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1、(10)申请公布号 CN 103443294 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103443294 A *CN103443294A* (21)申请号 201280014786.1 (22)申请日 2012.01.20 2011-012372 2011.01.24 JP 2011-012363 2011.01.24 JP C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/09(2006.01) (71)申请人 宝生物工程株式会社 地址 日本滋贺县大津市 (72)发明人 山本纯子 久保惠子 上森隆司 向井博之 浅田起代藏 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 。
2、72001 代理人 卢碧祺 (54) 发明名称 用于修饰核酸的方法 (57) 摘要 本发明涉及 : 用于修饰样品中所含的核酸的 方法, 所述方法包括在酸性多糖和 /或核苷酸存 在下使样品与核酸修饰剂接触的步骤 ; 和用于选 择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方 法, 所述方法包括下述步骤 : (a)根据修饰样品中 所含的核酸的方法来修饰样品中所含的核酸的步 骤, 所述方法包括在酸性多糖和 /或核苷酸存在 下使样品与核酸修饰剂接触的步骤 ; 和 (b)从步 骤 (a)以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的 步骤。本发明另外涉及用于这些方法中的试剂盒 和组合物。 (30)优先权数据 (85)P。
3、CT申请进入国家阶段日 2013.09.24 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2012/051230 2012.01.20 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/102208 JA 2012.08.02 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 19 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书19页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103443294 A CN 103443294 A *CN103443294A* 1/2 页 2 1. 一种修饰样品中所含的核酸的方法, 该方法包括下述步骤 : 在酸性多糖。
4、和 / 或核苷 酸存在下, 使该样品与核酸修饰剂接触。 2. 根据权利要求 1 所述的方法, 其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化 合物。 3. 根据权利要求 2 所述的方法, 其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭 (ethidium monoazide) 和单叠氮丙锭 (propidium monoazide) 的化合物。 4.根据权利要求1所述的方法, 其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B, 或该核 苷酸选自 DNA 和 dNTP。 5. 一种选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法, 该方法包括下述步骤 : (a) 通过根据权利要求 1 所述的方法, 修饰该样品中所含的核。
5、酸的步骤 ; 和 (b) 从步骤 (a) 以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步骤。 6. 根据权利要求 5 所述的方法, 其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化 合物。 7. 根据权利要求 6 所述的方法, 其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的 化合物。 8.根据权利要求5所述的方法, 其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B, 或该核 苷酸选自 DNA 和 dNTP。 9. 根据权利要求 5 所述的方法, 其中该步骤 (b) 通过核酸扩增方法进行。 10. 根据权利要求 9 所述的方法, 其中该步骤 (b) 通过实时 PCR 进行。 11. 一种试剂盒, 其用于通过根据权。
