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1、(10)申请公布号 CN 103320485 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103320485 A *CN103320485A* (21)申请号 201310217326.5 (22)申请日 2013.06.03 C12P 21/06(2006.01) C07K 14/78(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (71)申请人 王南平 地址 200083 上海市虹口区恒业路 115 弄 5 号 502 室 申请人 何兰 曹俊 郭休玉 (72)发明人 王南平 何兰 曹俊 郭休玉 (。
2、74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11411 代理人 曾少丽 (54) 发明名称 一种医用级生物材料用鱼皮胶原的制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种医用级生物材料用鱼皮胶原 的制备方法， 包括原料处理， 胶原提取， 提取物纯 化等步骤。采用本发明的医用级生物材料用鱼皮 胶原制备方法， 可充分有效的去除鱼皮的非胶原 成分， 获得羟脯氨酸含量 9%， 非胶原蛋白含量 1%， 灰分 1% 的高纯度的胶原， 可更大范围的 利用鱼类资源， 工艺简单易操作， 加工时间短， 适 合于工业化生产， 并且生物相容性效果明显。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 。
3、说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103320485 A CN 103320485 A *CN103320485A* 1/1 页 2 1. 一种医用级生物材料用鱼皮胶原的制备方法， 其特征在于， 所述鱼皮胶原按照以下 步骤进行 ： 1） 原料处理 ： 将清洗干净并脱水后的海鱼或淡水鱼的鱼皮绞碎成 0.5 5cm2的小块 后， 加入料液比 1:30（w/w） 的 2 5%NaCl 盐溶液， 0 4搅拌 8 12 小时后排除废液， 并重复 3 4 次， 用去离子水清洗， 将清洗后。
4、的鱼皮以料液比 1:30 （w/w） 放入 0.05 0.2M NaOH 溶液中搅拌 32 48 小时， 每间隔 8 12 小时更换所述 NaOH 溶液一次， 再用去离子水 充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性 ； 2） 胶原提取 ： 将清洗后的鱼皮以料液比 1:10 30（w/w） 的比例放入 0.2 1M 的酸 性溶液中捣碎， 搅拌 4 8 小时后离心， 取上清液得酸溶性胶原液， 并重复 2 3 次， 合并离 心后的上清液并加入 0.1% 1% 的蛋白酶搅拌 24 60 小时， 酶化处理得酶解胶原液 ； 3） 提取物纯化 ： 加入饱和的 NaCl 溶液， 直至所述胶原液中的盐含量达到 2 。
5、5%， 静置 2 6 小时后离心， 获取沉淀粗胶原蛋白， 将所述粗胶原蛋白以料液比 1:5 10（w/w） 溶 解在纯水中， 用半透膜透析 4 6 次， 纯化胶原液并用 -60进行冷冻干燥处理， 获得水分 14% 的医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。 2. 如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 1） 中采用的鱼皮为 新鲜或冷冻的各类海鱼或淡水鱼鱼皮。 3. 如权利要求 2 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述海鱼鱼皮为鳕鱼鱼皮、 鲽 鱼鱼皮、 鱿鱼鱼皮、 马哈鱼皮， 淡水鱼皮为罗非鱼鱼皮、 青鱼鱼皮、 草鱼鱼皮、 鲢鱼鱼皮、 鳙鱼 鱼皮。 4. 如权利要求。
