聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类用于抑制碱性磷酸酶的用途 本发明涉及聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类或非衍生的天然多糖类用于抑制碱性磷酸酶的用途以及包括这些化合物的口腔用制剂。
在牙科领域经常存在因细菌粘附在天然或人工牙齿或牙龈上而形成牙斑(牙石，牙垢)的问题并加速了龋齿和牙龈疾病诸如牙周病的发展。牙石的含义是牙齿表面上的牙龈边界处形成沉积物。这些沉积物由无机物质-特别是羟磷灰石钙(calcium hydrogenoxylapatire)(HAP)-和诸如上皮细胞、食物颗粒、唾液沉降物和不同类的微生物这样的有机成分组成。
这种白色的、淡黄色的或通常是带污斑的牙石是不需要的，不仅是因为它的出现，而且主要是因为它会对口腔粘膜产生不断刺激并使牙龈炎与牙和牙槽疾病发展的机会增多。一方面通过每天护理牙齿并伴随微量脱钙可以预防这类沉降物。此外，必须经常不时地请牙医通过机械方式除去牙石。
例如，安全而有效的用于抑制牙石形成的药剂是称作多价螯合剂和螯合剂的水溶性的分子脱水的焦磷酸盐，诸如六甲基磷酸盐、三聚磷酸盐和焦磷酸盐，它们可预防HAP的形成(参见US-A-4，515，722)。然而，在口腔应用中，这些化合物的作用因存在于口腔和咽喉区域地唾液酶而显著降低，这类磷酸盐化合物特别由碱性磷酸酶所水解。
US-A-5，094，844提出了降低碱性磷酸酶失效作用的方法，即通过添加阴离子聚乙烯基磷酸盐而将以线型分子方式脱水的聚磷酸盐水解。
本发明的目的是提供降低碱性磷酸酶副作用的另外的药剂。
令人意外的是，目前已经发现了聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类或非衍生的天然多糖类具有抑制碱性磷酸酶的作用的用途。
因此，本发明涉及聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类或非衍生的天然多糖类用于抑制碱性磷酸酶的用途。
特别地，本发明涉及聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类用于抑制碱性磷酸酶的用途。
所用的聚阴离子或聚阴离子衍生的天然多糖类优选是
-糖胺聚糖和其它聚阴离子天然多糖类，诸如透明质酸或角叉菜胶(carageenan)；
-聚阴离子衍生物，例如天然非阴离子多糖类(诸如右旋糖酐类、黄原胶类、葡聚糖类)的硫酸盐、甲基羧酸盐、磷酸盐等。
聚阴离子衍生的天然多糖类优选是那些含有磷酸盐基团、膦酸酯基团或甲基膦酸酯基团的化合物，诸如
-壳多糖衍生物，例如硫代壳多糖、羧甲基壳多糖、磷酸壳多糖或特别是
-脱乙酰壳多糖衍生物，例如硫代脱乙酰壳多糖、羧甲基脱乙酰壳多糖或特别是磷酸脱乙酰壳多糖。
本发明所用的聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类优选具有的分于量＞5000。
优选的磷酸脱乙酰壳多糖特别是符合下列通式(1)的膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖：其中R1是氢或通式(1a)的基团R2是通式(1a)的基团，X1和X2彼此独立为另一个氢、C1-C5烷基或碱金属离子(alkali ion)或铵离子，且n是20-4000。
特别优选的是通式(2)的膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖：其中X1和X2如通式(1)所定义。
最为关注的是那些通式(1)或(2)的化合物，其中X1和X2彼此独立为另一个碱金属，且n是20-1000。
本发明所用的非衍生的天然多糖类优选是葡聚糖类。优选使用符合下列通式(3)的β-1，3-葡聚糖类：其中n是符合＞5×103-10×1010且特别是105-108范围内平均分子量(MW)的数字。
已经发现本发明所用的聚阴离子和聚阴离子衍生的天然多糖类和非衍生的天然多糖类、特别是通式(1)和(2)的膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖和通式(3)的β-葡聚糖类可抑制微生物、特别是厌氧微生物对固体表面尤其是口腔和咽喉区域中的洞、空隙、沉积物、囊的粘附，且它们由此可降低或抑制这些病菌的副作用、特别是牙斑和牙垢的形成、或牙齿发育缓慢、呼吸带异味(口臭)和假牙上的沉积物。
