基，可形成假环状结构。LRNA89KB含有一个开放阅读框OPENREADINGFRAME，ORF，编码病毒RNA依赖性聚合酶蛋白RDRP。MRNA48KB和SRNA29KB为双义RNA，其中MRNA病毒链编码非结构蛋白NSM，互补链编码糖蛋白G1，G2的前体蛋白；SRNA病毒链编码非结构蛋白NSS，互补链编码核壳体蛋白NUCLEOCAPSIDPROTEIN，N。在自然界中，TSWV从植物到植物的传播几乎完全由西花蓟马通过持久的繁殖方式传播。0003TSWV于1915年由BRITTLEBANK在澳大利亚首次发现，现已广泛分布在世界上多个国家和地。
10、区，侵染烟草、花生、辣椒、番茄、大豆、莴苣、菊花等900多种植物。它能够对不同的花卉和蔬菜作物造成严重的经济损失，以其广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界性危害最大的十种植物病毒之一。目前，植物病毒病害的防控最为主要的环节就是植物病毒的检测监控。0004从最初的直接观察到现在众多技术被应用于植物病毒的检测，如血清学技术，电子显微镜技术，分子生物学技术等。但随着检测要求和标准的不断提高，这些常规技术越来越难以满足研究的要求，如传统血清学ELISA方法检测样品通常需要12天，传统PCR需要耗时78个小时。而实时荧光定量RTQPCR是一种相比于常规PCR灵敏度更高，更特异的定量工具，该方法。
11、从样品的提取到结果分析时间仅为45个小时，不失为一种快速的检测手段，且获得的定量数据是可高度重复的。此技术已广泛应用于基因的表达或调控，以及定量特定的核酸在不同寄主或病原体中的相对和绝对拷贝数，该技术在植物组织的病毒检测中已显示出绝对的优势。0005荧光定量的检测方法分为相对定量和绝对定量，相对定量是分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较，是对目的基因定性的一种方法。而绝对定量是对未知样品的绝对量拷贝数进行测定的方法，不仅能对目的基因进行定性，更主要的是能定量，对病毒的检测更灵敏准确。发明内容0006本发明提供一种番茄斑萎病毒检测及绝。
12、对定量的引物和方法，以番茄斑萎病毒为研究对象，建立了更加快速、简便、准确、灵敏的植物病毒定量检测方法。说明书CN104120193A2/7页50007本发明要求保护的技术方案如下0008一种对疑似感染番茄斑萎病毒的待测植物样品进行斑萎病毒绝对定量的方法，包括如下步骤00091制备斑萎病毒质粒标准品标准曲线，步骤如下0010以确定感染番茄斑萎病毒的植物为阳性样品，提取总RNA，反转录成阳性样品CDNA；以阳性样品CDNA为模板、以番茄斑萎病毒特异性引物TSWV482F/TSWV482R扩增番茄斑萎病毒特异性片段；回收该特异性片段并克隆到常用骨架载体中得到质粒标准品；0011测质粒标准品的浓度，根。
13、据质粒的拷贝数COPIES/UL6021023COPIES/MOL质粒浓度G/UL/质粒分子质量G/MOL，得出质粒标准品的病毒拷贝数；0012梯度地稀释质粒标准品，以荧光定量引物TSWV113F/TSWV113R对不同浓度的质粒标准品进行荧光定量PCR，得出各浓度质粒标准品的CT值；0013以各浓度质粒标准品对应的病毒拷贝数的对数值为横坐标，以CT值为纵坐标建立标准曲线；0014所述番茄斑萎病毒特异性引物TSWV482F/TSWV482R，序列为00155TCTGGTAGCATTCAACTTCA3，00165CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3；0017所述荧光定量引物TSWV113。
14、F/TSWV113R的序列为00185CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG3/5TCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC3；00192提取所述待测植物样品的总RNA，反转录合成CDNA；并以CDNA为模板、TSWV113F/TSWV113R引物进行荧光定量PCR，得到待测植物样品的CT值；将所述CT带入所述标准曲线中计算待测植物样品中番茄斑萎病毒的拷贝数。0020所述荧光定量PCR的体系为模板1UL，2SUPERREALPREMIXPLUS10UL，10UMOL/L荧光定量引物TSWV113F/TSWV113R各05UL，50ROXREFERENCEDYE5UL，RNASEFRE。
15、EDDH2O3UL，总体积20UL。0021所述荧光定量PCR的反应条件为95预变性15MIN，95变性10S，60退火32S，72延伸32S，40个循环。0022所述测质粒标准品的浓度采用NANODROP2000C。0023所述常用骨架载体指PMDTM18T。0024上述任一方法在番茄斑萎病毒绝对定量中的应用。0025用于检测番茄斑萎病毒的特异性PCR引物，其核苷酸序列为0026TSWV482F5TCTGGTAGCATTCAACTTCA3；0027TSWV482R5CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3。0028用于检测待测样品是否携带番茄斑萎病毒的方法，包括如下步骤00291提取待测。
