HSCARB2基因转殖鼠的制造及其做为肠病毒感染动物模式的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103081868 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103081868 A *CN103081868A* (21)申请号 201110397498.6 (22)申请日 2011.12.02 100140077 2011.11.03 TW A01K 67/027(2006.01) A61D 19/04(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 财团法人卫生研究院 地址 中国台湾苗栗县竹南镇科研路 35 号 (72)发明人 周彦宏 庄再成 林怡玟 (74)专利代理机构 北京中博世达专利商标代理 有限公司 11274 代理人。

2、 申健 王俊民 (54) 发明名称 hSCARB2 基因转殖鼠的制造及其做为肠病毒 感染动物模式的应用 (57) 摘要 本发明是关于 EV71 接受体 SCARB2 基因转殖 鼠的制造， 本发明所制得的 SCARB2 基因转殖鼠可 做为手足口病， 例如肠病毒71型或克沙奇病毒16 型 (Coxsackie A16) 感染的动物模式， 以供评估 肠病毒疫苗免疫保护功效， 及肠病毒感染的病理 研究上的应用。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明。

3、书5页 序列表2页 附图10页 (10)申请公布号 CN 103081868 A CN 103081868 A *CN103081868A* 1/1 页 2 1. 一种制造 hSCARB2 基因转殖鼠的方法， 其特征在于， 包含下列步骤 ： a. 将经由微注射入受 Elongation factor-1 启动子 (EF-1promoter) 驱动的人类 SCARB2 蛋白 (hSCARB2) 基因 (SEQ ID NO.1) 的小鼠胚胎， 转殖到同品系母鼠中使其发育成 鼠 ； b. 利用 PCR 分析筛检出带有 hSCARB2 蛋白基因型的阳性小鼠， 与原生型同品系小鼠互 相交配， 生成 F0。

4、 小鼠 ； c. 再次以 PCR 分析筛选出其基因型为异核型 (heterozygous) 的阳性 F0 小鼠， 并使呈 阳性 F0 小鼠互相交配生成 F1 小鼠 ； d.利用PCR分析筛选得其基因型为同核型(homozygous)的阳性F1小鼠， 而得hSCARB2 基因转殖鼠 ； 及 e. 利用 RT-PCR 分析确认 F1 基因转殖鼠在主要器官表达 hSCARB2 蛋白。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 该基因转殖鼠于自然界流行的肠病毒株 感染后， 会呈现手足口病 (HFMD) 的症状和神经系统的病变。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 该用于基因转。

5、殖的小鼠是 C57BL/6 小鼠。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 该用于基因转殖的小鼠是 FVB 小鼠。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 该制得的hSCARB2基因转殖鼠用做为手足 口病的动物模式。 6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 该制得的hSCARB2基因转殖鼠用做为肠病 毒 71 型的感染动物模式。 7.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 该制得的hSCARB2基因转殖鼠用做为克沙 奇病毒 16 型 (Coxsackie A16) 的感染动物模式。 8. 一种检测肠病毒疫苗保护效力的方法， 其特征在于， 利用根据权利要求 1 所述的方。

6、 法所制得的 hSCARB2 基因转殖鼠为动物模式， 评估候选肠病毒疫苗在疫苗接种后施予肠病 毒攻毒时， 对于已受免疫的 hSCARB2 基因转殖鼠所产生的抗病毒保护效力。 9. 一种用于筛检出有效治疗肠病毒所引起的手足口病的治疗性疫苗或药物的方法， 其 特征在于， 包含 ： (1) 将根据权利要求 1 所述的方法所制得的 hSCARB2 基因转殖鼠以自然界流行的肠病 毒株感染， 使其呈现手足口病 (HFMD) 的症状 ； (2) 将呈现病症的 hSCARB2 基因转殖鼠施予候选疫苗或药物 ； (3) 于一段治疗时间后， 与未施予候选疫苗或药物的动物进行比较， 以评估该候选疫苗 或药物在疗肠病。