6、利要求 1 所述的方法来修饰样品中的核酸, 该试剂 盒含有 : (a) 核酸修饰剂 ; 和 (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸, 其将与 (a) 的核酸修饰剂一起使用。 12. 根据权利要求 11 所述的试剂盒, 其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸 的化合物。 13. 根据权利要求 12 所述的试剂盒, 其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙 锭的化合物。 14.根据权利要求11所述的试剂盒, 其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B, 或 该核苷酸选自 DNA 和 dNTP。 15. 一种试剂盒, 其用于通过根据权利要求 5 所述的方法来选择性地检测源自样品中 所含的活细胞的核酸,。
7、 该试剂盒含有 : (a) 核酸修饰剂 ; (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸, 其将与 (a) 的核酸修饰剂一起使用 ; 和 (c) 用于核酸检测的试剂。 16. 根据权利要求 15 所述的试剂盒, 其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸 的化合物。 17. 根据权利要求 16 所述的试剂盒, 其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙 锭的化合物。 18.根据权利要求15所述的试剂盒, 其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B, 或 权 利 要 求 书 CN 103443294 A 2 2/2 页 3 该核苷酸选自 DNA 和 dNTP。 19. 一种组合物, 其包含 : (a) 核酸修。
8、饰剂 ; 和 (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸。 20. 根据权利要求 19 所述的组合物, 其中该核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸 的化合物。 21. 根据权利要求 20 所述的组合物, 其中该核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙 锭的化合物。 22.根据权利要求19所述的组合物, 其中该酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素B, 或 该核苷酸选自 DNA 和 dNTP。 权 利 要 求 书 CN 103443294 A 3 1/19 页 4 用于修饰核酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及用于修饰核酸的方法, 所述方法可有效地减少当进行核酸检测方法时 由样品中含有的核酸衍生出的信号 ; 用。
9、于所述方法中的试剂盒 ; 和用于它们的组合物。 背景技术 0002 目前, 核酸检测技术是医学和生物学领域中的常用研究工具, 且已经被广泛地用 于定性和定量测量中。尤其是与以 PCR 方法为代表的核酸扩增方法相组合的这样的核酸检 测技术, 能够检测到非常少的细胞或微生物的存在, 这通过靶向这些细胞或微生物特有的 核酸来实现。因此, 核酸检测技术已经被广泛地用作高灵敏度分析方法用于基础研究以及 用于工业中。核酸检测技术还被用于分销渠道追踪和鉴定, 其中将特定序列的核酸人工地 掺入材料或物品中以标记它。 0003 另一方面, 利用核酸扩增方法的检测方法具有干扰其它样品的分析的问题, 该问 题是由在。
10、检测工作期间核酸扩增反应所产生的扩增核酸造成。 由于核酸扩增反应会通过对 数核酸扩增产生巨大数目的扩增产物分子, 无意中存在于其它样品、 试剂、 试验装置或试验 环境中的扩增产物可以作为模板被扩增, 并由此可能得到错误的分析结果。 0004 为了防止对扩增产物的这种人工扩增的目的, 除了对样品、 试剂、 试验装置等的严 谨操作和试验环境的清洁的一般性注意以外, 还已经开发了用于防止扩增核酸干扰其它试 验的手段。例如, 已知生产对尿嘧啶 -N- 糖基化酶敏感的扩增核酸的方法, 该方法包括 : 在 含有脱氧尿嘧啶三磷酸的反应溶液中扩增核酸。通过在扩增反应之前用尿嘧啶 -N- 糖基化 酶处理样品或反。
