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1、(10)申请公布号 CN 103145799 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145799 A *CN103145799A* (21)申请号 201310052658.2 (22)申请日 2013.02.18 C07K 7/06(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61K 9/06(2006.01) (71)申请人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工路 2 号 (72)发明人 李晓晖 汪晴 常明明 (74)专利代理机构 大连星海专利事务所 21208 代理人 花向阳 (54) 发明名。
2、称 一组具有促进经皮和跨膜渗透作用的多肽及 其应用 (57) 摘要 一组具有促进经皮和跨膜渗透作用的多肽及 其应用， 适用于经皮和经膜给药系统和化妆品领 域。 该多肽含有11个氨基酸残基， 并由9个氨基酸 残基以二硫键构成环状结构， 其结构特征在于多 肽 N- 端的 N-5， N-6 位为碱性氨基酸或 C- 端酰胺 化。与已报道具有促渗活性的多肽相比， 在 N- 端 的 N-5 或 N-6 位分别用碱性氨基酸取代合成的多 肽以及 C- 端酰胺化多肽可显著提高胰岛素经皮 和跨膜渗透能力。对 N-5， N-6 位同时用碱性氨 基酸取代的多肽的经皮和跨膜促渗能力进一步加 强， 伴随胰岛素共同经皮给药。
3、可显著提高对糖尿 病大鼠的降糖效果， 经皮给药 8 h 内糖尿病大鼠 在体血糖水平降低到原有水平的 20-30%， 该组多 肽可应用于溶液剂、 凝胶剂和软膏剂中， 促进胰岛 素和疫苗等生物大分子药物的经皮和跨膜吸收。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 (10)申请公布号 CN 103145799 A CN 103145799 A *CN103145799A* 1/1 页 2 1. 一组具有促进经皮和跨膜渗透作用的多肽， 多肽含有 11 个氨基酸残基， 并 由 9 个 氨 基 酸。
4、 残 基 以 二 硫 键 构 成 环 状 结 构， 其 特 征 在 于 ： 所 述 多 肽 中 N- 端 的 N-5 或 / 和 N-6 位 点 由 碱 性 氨 基 酸 残 基 构 成，具 体 结 构 ： 及 C- 端酰胺化多肽， 具体结构 ： 2. 根据权利要求 1 所述的一组具有经皮和跨膜促渗作用的多肽应用， 其特征在于 ： 所 述多肽用于制备经皮和经膜给药的溶液剂、 凝胶剂和软膏剂。 权 利 要 求 书 CN 103145799 A 2 1/10 页 3 一组具有促进经皮和跨膜渗透作用的多肽及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一组具有促进经皮和跨膜渗透作用的多肽及其应用， 适用于经皮。
5、和经 膜给药系统和化妆品领域。 背景技术 0002 经皮给药是指药物以一定的速率通过皮肤， 经毛细血管吸收进入体循环而产生药 效， 也指药物通过皮肤吸收， 进入表皮、 真皮或皮下组织， 发挥局部治疗作用， 经膜给药是指 药物通过生物膜进入循环系统而产生疗效。与传统的给药方式相比有许多优点 ： 经皮和 跨膜给药可以降低或避免肝脏的首过作用， 减少毒副作用 ； 避免影响药物胃肠吸收的各种 因素， 如 pH 值、 酶、 药物和食物的结合对药物的影响同时具有缓释作用 ； 可以保持血药水 平稳定在治疗有效浓度范围内 ； 同时可以随时终止给药。尽管这些给药方式是胰岛素等 易酶解亲水性大分子理想的给药途径，。
6、 但由于亲水性大分子通过生物膜， 尤其是角质层吸 收低， 传统给药技术无法满足治疗要求， 目前胰岛素等大分子药物主要以注射方式给药， 患 者适应性较差。因此， 如何实现亲水性大分子药物的有效经皮给药成为制剂领域的一大挑 战 （Shaikh et al.2005,Cur.Pharma.Bio.6:387 ； Huang et al.2006,Jour.of control. Rel.,113:9-14 ； Li et al.2008,Bio.&pharma.Bull.31:1574） 。 0003 目前有报道的可以促进亲水性大分子穿过皮肤主要有如下方法 ： 离子导入 法 （Kanikkannan。