7、毒所引起的手足口病的功效。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 用于筛选出用于治疗肠病毒71型感染的 药物。 11.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 用于筛选出用于治疗克沙奇病毒16型感 染的药物。 权 利 要 求 书 CN 103081868 A 2 1/5 页 3 hSCARB2 基因转殖鼠的制造及其做为肠病毒感染动物模式 的应用 技术领域 0001 本发明是关于肠病毒感染动物模式的制备， 更特别地是关于 SCARB2 基因转殖鼠 的制造， 以及其做为手足口病的动物模式上的应用。 背景技术 0002 肠病毒71型(EV71)已被证实会引起手足口病(HFMD)、 疱疹性咽。

8、峡炎， 和神经系统 的病变如无菌性脑膜炎、 脑炎及类小儿麻痹症候群， 甚至在婴幼儿造成致死疾病， 并且在全 世界爆发严重的疫情 (AbuBakar et al.， 1999， Virus Res 61(1)， 1-9 ； Chang， Huang， and Lin， 1998， Lancet 352(9125)， 367-8 ； Bible et al.， 2007， Rev Med Virol 17(6)， 371-9)。 及至今日， 透过公共卫生对肠病毒 71 型疫情的控制与医疗照护仍显不足。目前并没有疫苗 可供临床适用。因此， 研究肠病毒 71 型感染的机制， 以供开发有效的治疗药物或预。

9、防性疫 苗实属重要。 0003 现已知有多种动物模式被发展， 欲应用于研究 EV71 感染的致病原因 ( 参见， 例 如 Chen et al.， 2004， J Gen Virol 85(Pt 1)， 69-77 ； Nagata et al.， 2004， J Gen Virol85(Pt 10)， 2981-9 ； Ong et al.， 2008， J Neuropathol Exp Neurol 67(6)， 532-42 ； Weng et al.， 2010， Infect 12(7)， 505-10)。 而目前使用的肠病毒动物模式， 是利用新生一 天大的 ICR 小鼠， 以 E。

10、V71 感染进行人为发展而得， 新生的 ICR 小鼠在 EV71 感染后会出现后 肢麻痹， 并且最后在受感染 2 周内死亡 (Wu et al.， 2001， Vaccine20(5-6)， 895-904)。然 而， 由于该 ICR 小鼠仅适用于， 评估小鼠对于肠病毒感染或疫苗引起的免疫反应， 无法真正 模拟在人类受到感染后所引发的免疫反应。同时， 由于该小鼠模式并未呈现肠病毒感染后 的 HFMD 症状， 故利用其所进行的研究观察只局限于， 肠病毒感染后小鼠的存活率及神经性 毒性， 无法确实应用在评估药物或疫苗， 对于肠病毒感染的治疗及 / 或预防功效。此外， 目 前使用的 ICR 小鼠因为。

11、免疫系统发育不全， 可能无法充分反应肠病毒 EV71 的毒性， 及了解 其对于神经系统的影响。 0004 再者， 目前使用的 ICR 小鼠是利用小鼠适应过的肠病毒株 (mouse-adaptedEV71 strain， 参见 Wang et al.， 2004， J Virol 78(15)， 7916-24) 进行感染试验， 但由于该病毒 并没有存在于自然界， 故无法使受感染的 ICR 小鼠表现出真正的， 天然流行肠病毒株感染 后应有的 HFMD 症状及神经性毒性 (Perez-Velez et al.， 2007， Clin Infect Dis 45(8)， 950-7)。且经研究发现，。

12、 以自然界流行的肠病毒株感染已知的成年 ICR、 Balb/c、 CH3、 C57BL/6等实验用小鼠(这些皆不表现EV71接受体)后， 都完全不会引起HFMD症状及神经 性毒性 (Wang， 2004， 如前述 ； Chen et al.， 2004， J Gen Virol 85(Pt 1)， 69-77)。 0005 近来研究发现， 人类清道夫接受体 B 类， 膜蛋白质 2 型 (human scavenger receptor class B， member 2 ； hSCARB2) 是肠病毒 71 型及克沙其病毒 16 型 (Coxsackie A16) 进入细胞的接受器 (Yama。