11、应溶液, 可以降解从其它试验衍生出的扩增核酸。 另外, 还报道了防止核酸 在核酸扩增反应中充当模板的方法, 该方法包括 : 用光活化的补骨脂素化合物通过共价键 来修饰核酸 ( 非专利文献 1)。 0005 用于修饰核酸以防止它在核酸扩增反应中充当模板的技术还已经用于微生物的 检测中。据称, 源自死细胞的 DNA 会在样品中保留至细胞死亡后几天至 3 周。当 DNA 是通 过平常程序从样品中提取时, 它们包括源自活细胞和死细胞两者的DNA。 因而, 例如, 当对样 品进行灭菌处理时, 如果使用核酸作为指标, 微生物检测方法不会完全反映灭菌的结果。 0006 作为上述问题的解决方案, 已经报道了区。
12、分活细胞和死细胞的方法, 所述方法包 括核酸修饰剂与核酸扩增方法的组合 ( 非专利文献 2, 专利文献 1)。该基于核酸的检测 方法是通过使用扩增的存在或速率作为指标来将活细胞与死细胞区分开的方法, 所述方 法包括 : 与诸如实时 PCR 等核酸扩增方法联合使用核酸修饰剂诸如单叠氮乙锭 (ethidium monoazide, EMA) 或单叠氮丙锭 (propidium monoazide, PMA)。例如, 据报道, EMA 会在可见 光下活化以与核酸共价地键合, 使得核酸扩增反应受到抑制。 与此同时, 在样品中保持处于 游离状态的未结合的 EMA 通过与水分子的反应而被失活。源自活细胞 。
13、(由于完整细胞壁和 细胞膜, EMA 没有侵入) 的核酸不会经历 EMA 的作用。另一方面, 源自死细胞 (其已经被 EMA 侵入) 的核酸被 EMA 修饰, 使得以后的核酸扩增反应受到抑制。因而, 当用上述核酸修饰剂 处理由活细胞和死细胞的混合物组成的样品时, 源自活细胞的核酸被选择性地扩增。迄今 说 明 书 CN 103443294 A 4 2/19 页 5 为止, 这样的方法已经应用于许多微生物, 以检测与死细胞区分开的活细胞, 所述微生物例 如大肠杆菌 (Escherichia coli) O157、 鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 、 李斯 特氏菌属。
14、 (Listeria) 、 空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni) 和军团菌属 (Legionella) 。 但是, 已经报道, 高浓度的核酸修饰剂会造成对活细胞的损伤, 尽管它会确保与源自死细胞 的核酸的结合。 0007 因而, 核酸的修饰具有多种应用。因此, 需要更有效地修饰核酸的方法。 0008 引文列表 专利文献 专利文献 1: JP-B 4127847 非专利文献。 0009 非专利文献 1: Nucleic Acids Research, 第 19 卷 , 第 99-107 页 , 1991 非专利文献 2: Appl. Environ. Microbiol.,。
15、 第 73 卷 , 第 8028-8030 页 , 2007 发明内容。 0010 技术问题 本发明的一个目的是, 提供有效地修饰核酸的方法, 所述核酸需要防止被检测出, 从而 改进各种基于核酸的检测技术的准确度。 0011 问题的解决方案 本发明的发明人做出了深入研究来解决上述问题。 结果, 他们发现, 通过使用修饰样品 中所含的核酸的方法, 可以比使用常规方法时更有效地修饰核酸, 所述修饰样品中所含的 核酸的方法包括下述步骤 : 在酸性多糖和 / 或核苷酸存在下, 使样品与核酸修饰剂接触, 然 后完成了本发明。 0012 也就是说, 本发明一般地涉及下述的 : 修饰样品中所含的核酸的方法,。
16、 所述方法包括下述步骤 : 在酸性多糖和 / 或核苷 酸存在下, 使样品与核酸修饰剂接触 ; 根据 1 所述的方法, 其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合 物 ; 根据 2 所述的方法, 其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化 合物 ; 根据 1 所述的方法, 其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素 B, 或所述核 苷酸选自 DNA 和 dNTP ; 选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法, 所述方法包括下述步骤 : (a) 通过根据权利要求 1 所述的方法, 修饰样品中所含的核酸的步骤 ; 和 (b) 从步骤 (a) 以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步。