16、样品的RNA，反转录合成CDNA定量到1NG/UL；00302以反转录合成的CDNA为模板进行PCR反应，得到扩增产物；PCR反应的引物为TSWV482F/TSWV482R00315TCTGGTAGCATTCAACTTCA3/5CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3；00323琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物的大小为482BP，则待测样品中携带番茄斑萎病毒；若扩增产物的大小不是482BP，则待测样品中未携带番茄斑萎病毒；说明书CN104120193A3/7页60033所述PCR反应的体系为CDNA模板2UL、TSWV482F05UL、TSWV482R05UL、2ESTAPMASTE。
17、RMIX10UL、DDH2O7UL，总体积20UL；0034所述PCR反应的条件为94预变性5MIN，94变性30S、58退火45S、72延伸45S，40个循环，最后72延伸5MIN。0035本发明建立了一种用于待测样品中番茄斑萎病毒绝对定量方法，包括如下步骤1根据标准质粒建立标准曲线；2获得待测样品CDNA；反转录合成CDNA；并以CDNA为模板、TSWV113F/TSWV113R引物进行荧光定量PCR，得到待测样品的CT值；3利用标准曲线计算待测样品中番茄斑萎病毒的拷贝数。方法准确性好，灵敏度高、特异性强、重复性好，能够在45小时内对样品中的番茄斑萎病毒进行准确定量，不仅节约了时间、简化了。
18、实验步骤，还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施，防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。0036在本发明的进一步实施例中，还提供了荧光定量PCR的优选反应体系和条件引物TSWV113F和TSWV113R以等摩尔比配置10UMOL/L；PCR反应条件优选95预变性15MIN，95变性10S，60退火32S，72延伸32S，40个循环。在此条件下进行PCR，扩增效率最高，特异性最好。在本发明的另一些实施例中，也可以采用其它的合适的PCR反应条件进行检测。0037根据本发明设计的特异性引物，本发明还提供了定性检测番茄斑萎病毒的PCR方法。并提供了适合该引物的PCR反应体系和程序。经验证，。
19、该方法可用于定性检测番茄斑萎病毒，具有良好的特异性，如图1所示。附图说明0038图1TSWV目的片段PCR扩增结果及特异性检测，0039其中M为50BPLADDER,1为阳性样品人工制备的带TSWV的曼陀罗叶片，24分别为带TSWV的中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室辣椒叶片、济宁环纹辣椒叶片、济宁皱缩辣椒叶片，57分别为带西瓜花叶病毒WMV的西瓜叶片、带烟草花叶病毒TMV的烟草叶片、带瓜类退绿黄化病毒病CCYV的黄瓜叶片，8为健康辣椒叶片；0040图2利用梯度PCR验证荧光定量引物的特异性，其中M表示MARKERI，点样孔18为荧光定量PCR产物退火温度5462，点样孔9为阴性对照；0041图。
20、3质粒标准品的荧光扩增曲线图；0042图4TSWV荧光定量PCR检测方法的标准曲线；0043图5TSWV荧光定量PCR检测方法的荧光扩增曲线图；0044图6TSWV荧光定量PCR检测方法的溶解曲线。具体实施方式0045病毒株系番茄斑萎病毒TSWVYN，由浙江省农科院植保所与微生物研究所张治军提供。0046本实验室也有保存，申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发放用于必要的验证试验。0047植物材料说明书CN104120193A4/7页70048带TSWV的曼陀罗叶片通过摩擦接种的方法将番茄斑萎病毒TSWVYN保存在曼陀罗植株上，经DASELISA检测确认发病，备用。0049疑似带TSWV的植。
21、物叶片取自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室大棚，通过判断叶片表现出斑块状褪绿、黄化、坏死及灼烧状等症状来确定是否是疑似带TSWV。0050主要仪器和试剂0051S1000THERMALCYCLERPCR仪，BIORAD公司；0052MOLECULARIMAGERCHEMIDOCXRSSYSTEM美国BIORAD公司；0053荧光定量PCR仪7500型，美国ABI公司；0054冷冻离心机3K15，美国SIGMA公司；0055TRIZOLREAGENTRNA提取试剂盒，INVITROGEN公司；0056质粒小型提取试剂盒，SUPERREALPREMIXPLUSSYBRGREEN，自天根生化科技北京。