13、yoshi et al.Nat Med 15(7) ： 798-801， 2009)， 虽然小鼠 SCARB2与人类SCARB2(hSCARB2)具有85.8同源性， 但显示其不作为EV71的受体。 本发明 说 明 书 CN 103081868 A 3 2/5 页 4 遂建立 hSCARB2 基因转殖鼠作为肠病毒实验动物感染模式， 以期仿真肠病毒的感染途径， 研究其引起手足口病和神经系统病变的致病机转， 并藉以评估肠病毒疫苗在此动物模式中 的免疫保护效力， 以及候选治疗性药物或疫苗对于肠病毒感染的防治功效， 以增进对肠病 毒感染致病机制的了解， 以及应用于有效肠病毒疫苗的研发。 发明内容 00。

14、06 本发明是基于发现， 人类清道夫接受体 B 类， 膜蛋白质 2 型 ( 以下简称 SCARB2) 为 肠病毒进入细胞的接受器， 遂建立SCARB2基因转殖鼠作为肠病毒71型实验动物感染模式， 应用于研究EV71引起的神经系统病变机转， 及分析EV71疫苗的保护作用， 以开发有效的治 疗药物或是预防肠病毒感染相关疾病的疫苗。 0007 于是， 本发明一方面是关于， 一种制造 SCARB2 基因转殖鼠的方法， 其包含 ： 将经由 微注射入受 Elongation factor-1 启动子 (EF-1promoter) 驱动的人类 SCARB2 蛋白基因 (SEQ ID NO.1) 的小鼠胚胎，。

15、 转殖到同品系母鼠中使其发育成鼠 ； 利用 PCR 分析筛检出带有 SCARB2 蛋白基因型的阳性小鼠， 与原生型同品系小鼠互相交配， 生成 F0 小鼠 ； 再次以 PCR 分析筛选出其基因型为异核型 (heterozygous) 的阳性 F0 小鼠， 并使呈阳性 F0 小鼠互相交 配生成 F1 小鼠 ； 利用 PCR 分析筛选得其基因型为同核型 (homozygous) 的阳性 F1 小鼠， 而 得 SCARB2 基因转殖鼠 ； 以及利用 RT-PCR 分析确认 F1 基因转殖鼠在主要器官表达 SCARB2 蛋白。 0008 于本发明的一具体实施例， 用于基因转殖的小鼠是 C57BL/6 小。

16、鼠。于本发明的另 一具体实施例， 用于基因转殖的小鼠是 FVB 小鼠。 0009 本发明的 SCARB2 基因转殖鼠于自然界流行的肠病毒株感染后， 会呈现手足口病 (HFMD)的症状和神经系统的病变。 因此， 该SCARB2基因转殖鼠可应用做为手足口病的动物 模式。于本发明的一具体实施例， 其是用做为肠病毒 71 型的感染动物模式。于本发明的另 一具体实施例， 其是用做为克沙奇病毒 16 型 (Coxsackie A16) 的感染动物模式。 0010 于另一方面， 本发明是关于一种检测肠病毒疫苗保护效力的方法， 利用上述制造 SCARB2 基因转殖鼠的方法所制得的 hSCARB2 基因转殖鼠为。

17、动物模式， 评估候选肠病毒疫苗 在疫苗接种后施予肠病毒攻毒时， 对于已受免疫的 hSCARB2 基因转殖鼠所产生的抗病毒保 护效力。 0011 于另一方面， 本发明是关于一种筛选出可有效预防或治疗因肠病毒感染所引起的 手足口病的疫苗或药物的方法。于本发明的一具体实施例， 该药物为一种预防性疫苗。于 本发明的另一具体实施例， 该药物为一种抗 - 肠病毒 71 型的中和抗体。 附图说明 0012 图 1 为用于本发明方法的携带有人类基因的表现载体 pEF-1-hSCARB2 的图谱。 0013 图 2 显示藉由使用 SCARB2- 专一性引子进行 PCR 反应， 筛选出带有人类基因 的 found。

18、er 小鼠 (A)， 及所获得 F1、 F2 Tg 小鼠 (B) 的结果。图 2(C) 显示人类 SCARB2 在 SCARB2- 转殖基因鼠的主要器官中的表现。 0014 图 3 为藉由使用 VP1- 专一性引子进行 RT-PCR 反应， 测定于肠病毒 EV71/E59 感染 后第 1 至 4 天， 病毒在 SCARB2-Tg B6 小鼠中的分布情形。 说 明 书 CN 103081868 A 4 3/5 页 5 0015 图4为于施予接种后4至6天， 在仅接种培养基(A)、 非转殖基因小鼠(C)及以107 pfu EV71/E59 感染的 hSCARB2-Tg 转殖基因鼠 (B) 所观察的。