6、 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 1） 中清洗鱼皮的步 骤为 : 将去除鱼鳞、 残肉及脂肪等杂物的新鲜的或冷冻的海鱼或淡水鱼的鱼皮以料液比 1 ： 20 30（w/w） 0 4的纯水进行搅拌， 清洗 30 分钟后排除废水并重复一次。 5. 如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 1） 中处理所述鱼皮 至中性的步骤为 ： 用去离子水漂洗 4 次， 每次 0.5 1 小时， 至 pH7 8。 6. 如权利要求 1 或 5 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 1） 中的去离子 水温度为 0 4， 鱼皮与所述去离子水的料液比为 1:30（w。
7、/w） 。 7. 如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 2） 中的酸性溶液为 乙酸、 磷酸或柠檬酸溶液。 8. 如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 2） 中的蛋白酶为胃 蛋白酶、 胰蛋白酶或碱性蛋白酶。 9. 如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述步骤 3） 中所述半透膜透 析的步骤为 ： 用半透膜截留分子量 100KD， 透析外液为 0 4料液比 1:20 40（w/w） 的 纯水， 每 8 12 小时更换所述透析液一次， 重复 4 6 次。 10. 如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法， 其特征在于， 所述鱼。
8、皮胶原的制备步骤均 在 0 4的条件下进行。 权 利 要 求 书 CN 103320485 A 2 1/5 页 3 一种医用级生物材料用鱼皮胶原的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医用材料制备领域， 尤其涉及一种从鱼皮中提取可作为生物医用 材料的天然高分子胶原的方法。 背景技术 0002 胶原是动物体内含量最丰富的重要结构性蛋白， 广泛分布于从水生动物到脊椎动 物所有多细胞动物的皮肤、 骨骼、 软骨、 牙齿、 肌腱、 韧带、 血管中， 是支持组织和结缔组织的 主要组成成分， 约占机体总蛋白的 25%， 在动物体内起支撑器官、 保护机体、 连接、 营养等多 种功能。 0003 哺乳动物。
9、的胶原纤维大部分属于 I 型胶原蛋白， I 型胶原蛋白由 2 条 1肽链和 1 条 2肽链通过 螺旋结构形成三股螺旋的超螺旋结构。这一独特的结构赋予它很多有 用的特征 ： 高拉伸强度、 生物降解性、 促进细胞生长等。 在临床上用作止血材料， 软组织填充 材料等方面， 是重要的天然高分子材料之一。近 10 余年来， 随着分子生物学、 遗传学、 材料 应用学等学科的迅速发展， 胶原的性质和生物学功能得到更深入认识和理解， 胶原蛋白的 应用范围得到了极大的拓展， 尤其在生物医学材料和组织工程相关生物材料等领域的应用 受到广泛关注。 0004 天然高分子胶原来源广泛， 可以从陆生动物如猪、 牛的皮、 。