22、有限公司；0057DNA纯化回收试剂盒，购自上海捷瑞生物工程有限公司；0058CDNA第一链合成试剂盒、PMDTM18TVECTORCLONINGKIT、TAKARAPRIMESCRIPTTMRTREAGENTKITWITHGDNAERASERPERFECTREALTIME试剂盒，宝生物工程大连有限公司。0059实施例1、引物的设计与合成0060步骤1引物设计0061根据GENBANK数据库已报道TSWV基因序列，将尽可能多的TSWV序列如JN6015251下载后，使用DNAMAN软件进行序列比对分析；寻找不同株系的病毒特异性和保守区域设计引物表1，引物由上海生工有限公司合成。0062目的片段。
23、引物为0063TSWV482F5TCTGGTAGCATTCAACTTCA3,0064TSWV482R5CTTCTCTGGTGTCATACTTCT3。0065荧光定量引物为TSWV113FCTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG，TSWV113RTCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC。0066表1本实验所用引物00670068步骤2特异性引物TSWV482F/TSWV482R的特异性验证0069材料0070新鲜带TSWV的曼陀罗叶片，0071带TSWV的中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室辣椒叶片，说明书CN104120193A5/7页80072济宁环纹辣椒叶片，0073济宁皱缩辣椒叶片。
24、，0074带西瓜花叶病毒WMV的西瓜叶片，0075带烟草花叶病毒TMV的烟草叶片，0076带瓜类退绿黄化病毒病CCYV的黄瓜叶片，0077以上材料采集自中国农业科学院蔬菜花卉研究所植物病理组实验室。0078植物总RNA的提取、CDNA第一链合成及目的片段的扩增，选取13G植物材料叶片，参照华越洋超快型植物RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，使用TAKARA反转录试剂盒PRIMESCRIPTTMRTREAGENTKITWITHGDNAERASER进行CDNA合成，定量至1UG/UL,保存于80备用。0079将反转录合成的CDNA作为模板，进行目的片段的扩增。PCR扩增体系如下CDNA模板2UL、。
25、TSWV482F05UL、TSWV482R05UL、2ESTAPMASTERMIX10UL、DDH2O7UL，总体积20UL；反应条件94预变性5MIN，94变性30S，56退火45S，72延伸45S，40个循环，最后72延伸5MIN。0080取扩增产物10UL在TBE缓冲液中以2琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，PCR产物为482BP的单一条带，同时其它带近似症状病毒的材料未检出条带，说明采用的检测方法具有良好的特异性。0081实施例2、目的片段PCR扩增和质粒标准品的制备00821植物总RNA的提取、CDNA第一链合成及目的片段的扩增0083带TSWV的曼陀罗叶片为材料，采用实施例2步骤2的方法。
26、制备得到带TSWV的曼陀罗叶片的CDNA，PCR扩增验证，阳性CDNA样品定量至1UG/UL,保存于80备用。00842质粒标准品的制备0085将步骤1扩增的阳性样品的目的片段回收并纯化，克隆至PMDTM18T载体上，冰上放置30MIN，加入50ULTRANST1感受态细胞，然后加入500UL不含氨苄的LB培养基，37振荡培养，复苏1H，在含有XGAL，IPTG和氨苄的固体LB琼脂平板上培养过夜；挑选白色单菌落斑，加入3ML含氨苄的LB液体培养基37、200R/MIN振荡培养至浑浊；按照天根质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，同时对质粒进行鉴定，于20保存备用。0086实施例3、TSWV实时荧光。
27、定量PCR方法的建立00871梯度PCR验证荧光定量引物的特异性0088本实验所用荧光定量引物113BP是在目的基因片段482BP区域内设计。0089用荧光定量引物对提取的TSWV曼陀罗叶片RNA进行反转录和RTPCR扩增。步骤同实施例1步骤2。PCR程序中退火温度设为8个梯度65、645、635、62、602、589、578、570。0090取扩增产物10UL在TBE缓冲液中以2琼脂糖凝胶电泳，结果如图2，在8个退火温度下的PCR产物均为113BP的单一条带，表明荧光定量引物具有很强的特异性。将PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果与预期结果一致。00912荧光定量PCR条件的确。