19、类手足口病 (HFMD)， 包括掉毛 与皮屑产生情形。 0016 图 5 为感染后第 8 天至 12 天期间， 所观察到的行动困难与后肢麻痹的计分图。 0017 图 6 为以 VP-1 专一性 RT-PCR 侦测病毒感染后期 ( 感染后 12 天 )， 于小鼠中枢神 经系统及主要器官的 EV-71 病毒分布。 0018 图 7 显示以同型抗体 ( ) 及以抗 EV-71 抗体处理 ( ) 的 hSCARB2-Tg 转殖基 因鼠， 在对抗病毒感染 EV715746-TW98 的存活率。 具体实施方式 0019 本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明， 而该实施范 例仅作为辅助。

20、说明， 并非用于限制本发明的范围。 0020 根据本发明所呈现的各种实施例， 下述各种仪器、 装置、 方法和其相关结果者， 实 施例中为了方便读者阅读所使用的标题或副标题， 并不被限制在本发明的范围之内。 此外， 在此所提出和披露的某些理论， 但无论他们是对还是错， 只要该创作是根据本发明所实施 的， 而不需考虑任何特定的理论或行动的计划， 都应被限制在本发明的范围之内。 0021 实施例 0022 实施例一 ： SCARB2 基因转殖鼠的制备 0023 将所合成得具有密码子最适化的人类SCARB2基因(SEQ ID NO.1)片段使用EcoRI 与 BamHI 限制酶， 插入 pEF-1 质。

21、体 ( 该质体是以 pcDNA3.1(-) 载体 (Invitrogen) 为背景 经修改后而得的载体， 其中原有的巨细胞病毒增效子 / 启动子以增长因子 1(EF-1) 的 启动子取代 ) 中， 位于启动子与牛生长激素 (BGH) 聚 A 尾端间的多重选殖部位 (multiple cloning site)， 而得到 pEF-1-hSCARB2 构体 ( 图 1)。 0024 基因转殖动物的产生是依照Brinster等人(Brinster et al.， 1985)所述的操作 步骤来进行。所使用的 C57BL/6 小鼠购自国家应用研究实验室 - 实验动物中心 (National Applie。

22、d Research Laboratories-Laboratory Animal Center， 台湾 )。进行显微注射 前先将质体以限制酵素线形化， 并使用凝胶萃取套组 (Qiagen， 德国 ) 将其从琼脂糖凝胶 (Thermo Fisher Scientific， IL， USA) 中回收得。 0025 将 1ng 线形 pEF-1-hSCARB2 构体经由显微注射， 导入处于单细胞阶段的已受精 的 C57BL/6 小鼠胚胎中， 接着将该胚胎植入到同品系假怀孕的母鼠内使其发育成鼠。利用 PCR 分析筛检出带有 hSCARB2 蛋白基因型的阳性小鼠， 与原生型同品系小鼠互相交配， 生成 。

23、F0 小鼠。 0026 PCR 分析方法简述如下 ： 使用组织与细胞基因组 DNA 萃取套组 (Tissue &Cell genomic DNA extraction kit， Favorgen， 台湾 ) 从基因转殖鼠尾部萃取出基因组 DNA。藉由使用前向引子 ： 5 -TGGACCAGAGCATCGAGAA-3 (SEQ ID NO.2) 与反向引子 ： 5 -TAGGTGTAGGGGCCCACTT-3 (SEQ ID NO.3) 于 72下 2 分钟进行的 PCR 反应扩增一段长 度为 175bp 的片段 (SEQ ID NO.1 的 98-272bp)， 以侦测 hSCARB2 基因是。

24、否存在基因组 DNA 中。用于进行 PCR 反应的条件设定如下 ： 于 95下 2 分钟 ； 随后进行 40 次包括于 95下 30 秒、 于 50下 30 秒与于 72下 10 秒的循环周期 ； 之后再于 72下反应 2 分钟。 说 明 书 CN 103081868 A 5 4/5 页 6 0027 结果筛检出六只带有转殖基因的小鼠 -No.2( 雄性， m)、 No.9( 雌性， f)、 No.18(m)、 No.27(f)、 No.54(m) 及 No.62(f)( 参见图 2A)。再次以 PCR 分析筛选出其基因型为异核型 (heterozygous) 的阳性 F0 小鼠， 并使呈阳性。