10、骨、 腱等部位获取。 也可 以从水生动物中如鱼皮 / 鳞中获取。由于陆生动物的流行性疾病频发， 疯牛病、 口蹄疫等疾 病 , 不仅使陆生动物受到生存威胁， 其制品也对人类造成了人畜共患病的风险。而水生动 物以其更安全、 更低的抗原性而备受关注。 鱼类的胶原蛋白主要富集在鱼皮和鱼鳞中， 尤其 在鱼皮中胶原蛋白占其总蛋白质的70%左右， 鱼皮中的胶原蛋白属于I型胶原蛋白， 是制备 生物医用材料的优质材料。 0005 鱼皮在水产品加工过程中往往作为废弃资源处理， 未能得到很好的充分的利用。 据统计每年仅各种鱼皮在加工过程中被废弃的数量达数万吨之多， 既污染环境又浪费资 源。 0006 现有技术中主要。
11、是利用深海鱼类的鱼皮， 甚至只能加工特定鱼类的鱼皮才能得到 医用级生物材料用鱼皮胶原， 操作步骤繁琐， 加工时间较长， 并且得到的鱼皮胶原蛋白含量 较低， 灰分较高， 没有很好的生物相容性， 应用范围较窄。在目前国内外公开的有关利用鱼 皮提取胶原蛋白的研究文献中， 也存在采用 EDTA 对原料进行预处理的加工工艺， 这种工艺 生产过程污染严重， 提取周期长， 仅前处理工艺就需至少一周， 难以实现工业化。 0007 鱼的种类非常丰富， 又生存在海水和淡水不同环境， 使鱼皮的结构有差异性， 至今 尚未发现关于完整有效的可工业化制备医用级生物材料用鱼皮胶原的方法的报导。 发明内容 0008 针对医用。
12、级生物材料用鱼皮胶原制备中存在的上述问题， 本发明提供一种新型制 备方法。 说 明 书 CN 103320485 A 3 2/5 页 4 0009 本发明提供一种医用级生物材料用鱼皮胶原的制备方法， 按照以下步骤进行 ： 0010 1） 原料处理 ： 将清洗干净并脱水后的海鱼或淡水鱼的鱼皮绞碎成 0.5 5cm2的 小块后， 加入料液比 1:30（w/w） 的 2 5%NaCl 盐溶液， 0 4搅拌 8 12 小时后排除废 液， 并重复 3 4 次， 用去离子水清洗， 将清洗后的鱼皮以料液比 1:30（w/w） 放入 0.05 0.2M NaOH 溶液中搅拌 32 48 小时， 每间隔 8 1。
13、2 小时更换所述 NaOH 溶液一次， 再用去 离子水充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性 ； 0011 2） 胶原提取 ： 将清洗后的鱼皮以料液比 1:10 30（w/w） 的比例放入 0.2 1M 的 酸性溶液中捣碎， 搅拌 4 8 小时后离心， 取上清液得酸溶性胶原液， 并重复 2 3 次， 合并 离心后的上清液并加入 0.1% 1% 的蛋白酶搅拌 24 60 小时， 酶化处理得酶解胶原液 ； 0012 3） 提取物纯化 ： 加入饱和的 NaCl 溶液， 直至胶原液中的盐含量达到 2 5%， 静置 2 6 小时后离心， 获取沉淀粗胶原蛋白， 将粗胶原蛋白以料液比 1:5 10（w/w） 。
14、溶解在 纯水中， 用半透膜透析 4 6 次， 纯化胶原液并用 -60进行冷冻干燥处理， 获得水分 14% 的医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。 0013 优选地， 步骤 1） 中采用的鱼皮为新鲜或冷冻的各类海鱼或淡水鱼鱼皮 ； 0014 优选地， 鱼皮胶原制备方法采用的海鱼鱼皮为鳕鱼鱼皮、 鲽鱼鱼皮、 鱿鱼鱼皮、 马 哈鱼皮， 淡水鱼皮为罗非鱼鱼皮、 青鱼鱼皮、 草鱼鱼皮、 鲢鱼鱼皮、 鳙鱼鱼皮 ； 0015 优选地， 步骤 1） 中清洗鱼皮的步骤为 : 将去除鱼鳞、 残肉及脂肪等杂物的新鲜的 或冷冻的海鱼或淡水鱼的鱼皮以料液比 1 ： 20 30 （w/w） 0 4的纯水进行搅拌， 清洗 。