17、骤 ; 根据 5 所述的方法, 其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的化合 物 ; 根据 6 所述的方法, 其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭的化 合物 ; 根据 5 所述的方法, 其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素 B, 或所述核 苷酸选自 DNA 和 dNTP ; 说 明 书 CN 103443294 A 5 3/19 页 6 根据 5 所述的方法, 其中所述步骤 (b) 通过核酸扩增方法进行 ; 根据 9 所述的方法, 其中所述步骤 (b) 通过实时 PCR 进行 ; 试剂盒, 其用于通过根据 1 所述的方法修饰样品中的核酸, 所述试剂盒含有 : (a) 核酸修。
18、饰剂 ; 和 (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸, 其将与 (a) 的核酸修饰剂一起使用 ; 根据 11 所述的试剂盒, 其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸 的化合物 ; 根据12所述的试剂盒, 其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭 的化合物 ; 根据 11 所述的试剂盒, 其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素 B, 或 所述核苷酸选自 DNA 和 dNTP ; 试剂盒, 其用于通过根据 5 所述的方法选择性地检测源自样品中所含的活细 胞的核酸, 所述试剂盒含有 : (a) 核酸修饰剂 ; (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸, 其将与 (a) 的核酸修饰剂一起使用 ; 和 。
19、(c) 用于核酸检测的试剂 ; 根据15所述的试剂盒, 其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的 化合物 ; 根据16所述的试剂盒, 其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭 的化合物 ; 根据 15 所述的试剂盒, 其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素 B, 或 所述核苷酸选自 DNA 和 dNTP ; 一种组合物, 其包含 : (a) 核酸修饰剂 ; 和 (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸 ; 根据19所述的组合物, 其中所述核酸修饰剂是能够通过光活化而修饰核酸的 化合物 ; 根据20所述的组合物, 其中所述核酸修饰剂是选自单叠氮乙锭和单叠氮丙锭 的化合物 ; 和 根据 19。
20、 所述的组合物, 其中所述酸性多糖选自海藻酸钠和硫酸软骨素 B, 或 所述核苷酸选自 DNA 和 dNTP。 0013 发明效果 根据本发明的方法, 在使样品与核酸修饰剂接触的处理中, 可以增加核酸修饰效率, 并 且就增加食品卫生检查和临床试验的准确度而言, 这是非常有用的。 具体实施方式 0014 下面将详细描述本发明。 0015 () 本发明的核酸修饰方法 本发明的核酸修饰方法是修饰样品中所含的核酸的方法, 所述方法包括下述步骤 : 在 说 明 书 CN 103443294 A 6 4/19 页 7 酸性多糖和 / 或核苷酸存在下, 使样品与核酸修饰剂接触。 0016 作为本发明方法的对象。
21、的样品包括其中可存在核酸的所有样品。其例子包括 : 食 品、 农产品、 海产品、 生物组织和体液 ( 例如, 血液、 尿、 脊髓液和胸腔积液 )、 细胞培养液、 化学产品 ( 例如, 药物、 农用化学品和试剂 )、 工业用水、 城市给水、 地下水、 河水、 水库水 (impounded water) 、 雨水、 排水 (drainage) 和土壤。具体地, 所述食品包括饮料、 甜点、 乳 制品、 功能食品等。 在本发明中, 所述样品可以是上述产品、 生物样品或环境样品本身, 或者 可以对它进行预处理诸如溶解、 混悬、 稀释、 浓缩或纯化。预处理的例子包括热处理、 过滤、 离心等。作为预处理, 。
22、也可以对样品进行减少存在于样品中的杂质 (诸如蛋白和脂肪) 的处 理, 例如, 使用蛋白水解酶和脂解酶的酶处理。 0017 在本发明中使用的核酸修饰剂是这样的物质 : 其可以通过它的作用而将核酸修饰 成为不可检测形式。也就是说, 核酸修饰剂的一个例子是造成选自下述的任一种的物质 : 与核酸的互补链杂交的能力的变化, 作为互补链复制模板的功能的变化, 原始序列的变化, 和核酸的片段化, 或它们的复数组合。因此, 如在本发明中使用的核酸修饰包括 : 核酸修饰 剂向核酸碱基对中的嵌入, 核酸修饰剂与核酸的共价键合, 核酸的交联, 核酸碱基的置换, 和核酸修饰剂对核酸的切割。适合用于本发明的核酸修饰剂。