25、 F0 小鼠互相交配生成 F1 小鼠 ； 利用 PCR 分析 筛选得其基因型为同核型 (homozygous) 的阳性 F1 小鼠， 而得 hSCARB2 基因转殖鼠 ( 结果 参见图 2B)。藉由将所得的 hSCARB2 基因转殖鼠个体彼此进行交配， 获得 F1 近亲交配种小 鼠， 以维持该基因转殖纯系。 0028 进 一 步 以 前 述 的 hSCARB2 特 异 性 引 子 对 及 购 自 Roche Universal Probe Library Assay Design Center(Roche， Switzerland) 的 探 针 组，进 行 RT-PCR 分 析 (The480。

26、 Real-Time PCR system)， 来确认及定量人类 SCARB2 蛋白在 F1 基 因转殖鼠的主要器官中的表达。PCR 产物大小为 97bp。使用不同浓度 (5、 0.5 及 0.05pg/ ml) 的 pEF-1-hSCARB2 质体为标准物。比较用以从各器官扩增 hSCARB2 基因所需要的循 环次数。 0029 结果显示， 在取自基因转殖小鼠的包括脑干、 大脑皮质、 延脑与脊髓等中枢神经组 织， 以及肺、 肝、 脾、 肾、 十二指肠、 小肠等主要器官及皮肤中， 皆发现有表现 hSCARB2 转殖基 因 ( 图 2C)。 0030 实施例二 ： SCARB2 基因转殖鼠受肠病。

27、毒感染后的病毒血症及手足口病 (HFMD) 和 神经系统病变的症状分析 0031 将1-天或4-天大的小鼠经皮下注射， 接种入肠病毒EV71E59或5746-tw98分离株 ( 每只小鼠施予 1x106或 1x107pfu， 存在 10L RPMI 培养基中 )， 以模拟观察新生小鼠受病 毒感染后， 肠病毒于小鼠主要器官中的分部情形， 及外在所发生的病症。 对照组施给VP-SFM 培养基。对于肠病毒 EV71 的侦测， 为将经感染的小鼠于特定天数后将其牺牲， 采取血液或 器官组织样本， 并针对 VP1 基因进行专一性的即时 (real-time)RT-PCR。 0032 将自血液样本或组织均质。

28、化产物萃取得的总体 RNA， 进行反转录反应转变成 cDNA。再将所得的 cDNA 使用 EV71 VP1 专一性引子对， 前向引子 ： 5 -AGAGAGTCACTTGCTTGGC AGACA-3 (SEQ ID NO.4) 与反向引子 ： 5 -ACGACTAGTGCCGGTCGGTTTAAT-3 (SEQ ID NO.5)， 进行定量 PCR 分析来侦测 EV71 的存在量。 0033 由图 3 的结果显示， 于肠病毒 EV71 感染后 1 至 6 天， 在 SCARB2-Tg B6 转殖基因鼠 的中枢神经(脑与脊髓)及肝脏、 肺脏、 小肠、 肾脏、 脾脏、 皮肤等， 侦测到有病毒存在。。

29、 此外， 相对于 SCARB2- 转殖基因鼠， 于非转殖基因鼠的神经器官 ( 脑， 脊髓 ) 和主要器官 ( 肝、 肺、 肾、 皮肤等 ) 皆侦测不到病毒量分布， 表示 hSCARB2 的表现对于 EV71 在小鼠中的可感染力 而言很重要。 0034 除了测定病毒量分布， 亦于施予病毒感染后， 每天观察于对照组和实验组小鼠产 生的手足口病 (HFMD) 及神经性毒性 (CNS) 症状。病理分析发现， 以肠病毒 71 型 E59B 型 病毒株感染一天大的 SCARB2 基因转殖鼠， 会使受感染小鼠产生类似出现在人类受肠病毒 EV71- 感染幼儿的红疹， 且有严重毛发掉落伴随皮屑 (scurf) 。