这些化合物还可以将微生物与固体表面隔离(解吸附作用)。
由于与Zn、Sn和Mn、Al、Sb、Zr、La、Hf、Ta、Ir、Gd金属形成了复合物，所以这些化合物进一步能够对牙齿脱敏(例如超敏感性)。
膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖的缓冲能力可使口腔内的pH保持稳定并预防胃酸过多和由此导致的牙齿发育缓慢。
与聚乙烯磷酸盐和类似的合成聚合物衍生物相反，通式(1)和(2)的膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖和通式(3)的葡聚糖类是可生物适合的和可生物降解的化合物。
通过本身公知的方式使脱乙酰壳多糖膦酰基甲基化来制备这些化合物。其制备方法的进一步内容可以在EP-A-0，713，882中找到。
在另一个方面中，本发明涉及一种口腔用组合物，它包括：
(a)0.01-10％(重量)，优选2-5％(重量)的至少一种以线型分子方式脱水的聚磷酸盐，和
(b)0.0001-5％(重量)的聚阴离子或聚阴离子衍生的天然多糖。
本发明所用的聚磷酸盐(=成分(a))例如作为抗牙斑形成的新型口腔用组合物中活性物质的六甲基磷酸盐、三聚磷酸盐和焦磷酸盐是水溶性的碱金属盐，诸如钠、钾或铵盐及其混合物。公知这些化合物是预防US-A-4，627和4，806，340中所述牙斑的药剂。
所述新型口腔用组合物中的成分(a)优选是六甲基磷酸盐、三聚磷酸盐、焦磷酸盐或这些化合物的混合物。
所述的聚磷酸盐可以含有例如2-120个磷原子且它所述新型口腔用组合物中使用的量为占所述组合物的总重的0.01-10％(重量)、优选2-5％(重量)。
优选将焦磷酸盐作为焦磷酸四钾和聚磷酸四钠的混合物使用。
所述的新型组合物还可以含有抗菌活性物质例如酚衍生物、二酚化合物、苄醇类、氯己二炔(chlorohexidine)、C12-C14烷基甜菜碱、C8-C18脂肪酸酰胺基烷基甜菜碱、两性表面活性剂、三卤碳酰苯胺类、季铵盐和(特别是)通式(4)的2-羟基二酚醚类：其中Y是氯或溴；Z是SO2H、NO2或C1-C4烷基；r是0-3；o是0-3；p是0或1；m是0或1；且n是0或1。特别优选的化合物是下列通式(5)或(6)的那些化合物：
所述的新型口腔用组合物还可以含有可有效抗龋齿形成的释放氟化物离子的化合物，例如诸如氟化钠、氟化钾、氟化铵或氟化钙这样的无机氟化物盐或例如公知商品名为Olatluor的氟化胺的有机氟化物盐。这些化合物在所述新型组合物中的含有量为0.005-3％(重量)，这取决于组合物的溶解度和类型。
所述的新型口腔用组合物优选是液体，例如易于洗涤口腔或冲洗口腔的形式，所述组合物中水与醇混合物的比例优选为1∶1-20∶1，优选2∶1-10∶1。
所述新型口腔用组合物的pH为4.5-9，优选5.5-8。
所述的新型口腔用组合物还可以是固体或糊状形式，例如牙粉、牙片、牙糊、牙凝胶或牙霜的形式。这类固体或糊状组合物通常含有一种口腔可接受的不溶于水的磨光物质。这类磨光物质的实例是不溶于水的偏磷酸盐、磷酸三钙、脱水磷酸二钙、焦磷酸钙、硅酸铝、硅酸锆、膨润土或这些化合物的混合物。这种磨光物质通常在固体或糊状组合物中的用量为10-90％(重量)，优选10-75％(重量)。
所述的新型口腔用组合物还可以含有另外的物质，例如增白剂、防腐剂、硅氧烷、叶绿素化合物、其它用于预防牙斑的试剂、脲、磷酸二铵及其混合物。这些佐剂以不影响所述组合物的正面特性的浓度存在于所述的新型组合物中。
另外，所述的新型组合物可以含有调味剂和增甜剂，例如薄荷油、桉树、甘牛至草、肉桂、糖精等。
例如通过将所述的新型口腔用组合物搅拌成温树脂材料或通过在口香糖外表面包衣可以将所述的新型口腔用组合物制成锭剂、口香糖或其它产品。
通过下面的实施例来解释本发明。实施例1：碱性磷酸酶活性的测定