23、的例子包括 : EMA ( 单叠氮 乙锭 )、 PMA ( 单叠氮丙锭 )、 二叠氮乙锭 (ethidium diazide) 、 补骨脂素化合物 补骨脂 素、 4 -AMDMIP (4 - 氨基甲基 -4,5 - 二甲基异补骨脂素 )、 AMIP (5- 氨基甲基异补骨脂 素 )、 5-MIP (5- 甲基异补骨脂素 )、 8- 甲氧基异补骨脂素 (8-methoxysopsorale) 等 和 碘化丙锭。另外, 可以使用商购可得的试剂, 例如, 商品名 SYTO Red Fluorescent、 BODIPY (4,4- 二氟 -4- 硼 -3a, 4a- 二氮杂 -s- 引达省 (ind。
24、acene)、 YO-PRO-1 染料、 Alexa Fluor 488膜联蛋白V、 C4-BODIPV500/510CY、 和Hoechst 33258 (都由Molecular Probes Inc.制 造 )。上述核酸修饰剂可以单独使用, 或作为 2 种或更多种的混合物使用。此外, 也可能使 用在商购可得的试剂盒中含有的修饰剂, 所述试剂盒例如 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit、 ViaGram Red + Bacterial Gram Stain或Viability Kit (由Molecular Probes Inc. 制造 )。 。
25、0018 可以根据样品来适当地选择在本发明中使用的核酸修饰剂的浓度和核酸修饰剂 与样品接触的持续时间。 例如, 可以如下确定所述浓度和所述持续时间 : 将具有不同浓度的 核酸修饰剂加入样品中, 保持接触特定的时间段, 并分析反应后核酸的修饰。在使用 EMA 的 情况下, 可以在下述条件下修饰核酸 : 例如, EMA 终浓度为 1-100 M, 且接触时间为 1 分钟 至 48 小时, 优选地 EMA 终浓度为 5-70 M, 且接触时间为 3 分钟至 10 小时, 更优选地 EMA 终浓度为10-50 M, 且接触时间为5分钟至5小时。 使样品与核酸修饰剂接触的步骤可以 在适合使用所述核酸修饰。
26、剂的条件下进行。 0019 当在本发明的方法中使用可光活化的核酸修饰剂 (诸如 EMA、 PMA 或补骨脂素化合 物) 时, 在使核酸修饰剂与样品接触后进行光辐照处理。在使用可光活化的核酸修饰剂的情 况下, 通常将核酸修饰剂加入样品中, 以使核酸修饰剂与核酸在蔽光条件下在低温 ( 例如, 室温至 0 ) 接触, 然后进行光辐照, 但是本发明不限于该情况。用于光辐照处理的光的波 长没有特别限制, 只要它适合用于活化核酸修饰剂即可。 例如, 可以使用在350-700 nm波长 的单波长光或包括 350-700 nm 波长的多波长光。根据要使用的核酸修饰剂、 光源和样品, 可以适当地选择光辐照处理的。
27、光强度和辐照时间。 例如, 可以如下确定光强度和辐照时间 : 说 明 书 CN 103443294 A 7 5/19 页 8 使用不同的光强度和样品与光源之间的距离处理以后, 分析核酸的修饰。在使用 EMA 的情 况下, 在下述条件下进行光辐照处理是可能的 : 例如, 使用 1-1000W 的灯, 1-50 cm 的灯和样 品之间的距离, 和 1-20 分钟的辐照时间。此外, 已经开发了具有低电力消耗和强光强度的 LED ( 发光二极管 ) 灯, 并且可以用于本发明中。另外, 所述光辐照处理优选地在低温 ( 例 如, 在冰上 ) 进行。 0020 要在本发明的方法中使用的酸性多糖包括含有硫酸酯。
28、基团的硫酸化多糖, 其代 表为 : 含有硫酸岩藻糖的多糖、 硫酸葡聚糖、 角叉菜胶、 肝素、 硫酸乙酰肝素、 硫酸鼠李聚糖 (rhamnan sulfate) 、 硫酸软骨素、 硫酸软骨素 B ( 硫酸皮肤素 ) 等 ; 多糖醛酸诸如透明质 酸、 海藻酸和果胶 ; 和它们的盐。上述酸性多糖的盐的例子包括碱金属盐, 诸如硫酸葡聚糖 钠、 海藻酸钠、 肝素钠、 硫酸葡聚糖钾和肝素锂。上述酸性多糖可以是天然存在的物质或化 学地或酶促地合成的产物。另外, 上述酸性多糖可以是未纯化的或部分纯化的或纯化的含 有酸性多糖的产物。上述酸性多糖可以单独使用, 或作为 2 种或更多种的混合物使用。 0021 根据。
29、要使用的酸性多糖和样品, 可以适当地选择和加入要在本发明的方法中使用 的酸性多糖的浓度。例如, 可以如下确定酸性多糖的浓度 : 在使用不同浓度的酸性多糖处 理以后, 分析核酸的修饰。例如, 如果使用海藻酸钠, 那么它的浓度是 1 g/mL 至 100 mg/ mL, 优选 10 g/mL 至 10 mg/mL, 更优选 100 g/mL 至 5 mg/mL。例如, 如果使用硫酸软骨 素 B, 那么它的浓度是 10 g/mL 至 1000 mg/mL, 优选 100 g/mL 至 500 mg/mL, 更优选 1 mg/mL 至 100 mg/mL。 0022 如果在上述酸性多糖存在下使样品遭受。