30、产生， 这些症状皆为典型的类 手足口病症状 (HFMD-like syndrome)( 参见图 4)。而且， 在施予感染的转殖基因鼠亦出现 包括前后足麻痹， 而导致行走困难的神经系统病症(CNS-like syndrome)。 在感染后7天开 始， 转殖基因鼠即出现后肢麻痹伴随行动困难的现象， 而非转殖基因鼠在感染后并未呈现 此类似病症， 关于在感染后第 8 天至 12 天期间， 所观察到的行动困难与后肢麻痹的计分结 说 明 书 CN 103081868 A 6 5/5 页 7 果列示于图 5。 0035 而且由图 6 的病毒分布侦测结果显示， 在施予病毒感染后第 12 天， 于已发生后肢 麻。

31、痹的小鼠的脊髓中可侦测到， 但是在没有呈现任何行走困难的非转殖基因鼠， 则没有侦 测到病毒， 表示所观察到的 CNS 病症， 是由于脊随受到肠病毒感染所致。 0036 前述的观察结果均显示， 以肠病毒71型感染新生SCARB2基因转殖鼠， 确实会产生 类似于肠病毒感染在人类婴儿所引起的症状。亦即， 本发明的 SCARB2 基因转殖鼠可有效做 为， 天然存在的肠病毒感染的动物模式。 0037 实施例三 ： 以 SCARB2 基因转殖鼠检测抗 EV-71 抗体对于肠病毒感染的防治功效 0038 本实施例藉由将已知具有肠病毒中和活性的抗 EV-71 单株抗体， 投药予预先经天 然 EV71 5746。

32、-TW98 肠病分离毒株感染的 SCARB2 基因转殖鼠， 并检测该单株抗体对于保护 小鼠对抗肠病毒感染的功效， 以评估及证明本发明的 SCARB2 基因转殖鼠， 做为抗肠病毒药 物筛选平台的实用性。 0039 实验方法简述如下 ： 将 7 天大的 SCARB2 基因转殖鼠以皮下方式， 注射入剂量为 3x104 pfu 的 EV71 5746-TW98 肠病毒株进行感染。接着在注射病毒 4 小时后进行投药， 将 该经过肠病毒株感染的 SCARB2 基因转殖鼠以腹膜内注射方式， 投药以 200g 的同型小鼠 IgG1 抗体 ( 做为对照组 )， 或抗 EV-71 单株抗体 ( 已被鉴定具有中和活。

33、性， 参见 Chang， HW et al.， Journal of Virological Methods7(1) ： 62， 2011)。 0040 图 7 列示于同型抗体处理组 ( 口， 对照组， 总数 10 只小鼠 )， 及抗 EV-71 抗体处理 组 ( ， 实验组， 总数 12 只小鼠 ) 所得的存活率观察结果。于 hSCARB2 基因转殖鼠可明显 区分， EV-71 抗体与对照组抗体在抑制受感染小鼠的致死性上的功效差异， 显示本发明的 hSCARB2 基因转殖鼠可用于评估已知或研发中药物的抗肠病毒感染功效， 或用于评估 EV71 疫苗在此动物模式中的免疫保护效力。 0041 其他。

34、具体态样 0042 本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合方式组合。于是， 本说明书中所揭示 的各别特征可由依相同、 相等或类似目的的替代特征取代。因此， 除非另行清楚地指示， 所 揭示的各特征仅为一系列同等物或类似特征的实例。 0043 从前述的说明， 习于该项技艺人士可容易地确定本发明的基本特征， 且在未偏离 其范围下， 可进行本发明的各种改变与修饰， 以使其适于各种不同用途与状况。因此， 于申 请专利范围内亦包含其他具体态样。 说 明 书 CN 103081868 A 7 1/2 页 8 0001 序 列 表 CN 103081868 A 8 2/2 页 9 0002 序 列 表 CN 。

35、103081868 A 9 1/10 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 10 2/10 页 11 图 2(A) 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 11 3/10 页 12 图 2(B) 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 12 4/10 页 13 图 2(B) 续 图 2(C) 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 13 5/10 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 14 6/10 页 15 图 3 续 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 15 7/10 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 16 8/10 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 17 9/10 页 18 图 6 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 18 10/10 页 19 图 7 说 明 书 附 图 CN 103081868 A 19 。