7、 et al.1999,Jour.of control.Rel.59:99.） 、超 声 导 入 法 （Boucaud et al.2002Jour.of control.Rel.81:113.） 、 电致孔法 （Sen et al.2002,Bio.et bio. acta1564:5.） 及微针导入法 （Zhou et al.2010,Inter.Jour.of pharma.,392:127.） 等。 此外， 有研究分别报道了多肽和可以促进胰岛素类 亲水性大分子经鼠皮吸收 （Chen et al.2006,Nature bio.24:455 ； Hou et al.2007,Exp. D。
8、erma.16:999-1006 ； Hsu et al.2011,Proc.Natl.Acad.Sci.108:15816） 。研究表明亲水 性大分子药物主要是通过毛囊部位进入体内 （Carmichael et al.2010,Pain,149:316.） ， 而现有的促渗多肽存在着对胰岛素经皮促渗效能较低的问题， 由于人体毛囊数量较少 （Prausnitz,2006,Nature bio.24:416.） ， 因此， 研究开发对生物大分子药物具有更高促渗 作用的多肽十分迫切和必要。 0004 人们对肽在药物转运方面的研究最初主要集中于富含碱性氨基酸的细胞穿膜 肽， 如 果 蝇 触 足 肽 。
9、Antp（Derossi et al.1994,The Jour.of bio.chem.269:10444） 、 人免疫缺陷病毒反式激活蛋白 TAT（Brooks et al.2005,Adv.Dru.Del.Rev.57:559） 、 PEP-1（Hallbrink et al.2001,Bio.et bio.acta1515:101.） 和多聚精氨酸 （Futaki et al.2001,The Jour.of bio.chem.276:5836.） 等， 这些穿膜肽本身可以穿过人或动物的皮 肤， 部分穿膜肽还可以通过与蛋白共价链接的方式携带蛋白穿过皮肤或生物膜 （Lopes et al。
10、.2005,Pharma.Res.22:750.Patel et al.2009,Mol.Pharma.6:492.） 。在促渗机理方 面， 人们已发现赖氨酸或精氨酸的碱性基团对穿膜肽的促渗活性具有重要影响 （Beerens 说 明 书 CN 103145799 A 3 2/10 页 4 et al.2003,Curr.gene therapy3:486.） ， 同时发现高度亲水的富含碱性基团的穿膜肽 通过可逆性的疏松细胞间的紧密连接促进亲水性药物跨膜转运 （Ohtake et al.2002,J. controlled release,82:263） 。 0005 目前对多肽经皮促渗活性的筛。
11、选方法主要采用动物在体实验方法， 该方法 耗时， 由于动物个体差异， 需要大量动物样本且分析稳定性差。Caco-2 细胞广泛应用 于评价药物跨膜渗透的能力和促渗剂对药物促渗效果的体外评价 （Torres-Lugo et al.2002,Biotechnol.Prog.18:612） ， 有报道表明上皮组织与 Caco-2 细胞单层膜类似， 存 在着细胞间紧密连接 （Morita et al.2003,J.Dermatol.Sci.31:81） 。 发明内容 0006 本发明旨在通过对已有促渗活性多肽结构改造， 提供一组新 型高效的促进经皮和跨膜渗透作用的多肽， 提高胰岛素和疫苗等大分子药物经皮。
12、和跨膜渗 透能力并提供相关技术手段。 0007 本 发 明 采 用 的 技 术 方 案 是 ： 在 多 肽基 础 上， 通 过 碱 性氨基酸扫描， 明确碱性氨基酸种类、 数量和位点对提高多肽经皮促渗活性的 影响。通过对已有促渗活性多肽结构改造， 合成更为高效的经皮和跨膜促渗多 肽。该组多肽含有 11 个氨基酸残基， 并由 9 个氨基酸残基以二硫键构成环状结 构， N- 端 的 N-5 和 N-6 位 点 由 碱 性 氨 基 酸 残 基 构 成， 具 体 结 构 ： 或 C- 端 酰 胺 化， 具 体 结 构 ： 其他位点的碱性氨基酸取代的多肽与原有多肽 的经皮和跨膜促渗效果没有显著性差异。 0。