30、核酸修饰剂的作用, 那么样品中的游离核 酸的修饰的比例增加, 且与此同时, 在允许接触核酸修饰剂的环境中的非游离核酸 (尤其是 DNA) (例如, 与生物分子结合的核酸, 和在具有增强的细胞膜渗透性的死细胞中含有的核 酸) 的修饰的比例也增加。因此, 在核酸检测方法中减少衍生自这些核酸或 DNA 的干扰成为 可能。本文中使用的短语 “在酸性多糖存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用” 是指,“将酸 性多糖人工地加入样品中, 然后用核酸修饰剂处理所述样品” 。 0023 用于本发明的方法中的核苷酸或用于本发明中的核苷酸是指, 构成核酸的核糖核 苷酸或脱氧核糖核苷酸, 或包含它的类似物作为组分的物质。可。
31、以用于本发明中的核苷酸 的例子包括、 但不限于, DNA、 RNA、 寡核糖核苷酸、 寡脱氧核糖核苷酸、 单核糖核苷酸 ( 例如, 单核糖核苷三磷酸 : NTP) 和单脱氧核糖核苷酸 ( 例如, 单脱氧核糖核苷三磷酸 : dNTP)。 在本发明中还可以使用肌苷核苷酸、 脱氧肌苷核苷酸、 脱氧尿苷核苷酸和它们的三磷酸酯, 它们是天然的核糖核苷酸类似物, 和含有上述类似物的 DNA、 RNA、 寡核糖核苷酸和寡脱氧核 糖核苷酸。NTP 包括单腺苷三磷酸 (ATP)、 单胸苷三磷酸 (TTP)、 单胞苷三磷酸 (CTP)、 单鸟 苷三磷酸(GTP)和单尿苷三磷酸(UTP)。 此外, dNTP包括单脱。
32、氧腺苷三磷酸(dATP)、 单脱氧 胸苷三磷酸 (dTTP)、 单脱氧胞苷三磷酸 (dCTP) 和单脱氧鸟苷三磷酸 (dGTP)。本文中使用 的核苷酸包括上述物质的盐(例如, 碱金属盐)。 上述核苷酸可以是天然产物或化学地或酶 促地合成的产物。此外, 上述核苷酸可以是未纯化的或部分纯化的或纯化的含有核苷酸的 产物。上述核苷酸可以单独使用, 或作为 2 种或更多种的混合物使用。作为本发明的一个 方面, 可以使用选自 DNA 和 dNTP 的核苷酸。在本发明中使用的 DNA 的例子包括、 但不限于, 源自可容易得到的动物的DNA (小牛胸腺DNA、 鲑鱼精DNA等)和源自微生物的DNA (细菌 基。
33、因组 DNA、 噬菌体 DNA、 质粒 DNA 等 )。小牛胸腺 DNA、 噬菌体 DNA (DNA) 和 dNTP 可 说 明 书 CN 103443294 A 8 6/19 页 9 作为试剂商购得到, 并且它们适合用于本发明。 0024 根据要使用的核苷酸和样品, 可以适当地选择和使用要在本发明的方法中使用的 核苷酸的浓度。例如, 可以如下确定核苷酸的浓度 : 使用不同浓度的核苷酸处理以后, 分析 核酸的修饰。例如, 如果使用 DNA, 那么它的浓度是 10 ng/mL 至 10 mg/mL, 优选 100 ng/ mL 至 1 mg/mL, 更优选 1 g/mL 至 100 g/mL。例。
34、如, 如果使用脱氧 NTP, 那么它的浓度是 10 M 至 500 mM, 优选 100 M 至 100 mM, 更优选 1 mM 至 50 mM。 0025 如果在上述核苷酸存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用, 那么样品中的游离核酸 的修饰的比例增加, 且与此同时, 在允许接触核酸修饰剂的环境中的非游离核酸 (尤其是 DNA) (例如, 与生物分子结合的核酸, 和在具有增强的细胞膜渗透性的死细胞中含有的核 酸) 的修饰的比例也增加。因此, 在核酸检测方法中减少衍生自这些核酸或 DNA 的干扰成为 可能。本文中使用的短语 “在核苷酸存在下使样品遭受核酸修饰剂的作用” 是指,“将核苷 酸人工地加入。
35、样品中, 然后用核酸修饰剂处理所述样品” 。 0026 在本发明的方法、 试剂盒和组合物中, 可以联合使用一种或多种上述酸性多糖和 一种或多种上述核苷酸。 0027 () 根据本发明的源自活细胞的核酸的选择性检测方法 在能够存活和生长的活细胞与不可逆损伤的死细胞的区分中, 细胞膜完整性是重要 的。 根据本发明的核酸修饰方法, 使用具有对细胞膜的选择性的核酸修饰剂, 甚至可以修饰 在细胞内的核酸, 所述细胞具有增强的细胞壁和细胞膜的渗透性 (所述核酸修饰剂可以侵 入它) 。另一方面, 不会修饰在核酸修饰剂不可侵入的活细胞内的核酸。因而, 根据本发明, 提供了选择性地检测源自样品中所含的活细胞的核。
36、酸的方法。 0028 本文中使用的术语 “活细胞” 表示维持生命活动的细胞, 即, 维持代谢能力和增殖 能力的细胞。此外, 所述活细胞在结构或形式方面没有实质性损伤。另一方面, 死细胞具有 细胞壁和 / 或细胞膜损伤, 且具有减少的维持生命活动的能力。即使在适合细胞生长的条 件下, 死细胞通常不会生长。 这样的死细胞处于细胞外物质可以侵入所述死细胞中的状态。 0029 当将本发明的核酸修饰方法应用于其中可能存在细胞的样品时, 仅活细胞中的核 酸不受核酸修饰剂的作用的影响, 并且它们保持能够通过核酸检测方法 (例如, 核酸扩增方 法) 检测出的状态。因此, 本发明的方法的应用, 使得特异性地检测。