使用用于临床化学分析系统(Olympus System Reagents 800，MITSerice Inc.；San Diego CA)的动力学比色试验来测定碱性磷酸酶的活性。不使用通常所用的血液，使用的碱性磷酸酶的来源是含有200μl大肠杆菌(Fluka，CH-9471 Buchs)的碱性磷酸酶悬浮液的一种溶液，将其溶于20ml的0.1mol/l tris-HCl缓冲液(pH8.0)，并用相当于3U／ml(U=单位)活性的碱性磷酸酶来制备(下文称作溶液(A))。
作为测定溶液，将100mg的膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖(=P-脱乙酰壳多糖)溶于20ml的0.1mol/l tris-HCl(pH8.0)中并进一步用0.1mol/1 tris HCl分别稀释至2.5、0.5、0.1、0.05、0.025、0.01、0.0075、0.005和0.0025mg/ml(溶液B和C)。
为了测定膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖对碱性磷酸酶活性的影响，将100μl的酶溶液A各自与900μl的B或C的稀释液混合。根据临床化学的设计方案，使用分光光度法通过使淡色的对硝基苯基磷酸盐降解成深色的对硝基苯酚的酶的能力来测定所述酶的活性(参见表1)。
表1
确定的抑制浓度 [mg/l]碱性磷酸酶活性[单 位]膦酰基甲基化的脱乙 酰壳多糖参照值[单位]
4536 205
907.2 104
453.6 39
90.72 15.5
45.36 23
9.072 41.5
4.536 73.5
0.9072 302
0.4536 302.5
0.09072 381.5
不易识别 1
参照值 - 325.5
这些结果表明膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖可有效降低碱性磷酸酶的活性。实施例2：牙糊的制备
组分 重量％
蒸馏水 加至100
山梨醇 40.0
Zeodent 113 20.0
甘油 20.0
焦磷酸四钠 12.0
焦磷酸二钠 3.40
十二烷基硫酸钠 1．37
芳香剂 1.35
PEG-6 1.33
羧甲基纤维素钠 1.00
氟化钠 0.50
丙烯酸均聚物 0.20
糖精钠 0.20
二氧化钛 0.16
P-脱乙酰壳多糖 0.03
FD&C Blau Cl 42090(No.1，1 0.03
％溶液)
这种牙糊对牙斑非常有效。实施例3：口腔洗涤液的制备
组分 重量百分比
蒸馏水 加至100
乙醇 1O.00
甘油 10.00
PEO-PPO-PEO嵌段聚合物 2.00
焦磷酸四钠 1.50
芳香剂 1.35
焦磷酸二钠 0.50
氟化钠 0.50
糖精钠 0.3
P-脱乙酰壳多糖 0.02
这种口腔洗涤液极其适合于预防牙斑。实施例4：微生物吸附和解吸附的测定a.吸附
以厌氧方式将如下细菌固定在BA平板上并培养：变异链球菌(ZIB6008)；温和链球菌(KL-stab.)；咽峡炎链球菌(S.anguinosus)(ZIB6006)和血链球菌(ZIB6010)。使每一个菌落生长至在Todd-Hewitt肉汤中的密度约为0.50D660作为储备液。
将50mg羟磷灰石珍珠(HA：BioRad的Macro-Prep CeramicHdroxylapatite，80微米)用1ml无菌H2O洗涤一次并用1ml通过过滤灭菌的吸附缓冲液(5mM KCl；1mM CCl2；0.1mM MgCl2；1mM K2HPO4，pH 7.2)洗涤三次(参见Berry & Siragusa(1997)；《应用环境微生物学》(Appl．Environ.Microbiol.)63：4069-4074)。将2ml细菌溶液离心(10，000rpm，5分钟)并用吸附缓冲液洗涤两次且然后重新悬浮于含有不同浓度测试物质或不含测试物质的吸附缓冲液中。将这种溶液与悬浮于1ml吸附缓冲液中的羟磷灰石珍珠合并并通过在37℃下轻度振摇而保温30分钟。在HA珍珠沉积后，除去上清液。将HA珍珠溶于1.6ml的0.5N HCl中。相对于不含经系列稀释制备的测试物质的对照液(对照液：100％吸收度)来说，测定该溶液的光密度(OD660)并将其放置。b.解吸附