15、30 分钟后排除废水并重复一次 ； 0016 优选地， 步骤 1）中处理所述鱼皮至中性的步骤为 ： 用去离子水漂洗 4 次， 每次 0.5 1 小时， 至 pH7 8 ； 0017 优选地， 步骤 1） 中的去离子水温度为 0 4， 鱼皮与去离子水的料液比为 1:30 （w/w） ； 0018 优选地， 步骤 2） 中的酸性溶液为乙酸、 磷酸或柠檬酸溶液 ； 0019 优选地， 步骤 2） 中的蛋白酶为胃蛋白酶、 胰蛋白酶或碱性蛋白酶 ； 0020 优选地， 步骤 3） 中半透膜透析的步骤为 ： 用半透膜截留分子量 100KD， 透析外液为 0 4料液比 1:20 40（w/w） 的纯水， 每。
16、 8 12 小时更换透析液一次， 重复 4 6 次 ； 0021 优选地， 鱼皮胶原的制备步骤均在 0 4的条件下进行。 0022 本发明的有益效果在于 ： 0023 1） 可充分有效的去除鱼皮的非胶原成分， 获得羟脯氨酸含量 9%， 非胶原蛋白含 量 1%， 灰分 1% 的高纯度的胶原 ; 0024 2） 本方法既可以适用海洋鱼类鱼皮的胶原制备， 也可以适用淡水鱼类鱼皮的胶原 制备， 既可以采用新鲜鱼皮， 也可以采用冷冻鱼皮， 能够鱼类品种的多样性问题， 更大范围 的利用鱼类资源 ； 0025 3） 工艺简单易操作， 加工时间短， 适合于工业化生产 ； 0026 4） 生物相容性好， 优于生。
17、物医用材料低抗原性的基本要求。 附图说明 0027 读者在参照附图阅读了本发明的具体实施方式之后， 将会更清楚地了解本发明的 说 明 书 CN 103320485 A 4 3/5 页 5 各个方面。其中， 0028 图 1 示出了依据本发明， 医用级生物材料用鱼皮胶原制备的工艺流程图 ； 0029 图 2 示出了依据本发明， 鱼皮胶原的 SDS-PAGE 图谱。符号 M 下面的数字是蛋白质 分子量标记， 单位是千道尔顿 （KD） 。 符号A是牛血清白蛋白 （BSA） ， 符号B是标记 （Marker） ， 符号 C 是鱼皮胶原。条带 1 是杂蛋白， 条带 2 是三聚体， 条带 3 是二聚体， 。
18、条带 4 是 1， 条 带 5 是 2。 具体实施方式 0030 为了更清楚地理解本发明的技术内容， 下面参照附图， 对本发明的实施方式作进 一步的详细描述。 0031 图 1 示出了依据本发明， 医用级生物材料用鱼皮胶原制备的工艺流程图， 参照图 1， 本发明采用新鲜或冷冻海水鱼或淡水鱼鱼皮， 海鱼鱼皮可采用鳕鱼鱼皮、 鲽鱼鱼皮、 鱿鱼 鱼皮、 马哈鱼皮等， 淡水鱼皮可采用罗非鱼鱼皮、 青鱼鱼皮、 草鱼鱼皮、 鲢鱼鱼皮、 鳙鱼鱼皮 等。鱼皮在去除附着鱼鳞， 残肉及脂肪等等杂物后， 以料液比 1 ： 20 30（w/w） 0 4的 纯水搅拌， 清洗 30 分钟后排除废水， 清洗 2 遍， 脱水。
19、。 （S1） 0032 将鱼皮绞碎成 0.5 5cm2的小块， 加入料液比 1:30（w/w）的 2 5%NaCl 盐溶 液， 0 4搅拌 8 12 小时后排除废液， 并重复 3 4 次， 用 0 4去离子水 （料液比为 1:30w/w） 漂洗 4 次， 每次 0.5 1 小时，（S2） 再将鱼皮用 0 4 0.05 0.2M NaOH（料 液比为 1:30w/w） 搅拌 32 48 小时， 每间隔 8 12 小时更换溶液一次， 用 0 4去离子 水 （料液比为 1:30w/w） 漂洗 4 次， 每次 0.5 1 小时， 至 pH7 8。 （S3） 将鱼皮置于 0 4 0.2 1M 的乙酸、 。