37、活细胞 (例如, 微生物活 细胞) 的存在成为可能, 而不论死细胞是否存在。 0030 作为本发明方法的对象的细胞可以是真核细胞或原核细胞, 且其例子包括 : 微生 物诸如酵母、 真菌和细菌、 动物细胞和植物细胞。所述细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性 细菌。所述革兰氏阳性细菌的例子包括芽孢杆菌属细菌 (蜡状芽孢杆菌 (B. cereus) 、 炭疽 芽孢杆菌 (B. anthracis) 等) 、 葡萄球菌属细菌 (金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 、 表皮葡萄 球菌 (S. epidermidis) 等) 、 李斯特氏菌属细菌 (单核增生李斯特氏菌 (L. monocytogenes) 。
38、等) 、 梭菌属细菌 (肉毒梭菌 (C. botulinum) 、 产气荚膜梭菌 (C. perfringens)等) 、 链球 菌属细菌 (肺炎链球菌 (S. pneumoniae)等) 、 分枝杆菌属细菌等。所述革兰氏阴性细菌 的例子包括埃希氏菌属细菌 (大肠杆菌 (E. coli)等) 、 沙门氏菌属细菌 (肠炎沙门氏菌 (S. enteritidis) 、 鼠伤寒沙门氏菌 (S. typhimurium) 等) 、 弧菌属细菌 (副溶血弧菌 (V. parahaemolyticus) 等) 、 年轻泰坦杆菌属细菌 (以前的阪崎氏肠杆菌 (E. sakazaki) 等) 、 军 团菌属细。
39、菌 (嗜肺军团菌 (L. pneumophila) 等) 、 假单胞菌属细菌等。 说 明 书 CN 103443294 A 9 7/19 页 10 0031 如上所述, 本发明的方法可以使用不同的样品作为对象进行。 但是, 从维持选择性 的观点看, 必须避免导致细胞膜损伤的样品处理。 0032 本发明的检测源自样品中所含的活细胞的核酸的方法通过下述(a)和(b)步骤进 行 : (a) 通过本发明的核酸修饰方法来修饰样品中所含的核酸的步骤 ; 和 (b) 从步骤 (a) 以后的样品选择性地检测未修饰的核酸的步骤。 0033 本发明的方法中的步骤(a)是这样的步骤 : 如上面(1)中所述, 在酸性。
40、多糖和/或 核苷酸存在下, 使样品与核酸修饰剂接触, 从而修饰样品中的核酸。例如, 可以如下修饰核 酸 : 将核酸修饰剂和酸性多糖和 / 或核苷酸加入样品中, 并将所述样品置于适当的条件下。 在本发明的方法中, 当使用如上面 (1) 中所述的可光活化的核酸修饰剂时, 可以与步骤 (a) 同时地或在步骤 (a) 以后进行光辐照处理。另外, 所述步骤 (a) 和所述光辐照处理可以重 复几次, 例如, 2-5次。 也就是说, 可能重复地执行核酸修饰剂的添加和光辐照处理。 在重复 所述步骤 (a) 和所述光辐照处理的情况下, 可以在光辐照处理以后向样品中加入适合样品 中所含的活细胞的生长的培养基, 如。
41、在 WO 2009/022558 中所述, 并由此可以组合培养活细 胞的步骤。 0034 此外, 在步骤 (a) 以后, 可以进行除去核酸修饰剂的步骤。作为除去核酸修饰剂的 方法, 可以使用本领域已知的固液分离方法。 这样的方法的例子包括 : 将样品离心以分离含 有细胞的沉淀物和含有核酸修饰剂的上清液, 然后除去上清液。 在该情况下, 在除去核酸修 饰剂以后, 也可以添加洗涤细胞的步骤。 0035 另外, 在步骤 (a) 以后, 可以进行裂解活细胞的步骤和 / 或提取核酸的步骤。细胞 裂解方法和核酸提取方法的例子包括多种方法, 诸如蛋白水解酶 K/ 苯酚提取方法、 蛋白水 解酶 K/ 苯酚 /。
42、 氯仿提取方法、 碱性裂解方法、 碱 -SDS 方法和裂解酶方法, 以及通过热处理 实现的细胞破坏 ( 热提取 )。在这些方法中, 根据在下面提及的、 在步骤 (b) 中进行的核酸 检测方法, 可以选择合适的细胞裂解方法和 / 或合适的核酸提取方法。 0036 在本发明的方法的步骤 (b) 中, 通过从步骤 (a) 以后的样品选择性地检测未修饰 的核酸, 可以特异性地检测活细胞的核酸。 也就是说, 在基于核酸的活细胞检测中减少由死 细胞的核酸造成的噪声成为可能, 这使得以高灵敏度准确地检测活细胞在样品中的存在成 为可能。 0037 在步骤(b)中, 根据步骤(a)的核酸修饰方法, 可以适当地选。
43、择选择性地检测未修 饰的核酸的方法。例如, 如果作为死细胞 DNA ( 以及游离 DNA) 的选择性修饰的结果, 使用 DNA作为模板的核酸扩增反应受到抑制, 那么可以选择核酸扩增方法(DNA扩增方法) 作为 检测核酸的方法。所述 DNA 扩增方法包括 PCR 方法、 ICAN 方法、 LAMP 方法、 SDA 方法、 LCR 方法、 RCA 方法和 SMAP 方法。可以如下选择性地检测未修饰的核酸 : 对核酸扩增反应以后 的反应溶液实施常规分析方法诸如凝胶电泳, 从而分析扩增的核酸的量和碱基长度。 此外, 也可以使用实时检测和定量核酸的方法, 且其例子包括嵌入剂方法、 TaqMan 方法、 。