以厌氧方式将如下细菌固定在BA平板上并培养：变异链球菌(ZIB6008)；温和链球菌(KL-stab.)；咽峡炎链球菌(S.anguinosus)(ZIB6006)和血链球菌(ZIB6010)。使每一个菌落生长至在Todd-Hewitt肉汤中的密度约为0.50D660作为储备液。将50mg羟磷灰石珍珠(HA：BioRad的Macro-Prep Ceramic羟磷灰石，80微米)用1ml无菌H2O洗涤一次并用1ml通过过滤灭菌的吸附缓冲液(5mlKCl；1mMCCl2；0.1mM MgCl2；1mM K2HPO4，pH 7.2)洗涤三次(参见Berry &Siragusa(1997)；《应用环境微生物学》(Appl．Environ.Microbiol.)63：4069-4074)。将2ml细菌溶液离心(10，000rpm，5分钟)并用吸附缓冲液洗涤两次且然后重新悬浮于吸附缓冲液中。将这种溶液与悬浮于1ml吸附缓冲液中的羟磷灰石珍珠合并并通过在37℃下轻度振摇而保温30分钟。在HA珍珠沉积后，除去上清液。将所述的HA珍珠用吸附缓冲液洗涤一次且然后在37℃下通过程度振摇与1ml含有不同浓度测试物质的吸附缓冲液一起保温30分钟。在HA珍珠沉积后，除去上清液并将HA珍珠溶于1．6ml的0.5N HCl中。相对于不含经系列稀释制备的测试物质的对照液(对照液：0％吸收度)来说，测定该溶液的光密度(OD660)并将其放置。结果a.膦酰基甲基化的脱乙酰壳多糖体外对主要导致牙斑和牙石形成的微生物的粘附作用的体外抑制作用
微生物 P-脱乙酰壳多 抑制+/-[％] 平均误差
糖[％]
变异链球菌 0.2 76.0 +/-5.26
0.02 38.8 +/-7.16
0.002 27.0 +/-4.29
0.0002 13.4 +/-4.14
温和链球菌 0.2 84.1 +/-0.97
0.02 67.8 +/-3.37
0.002 27.4 +/-6.43
0.0002 7.1 +/-4.56
咽峡炎链球菌 0.200 85.1 +/-0.81
0.02 72.7 +/-4.84
0.002 43.6 +/-9.05
0.0002 35.4 +/-10.37
血链球菌 0.200％ 74.3％ +/-3.78
0.02％ 43.1％ +/-10.92
0.002％ 24.8％ +/-9.67
0.0002％ 8.5％ +/-1.44主要导致牙斑和牙石形成的粘附微生物的体外解吸附作用
微生物 P-脱乙酰壳多 抑制+/-[％] 平均误差
糖[％]
变异链球菌 0.2 87.3 +/-10.65
0.02 60.2 +/-2.93
0.002 35.9 +/-5.89
0.0002 14.7 +/-8.31
温和链球菌 0.2 89.2 +/-2.06
0.02 59.4 +/-7.70
0.002 30.8 +/-8.21
0.0002 17.3 +/-7.561，6-1，3-β-葡聚糖主要导致牙斑和牙石形成的微生物粘附作用的体外抑制作用
微生物 1-6 1，3-β-葡 抑制+/-[％] 平均误差
聚糖[％]
变异链球菌 0.2 79.8 +/-1.68
0.02 59.3 +/-1.53
0.002 41.0 +/-2.53
0.0002 27.35 +/-7.20
温和链球菌 0.2 73.1 +/-2.72
0.02 46.7 +/-3.67
0.002 25.6 +/-3.09
0.0002 15.6 +/-4.77
主要导致牙斑和牙石形成的微生物粘附作用的体外抑制作用
微生物 1-6 1，3-β-葡 解吸附作用％ 平均误差
聚糖[％]
变异链球菌 0.2 79.8 1.68
0.02 59.3 1.53
0.002 41.0 2.53
0.0002 27.35 7.20
温和链球菌 0.2 73.1 2.72
0.02 46.7 3.67
0.002 25.6 3.09
0.0002 15.6 4.77c.N-二羧甲基脱乙酰壳多糖主要导致牙斑和牙石形成的微生物粘附作用的体外抑制作用
微生物 N-二羧甲基脱 抑制+/-[％] 平均误差
乙酰壳多糖[％]
变异链球菌 0.2 48.9 +/-8.87
0.02 19.1 +/-9.82
0.002 14.6 +/-4.60
0.0002 7.5 +/-4.60
温和链球菌 0.200 42.1 +/-5.26
0.02 32.8 +/-3.38
0.002 23.43 +/-2.30
0.0002 14.5 +/-8.05