13、008 上述技术方案采用碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸扫描， 研究碱性氨基酸种类、 数 量及位点对经皮和跨膜促渗活性的影响。 明确了多肽结构中的N-5， N-6 位为结构改造活性位点， 采用碱性氨基酸赖氨酸 （K） 和精氨酸 （R） 取代或者 C- 端酰胺化 的多肽可以显著提高对胰岛素经皮渗透的促渗活性， 可以协助亲水性大分子药物穿过皮肤 及生物膜屏障的各种制剂， 包括胰岛素及各种疫苗等。多肽可以采用固相多肽合成法进行 合成。 0009 本发明的有益效果是 ： 所述的具有透皮和跨膜促渗作用的多肽含有 11 个氨基酸 残基， 并由9个氨基酸残基以二硫键构成环状结构， 对多肽中N-5， N-6位 碱性氨。
14、基酸取代合成的多个多肽序列， 与多肽相比， 亲水性大分子的经 皮和跨膜渗透能力均有明显提高， 对 N-5， N-6 位同时用 K 和 / 或 R 进行取代的多肽促渗活 性得到进一步加强， 提高了胰岛素经皮给药对糖尿病大鼠的降糖效果， 经皮给药 8h 内糖尿 说 明 书 CN 103145799 A 4 3/10 页 5 病大鼠在体血糖水平到原有水平的 20-30%， 另外还可以显著提高胰岛素跨细胞膜的转运能 力。 具体实施方式 0010 以下通过非限定性实施例进一步详细说明本发明 ： 0011 实施例 1 0012 糖尿病大鼠模型建立 ： SD 大鼠禁食一宿后称重， 按 70mg/kg 空腹体。
15、重注射相应的 链脲佐菌素， 在 30min 内注射完毕。建模 10 天左右后选取血糖值 20-30mmol/L 的 SD 大鼠 进行多肽筛选实验。用生理盐水润湿剪去腹毛， 使大鼠皮肤暴露的面积在 4cm2作用并用生 理盐水洗净。经皮给药后， 在体观察 SD 大鼠血糖经时变化和研究多肽促进胰岛素经皮渗透 能力， 对合成的系列多肽的经皮促渗能力进行筛选。 0013 实施例 2 0014 Caco-2 细胞培养方法 ： 将 40-60 代的 Caco-2 细胞种于 25cm2细胞培养瓶中。DMEM 培养基中含有 ： 20%太牛血清， 1%(v/v)非必须氨基酸， 2mmol/L L-谷氨酰胺， 10。
16、0IU/mL青霉 素， 100g/mL 链霉素 (pH=7.4)。培养条件为 37 C， 5%CO2， 95% 空气和 90% 相对湿度， 每周 更换三次培养基。 0015 实施例 3 0016 胰岛素跨膜转运实验 ： 将Caco-2细胞接种于12孔Transwell培养板中， 接种密度 为 2105cells/mL。培养 20-22 天后形成细胞单层膜。转运实验前， 将 Caco-2 细胞单层膜 用37C的HBSS孵育10min。 同时检测细胞单层膜的电阻值以保证细胞膜完整性。 选择电 阻值大于 400cm2的细胞单层膜进行转运实验。BL 侧加入 1.5mL21IU/mL 胰岛素溶液， 或者。
17、 1.5mL21IU/mL 胰岛素和 5mol/mL 多肽 （序列 1-10） 溶液， AP 侧加入 0.5mL Hank s 溶液加入。分别于不同时间点 （0.5h,1h,1.5h 和 2h） 从 AP 侧吸取 100L 接收液同时检测 细胞单层膜的跨膜电阻， HPLC 法检测接收液中胰岛素浓度。观察胰岛素浓度经时变化和研 究多肽促进胰岛素跨膜渗透能力， 对合成的系列多肽的跨膜促渗能力进行筛选。胰岛素跨 膜渗透系数变化情况见表 1。 0017 实施例 4 0018 以多肽序列 1为例， 说明采用固相合成方法合成多肽。 0019 采用微波辅助多肽固相合成法 ： 以 Wang 树脂为固相载体， 。
18、HBTU-HOBt 为缩合剂， Fmoc 为 - 氨基保护基的合成策略。 0020 称取 0.1mmol 的 Fmoc- 甘氨酸 -Wang 树脂于固相反应器中， 加入 10mL 的 DCM 溶胀 树脂 30min， 待树脂充分溶胀， 真空抽干溶剂。用 20% 哌啶 /DMF10mL 洗涤一次， 向树脂中加 入 20% 哌啶 /DMF10mL 并置于微波辅助固相合成仪中， 于 60 C， 20W 条件下反应 3min 脱除 Fmoc保护基， 依次用DCM、 DMF洗涤， 保护基脱除采用Kaiser法进行检测， 检测呈阳性可继续 反应。将 3eq 的 Fmoc- 氨基酸 -OH、 HBTU 和 。