28、立0092为了得到更好的扩增效率和荧光信号，按照SUPERREALPREMIXPLUSSYBRGREEN试剂盒说明书进行两步法和三步法摸索，样品加完后放置于ABI7500荧光定量PCR说明书CN104120193A6/7页9仪中进行扩增。0093荧光定量PCR反应体系为质粒标准品模板1UL，2SUPERREALPREMIXPLUS10UL，引物TSWV113F和TSWV113R10UMOL/L各05UL，50ROXREFERENCEDYE5UL，RNASEFREEDDH2O3UL，总体积20UL，混匀后瞬时离心，每次都以健康辣椒叶片的CDNA为模板作为阴性对照。0094分别采用两步法和三步法进。
29、行荧光定量PCR扩增，采用梯度PCR进行退火温度摸索。0095结果表明0096采用三步法且退火温度为60时，扩增效率最高，特异性最好。0097优化后的反应程序为95预变性15MIN，95变性10S，60退火32S，最后72延伸32S，40个循环。00983标准曲线的建立0099根据公式质粒的拷贝数COPIES/UL6021023COPIES/MOL质粒浓度G/UL/质粒分子质量G/MOL，得出质粒拷贝数。0100经NANODROP2000C测定质粒标准品浓度为902NG/UL，A260/A280为198。0101质粒标准品经过5倍系列梯度5158倍稀释后，拷贝数为2931010375105CO。
30、PIES/UL。利用荧光定量引物TSWV113F和TSWV113R，以确立的荧光定量PCR反应条件对稀释后的质粒标准品进行绝对定量PCR扩增，每个稀释度设置3次重复。0102经ABI7500荧光定量PCR仪软件自动分析获得标准曲线，其中横坐标为系列稀释标准品模板病毒起始拷贝数的对数值LOGC，纵坐标为系列稀释标准品模板扩增时的CT值图4。0103实施例4、番茄斑萎病毒绝对定量方法的重复性和特异性验证0104所有的植物叶片在提取总RNA之后，反转成CDNA并定量到1NG/UL。0105重复处理同一浓度的阳性样品TSWV曼陀罗叶片的CDNA1NG/UL，采用实施例1建立的TSWV实时荧光定量PCR。
31、方法，分4个重复进行荧光定量PCR，获得荧光扩增曲线图5和溶解曲线图6。0106从图5可以看出，4个重复的样品的荧光扩增曲线重叠在一起，表明本发明番茄斑萎病毒绝对定量方法具有很好的重复性；0107从图6可以看出，溶解曲线呈单一峰，且峰值在80左右，表明PCR产物专一，没有产生非特异扩增，TSWV实时荧光定量PCR方法具有很好的特异性。0108实施例5、番茄斑萎病毒绝对定量方法的应用0109阴性对照模板为纯净水。0110阳性对照带TSWV的曼陀罗叶片样品。0111质粒样品按照实施例2的方法制备完全相同的质粒，经NANODROP2000C测定质粒样品初始浓度为687NG/UL，用DEPC水5倍梯度。
32、逐级稀释液稀释范围从54倍至58倍后，根据公式质粒的拷贝数COPIES/UL6021023COPIES/MOL质粒浓度G/UL/质粒分子质量G/MOL，各稀释浓度下质粒样品的中目的基因的理拷贝数分别为325108，65107，13107，26106，58105。0112三份疑似带TSWV的辣椒叶片样品L1、L2、L3随机采集。说明书CN104120193A7/7页100113根据实施例3的方法建立的质粒标准品的标准曲线Y34581X43701，对阴性对照、阳性对照样品、质粒样品5份以及疑似带TSWV的辣椒叶片样品L1、L2、L3中TSWV含量进行计算，结果显示如下表0114样品CT值目的基因拷。
33、贝数预设拷贝数阴性对照383535270阳性对照1625867107质粒样品稀释54倍1427324108325108质粒样品稀释55倍1669647107650107质粒样品稀释56倍1912128107130107质粒样品稀释57倍2152259106260106质粒样品稀释58倍2394581105580105L12380569105L21875164107L321512611060115注CT值超过35后，荧光定量CT值接近阴性对照，数据可靠性有待进一步确认。0116从上表可以看出，合成的CDNA样品的五个稀释倍数下检测到的目的基因拷贝数与通过NANODROP2000C测定浓度算出的拷贝数相符，无显著差异，证明本发明的方法能够准确定量目的基因拷贝数。说明书CN104120193A101/3页1100010002序列表CN104120193A112/3页120003序列表CN104120193A123/3页13序列表CN104120193A131/3页14图1图2图3说明书附图CN104120193A142/3页15图4图5说明书附图CN104120193A153/3页16图6说明书附图CN104120193A16。