20、磷酸或柠檬酸溶液中 （料液比为 1 ： 10 30w/w） 捣碎， 搅拌 4 8 小 时， 在 0 4， 转速 10000 15000rpm 的条件下离心， 取上清液， 将沉淀鱼皮再置于 0 4， 0.2 1M 乙酸、 磷酸或柠檬酸溶液中 （料液比为 1 ： 20 30w/w） 搅拌， 重复 2 3 次， （S4） 合并上清液， 加入 0.1% 1% 的胃蛋白酶、 胰蛋白酶或碱性蛋白酶， 在 0 4条件酶 解 24 60 小时，（S5） 加入饱和 NaCl 溶液搅拌至溶液盐浓度为 2 5%， 静置 2 6 小时 后， 在 0 4离心， 转速 10000 15000rpm， 取沉淀胶原，（S6）。
21、 将胶原用纯水溶解 （1:5 10w/w） 透析 48 72 小时， 半透膜截留分子量 100KD， 透析外液为 0 4料液比 1:20 40 （w/w） 的纯水， 每 8 12 小时更换所述透析液一次， 重复 4 6 次。最后， 取纯化胶原溶液 在 -60低温冷冻干燥机冻干至水分 14% 以下， 获得医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶 原。 （S7） 0033 实施例 1 0034 取新鲜鳕鱼皮200g去净残肉及脂肪， 用切片机切成1cm1cm小块， 用20倍4纯 水漂洗 30 分钟， 并重复一次， 沥干。将鱼皮放入 4 3%NaCl 溶液中， 料液比 1:30 （w/w） ， 搅 拌 40 。
22、小时， 每 10 小时换液一次， 沥干。用去离子水 4 1:20（w/w） 清洗 4 次， 每次 30 分 钟， 沥去水。 0035 将鱼皮放入 4 0.2M NaOH 溶液中， 料液比 1:30（w/w） ， 搅拌 40 小时， 每 10 小时 换液一次， 沥干。用去离子水 4（1:30w/w） 清洗 3 次， 每次 1 小时， 至 pH7 8， 沥去水。 0036 将洗净的鱼皮放入 4 0.5M 的磷酸溶液中， 料液比 1:30 搅拌后在 4条件下用 10000rpm 离心， 取上清液备用。将离心沉淀物再加入 0.5M 磷酸溶液， 料液比 1:20 （w/w） 捣 说 明 书 CN 103。
23、320485 A 5 4/5 页 6 碎， 搅拌 3 小时。在 4条件下离心， 转速为 10000rpm， 取上清液备用。将离心沉淀物再加 入 0.5M 乙酸溶液， 料液比 1:20（w/w） 搅拌 4 小时， 并在 4条件下离心， 转速为 10000rpm， 取上清液， 合并 3 次上清液， 加入 0.2% 的胃蛋白酶， 4条件下连续搅拌处理 60 小时。 0037 加入饱和 NaCl 溶液盐析使料液中 NaCl 浓度为 3%， 沉淀静置。将盐析溶液在 4 条件下低温离心， 转速为 10000rpm， 收集沉淀的粗胶原蛋白。将粗胶原以 1:10（w/w） 比例 放入 4纯水中溶解， 以 1:。
24、20 （w/w） 纯水为透析外液， ， 半透膜截留分子量 100KD 进行透析， 在 4条件下透析处理 48 小时， 每 8 小时更换一次透析外液。 0038 收集透析外液放入 -60低温冷冻干燥机冻干至水分 14% 以下， 获得医用级生物 材料用天然高分子鱼皮胶原。 0039 实施例 2 0040 取新鲜罗非鱼皮 200g 去净鳞、 残肉及脂肪， 用切片机切成 1cm1cm 小块， 用 20 倍 4纯水漂洗30分钟， 并重复一次， 沥去水。 将鱼皮放入4的4% NaCl溶液中， 料液比1:30 （w/w） ， 搅拌 36 小时， 每 8 小时换液一次， 沥去水， 用去离子水 4 1:20（w。
25、/w） 清洗 4 次， 每 次 30min， 沥去水。 0041 将鱼皮放入 4 0.1M NaOH 溶液中， 料液比 1:30（w/w） ， 搅拌 48 小时， 每 12 小时 换液一次， 沥去水。用去离子水 4 （1:30w/w） 清洗 3 次， 每次 1 小时， 至 Ph7 8， 沥去水。 0042 将洗净的鱼皮放入4 0.5M的乙酸溶液中， 料液比1:30用组织捣碎机捣碎， 搅拌 4 小时在 4条件下用 10000rpm 离心， 取上清液。将沉淀物放入 4 0.5M 的乙酸溶液中， 料液比 1:20， 搅拌 4 小时， 在 4条件下用 10000rpm 离心， 取上清液。合并 2 次上。