19、HOBt 用 DMF 溶解， 滴加 5eq 的 DIEA 静置 2min 使其充分活化， 加入固相反应器中， 于60C， 20W条件下反应5min， 缩合完成后， 用DCM， DMF 依次洗涤树脂。重复以上各步反应得到所需直链多肽， 用 TFA/TIS/H2O 为 95:2.5:2.5 溶液 10mL， 常温反应 2h 去掉 N- 端和侧链保护基并切除树脂， 用 DCM 洗涤三次， 滤液浓缩至最小 说 明 书 CN 103145799 A 5 4/10 页 6 体积后， 加入 30 倍体积冰乙醚， 在 4 C 条件下， 10000r/min 离心 15min， 弃去上清液， 重复 结晶两次， 。
20、真空干燥得到多肽直链产物。将多肽溶于 25% 甲醇水溶液中， 分 5 次每次间隔 30min加入2.5eq碘进行氧化反应， 室温搅拌反应2h后浓缩， 得到粗产品。 纯化采用凝胶层 析色谱 Sephadex G-15， 洗脱液为 50% 甲醇水溶液， 产物经 HPLC 和 ESI-MS 进行鉴定。 0021 实施例 5 0022 多肽序列 9的固相合成方法。 0023 采用 0.1mmol 的酰胺 MBHA 树脂进行固相合成， 其他步骤同实施例 2。 0024 实施例 6 0025 将 0.5mol 多肽 （序列 1-9） 分别与 2.1IU 胰岛素混合， 再分别溶于 100mg 生理盐 水中，。
21、 均匀涂于实施例 1 的糖尿病大鼠腹部 4cm2。于给药后 0h， 2h， 5h， 8h 尾静脉取血， 同时 检测 SD 大鼠血糖水平， 糖尿病大鼠血糖变化情况见表 2。 0026 实施例 7 0027 将 PEG4000 和 PEG400 按照 2:3 混合加热熔融， 制备软膏基质， 将 0.051.5mol 多肽 （序列 1-9） 分别与 0.212.1IU 胰岛素混合， 再分别与 100mg 软膏基质均匀混合制备成 含促渗多肽的胰岛素软膏。 0028 实施例 8 0029 制备Carbopol941凝胶基质 （含1%wt Carbopol941， 1.2%wt三乙醇胺， pH=67） ，。
22、 将 0.051.5mol 多肽 （序列 1-9） 分别与 0.212.1IU 胰岛素混合， 再分别与 100mg 凝胶基质 均匀混合， 制备成含促渗多肽的胰岛素凝胶。 0030 对比实验 1 0031 将 0.5mol 对比多肽 （序列 10） 与 2.1IU 胰岛素混合， 溶于 100mg 生理盐水中， 均 匀涂于实施例 1 的糖尿病大鼠腹部 4cm2。于给药后 0h， 2h， 5h， 8h 尾静脉取血， 同时检测 SD 大鼠血糖水平， 糖尿病大鼠血糖变化情况见表 2。 0032 对比实验 2 0033 将 2.1IU 胰岛素溶于 100mg 生理盐水中作为对照溶液， 均匀涂于实施例 1 。
23、的糖尿 病大鼠腹部 4cm2。于给药后 0h， 2h， 5h， 8h 尾静脉取血， 同时检测 SD 大鼠血糖水平。部分实 施例对糖尿病大鼠经皮给药后， 糖尿病大鼠血糖变化情况见表 2。 0034 表 1 胰岛素的 Caco-2 细胞膜渗透系数 0035 说 明 书 CN 103145799 A 6 5/10 页 7 0036 表 2 糖尿病大鼠血糖经时变化 0037 0038 说 明 书 CN 103145799 A 7 6/10 页 8 0039 *P 0.05， *P 大连理工大学 0043 一组具有促进经皮和跨膜渗透作用的多肽及其应用 0044 案卷参考号 0045 申请号 0046 2。
24、013-02-17 说 明 书 CN 103145799 A 8 7/10 页 9 0047 9 0048 1 0049 11 0050 PRT 0051 人工合成序列 0052 0053 二硫键 0054 （2） .（10） 0055 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous deliver。
25、y) 0056 1 0057 Ala Cys Ser Ser Lys Pro Ser Lys His Cys Gly 0058 1 5 10 0059 2 0060 11 0061 PRT 0062 人工合成序列 0063 0064 二硫键 0065 （2） .（10） 0066 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal 。
26、and membranous delivery) 0067 2 0068 Ala Cys Ser Ser Ser Lys Ser Lys His Cys Gly 0069 1 5 10 0070 3 0071 11 0072 PRT 0073 人工合成序列 0074 0075 二硫键 0076 （2） .（10） 0077 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement ac。