44、Scorpion 方法、 循环探针方法和杂交探针方法。在许多综述中描述了这些核酸扩增方法和实时检测 方法, 并且本领域技术人员能够从许多商购可得的试剂盒中做出选择。 0038 在核酸扩增方法中或在实时检测方法中, 可以根据要检测的细胞适当地选择要检 测的核酸的靶区域。所述靶区域可以选自 : 细胞染色体的基因组序列, 或附加体 (诸如线粒 说 明 书 CN 103443294 A 10 8/19 页 11 体基因组、 叶绿体基因组或质粒) 的序列。此外, 当在样品中含有与要检测的细胞不同类型 的细胞时, 优选的是, 选择要检测的细胞特有的序列作为靶区域。也可以选择 2 种或更多种 细胞共有的序列。
45、作为靶区域。另外, 所述靶区域可以是一个区域, 或可以是多个区域。也 可能设定要检测的细胞特有的靶区域和广泛范围的细胞具有的靶区域。靶区域的长度是 40-5000 个碱基的长度, 优选 60-1000 个碱基的长度, 特别优选 70-200 个碱基的长度。 0039 根据核酸扩增方法或实时检测方法, 可以基于如上所述的靶区域来设计要在核酸 扩增方法中或在实时检测方法中使用的引物或探针。 0040 通过在靶向微生物的同时执行本发明的方法, 检测在样品中存活的微生物是可能 的。在核酸扩增方法中, 靶基因 / 核酸区域没有特别限制, 且可以考虑特异性和检测灵敏度 来适当地选择。如果要检测的微生物是致。
46、病性细菌, 可能选择来自致病性基因的靶区域, 从 而将属于相同种或属的致病性细菌与非致病性微生物区分开。致病性基因的例子包括 : 源自 大肠杆菌 O-157 的 vero 细胞毒素 1 型或 2 型基因, 源自产毒的大肠杆菌的耐热肠毒素基因 (STh) 或不耐热肠毒素基因 (STp), 源自沙门氏菌属细菌的侵入因子 (invasive factor) 相关 的基因 (invA), 源自副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 的耐热溶血素基因 (tdh), 源自 蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 的呕吐毒素 (cereulide) 基因 (CRS), 源自。
47、李斯特氏菌属细 菌的内化蛋白 A 基因 (intA), 源自阪崎肠杆菌 (Enterobacter sakazakii) 的外膜蛋白 A 基因 (ompA), 源自弯曲杆菌属的细胞致死肿胀毒素(cdt)基因等。 另外, 编码被广泛用于微生物检 测的核糖体 RNA (16SrRNA, 23SrRNA) 或它的间隔区的基因可以用作靶标。 0041 进一步, 下面举例说明了分析方法, 其中采用实时PCR方法作为步骤(b)中的检测 方法。在所述实时 PCR 方法中, 监测荧光信号的变化。当提供 PCR 扩增产物时, 荧光信号强 度增加, 并且绘制扩增曲线。一般而言, 至多约 1-10 个 PCR 扩增。
48、循环的荧光强度的变化是 等于 0 的噪声水平, 且被视作样品空白 ( 基线 )。当与样品空白对比时, 将其中观察到荧光 信号的显著差异的荧光信号强度设定为阈值。将循环阈值 (Ct 值 ) 定义为超过扩增曲线的 阈值的 PCR 循环的数目。因而, 当 PCR 反应溶液中的 DNA 模板的初始量越大时, Ct 值越小, 且当模板 DNA 的初始量越小时, Ct 值越大。此外, 随着靶区域中的核酸修饰的发生比例增 加, Ct 值是更大的值, 即使核酸的总量是相同的。另外, 可能通过解链曲线分析 (Tm 分析 ) 来分析扩增产物的解链温度, 以证实扩增产物是否源自靶区域。 0042 () 本发明的试剂。
49、盒和组合物 本发明的试剂盒是用于通过如上面 (1) 中所述的本发明的方法修饰样品中的核酸的 试剂盒, 所述试剂盒含有 : (a) 核酸修饰剂 ; 和 (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸, 其将与 (a) 的核酸修饰剂一起使用。 另外, 本发明的另一种试剂盒包括用于通过如上面 (2) 中所述的本发明的方法选择性 地检测源自样品中所含的活细胞的核酸的试剂盒, 所述试剂盒含有 : (a) 核酸修饰剂 ; (b) 酸性多糖和 / 或核苷酸, 其将与 (a) 的核酸修饰剂一起使用 ; 和 (c) 用于核酸检测的试剂。 在本发明的试剂盒中含有的核酸修饰剂、 酸性多糖和核苷酸如上面 (1) 中所述。在本 发明的试剂盒中含有的用于核酸检测的试剂是如上面 (2) 中所述的核酸检测方法中使用 说 明 书 CN 。