26、清液， 将 上清液中加入 0.3% 的胃蛋白酶， 在 4条件下连续搅拌处理 48 小时。 0043 加入饱和 NaCl 溶液盐析使料液中 NaCl 浓度为 4%， 沉淀静置。将盐析溶液在 4 条件下离心， 转速为 10000rpm， 收集沉淀的粗胶原蛋白， 将粗胶原以 1:10（w/w） 比例放入 4 0.5M 纯水中溶解， 以 1:20 （w/w） 纯水为透析外液， 半透膜截留分子量 100KD 进行透析， 在 4条件下透析处理 48 小时， 每 8 小时更换一次透析外液， 获得纯化胶原溶液。 0044 纯化胶原液放入 -60低温冷冻干燥机冻干至水分 14% 以下， 获得医用级生物材 料用天。
27、然高分子鱼皮胶原。 0045 图 2 示出了依据本发明， 鱼皮胶原的 SDS-PAGE 图谱。本图谱采用的是本实施例 中新鲜罗非鱼的鱼皮胶原蛋白。符号 M 下面的数字是蛋白质分子量标记， 单位是千道尔顿 （KD） 。符号 A 是牛血清白蛋白 （BSA） ， 符号 B 是标记 （Marker） ， 符号 C 是鱼皮胶原。条带 1 是杂蛋白， 条带 2 是三聚体， 条带 3 是二聚体， 条带 4 是 1， 条带 5 是 2。由图 2 可知， 采 用本发明的鱼皮胶原制备方法， 可获得高纯度的胶原， 具体对比数据如表 1 所示 ： 0046 表 1 ： 新鲜罗非鱼的鱼皮胶原蛋白 SDS-PAGE 图谱。
28、分析 0047 条带编号条带含量 （%）分子量 （KD）相对迁移率 10.81372.730.028 22.28328.790.072 说 明 书 CN 103320485 A 6 5/5 页 7 348.09257.580.142 434.11116.900.313 514.71108.440.342 0048 采用本发明的鱼皮胶原制备方法， 新鲜罗非鱼的鱼皮胶原蛋白含量可达到 99.19%。 0049 经过大鼠型胶原蛋白 （col-） 酶联免疫分析， 利用本发明方法制得的酶溶性鱼 皮胶原， 其生物相容性大大优于酸溶性鱼皮胶原， 完全符合生物医用材料低抗原性要求， 具 体对比分析如表 2 所。
29、示， 表 2 中采用的是本实施例新鲜罗非鱼的鱼皮胶原。 0050 表 2 ： 大鼠型胶原蛋白 （col- ） 酶联免疫分析 0051 材料大鼠血清中型胶原蛋白含量 酸溶性鱼皮胶原30.182g/L 酶溶性鱼皮胶原 （本方法）16.150g/L 0052 采用本发明的医用级生物材料用鱼皮胶原制备方法， 可充分有效的去除鱼皮的非 胶原成分， 获得羟脯氨酸含量9%， 非胶原蛋白含量1%， 灰分1%的高纯度的胶原， 可更 大范围的利用鱼类资源， 工艺简单易操作， 加工时间短， 适合于工业化生产， 并且生物相容 性效果明显。 0053 上文中描述了本发明的具体实施方式。但是， 在本领域中的普通技术人员能够理 解， 不偏离本发明的精神和范围的情况下， 还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和 替换。这些变更和替换都落在本发明权利要求书限定的范围内。 说 明 书 CN 103320485 A 7 1/2 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103320485 A 8 2/2 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103320485 A 9 。