27、tivity on transdermal and membranous 说 明 书 CN 103145799 A 9 8/10 页 10 delivery) 0078 3 0079 Ala Cys Ser Ser Arg Pro Ser Lys His Cys Gly 0080 1 5 10 0081 4 0082 11 0083 PRT 0084 人工合成序列 0085 0086 二硫键 0087 （2） .（10） 0088 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and 。
28、charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous delivery) 0089 4 0090 Ala Cys Ser Ser Ser Arg Ser Lys His Cys Gly 0091 1 5 10 0092 5 0093 11 0094 PRT 0095 人工合成序列 0096 0097 二硫键 0098 （2） .（10） 0099 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed pept。
29、ide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous delivery) 0100 5 0101 Ala Cys Ser Ser Lys Lys Ser Lys His Cys Gly 0102 1 5 10 0103 6 0104 11 0105 PRT 0106 人工合成序列 0107 0108 二硫键 0109 （2） .（10） 说 明 书 CN 103145799 A 10 9/10 页 11 0110 设计的多。
30、肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge ofamino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous delivery) 0111 6 0112 Ala Cys Ser Ser Arg Arg Ser Lys His Cys Gly 0113 1 5 10 0114 7 0115 11 0116 PRT 0117 人工合成序列 0118 0119 二硫键 012。
31、0 （2） .（10） 0121 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous delivery) 0122 7 0123 Ala Cys Ser Ser Arg Lys Ser Lys His Cys Gly 0124 1 5 10 0125 8 0126 11 0127 PRT 0128 人工。
32、合成序列 0129 0130 二硫键 0131 （2） .（10） 0132 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous delivery) 0133 8 0134 Ala Cys Ser Ser Lys Arg Ser Lys His Cys Gly 0135 1 5 10 0136 9 01。
33、37 11 0138 PRT 0139 人工合成序列 说 明 书 CN 103145799 A 11 10/10 页 12 0140 0141 二硫键 0142 （2） .（10） 0143 设计的多肽基于改变序列中氨基酸残基的位置和带电性， 以达到增加对 皮肤和生物膜的促渗作用 .(Designed peptide based on site and charge of amino acid residue to act as a enhancement activity on transdermal and membranous delivery) 0144 9 0145 Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys Gly-NH2 0146 1 5 10 说 明 书 CN 103145799 A 12 。