具有改善的生物利用度的绿茶提取物 本发明涉及通过天然抗氧化剂如低聚原花青色素 (OPC) 连同维生素 C 或维生素 C 类似物稳定的绿茶配制物。本发明还涉及 OPC 与抗坏血酸的混合物在增加绿茶儿茶素物质 的生物利用度以及使儿茶素物质的有益健康益处最大化中的用途。 本发明还涉及含有稳定 化绿茶配制物的食品、 宠物食品、 食品增补剂、 药用或美容用组合物。
发明背景
绿茶是世界上在水之后最常消耗的饮料， 它提供了一些重要的健康益处。被认为 负责这些益处的化合物是多酚且特别是儿茶素物质。
主要的绿茶多酚 ( 黄烷 -3- 醇 ) 是儿茶素物质， 即 (+)- 儿茶素 (C) 及其立体异构 体和 4 种衍生物、 即 (-)- 表儿茶素 (EC)、 (-)- 表棓儿茶素 (EGC)、 (-)- 表棓儿茶素 -3- 棓 酸酯 (EGCg)、 (-)- 表儿茶素 -3- 棓酸酯 (ECg)。
尽管儿茶素物质的量根据影响植物代谢的因素如光、 降雨、 温度、 养分供应、 叶龄 和基因组成的不同而改变， 但是它们通常构成新鲜绿茶叶干物质的 20-30％。 儿茶素物质代 表了约 80％的绿茶总多酚含量。因为它们在绿茶生产过程中很少被破坏， 所以儿茶素物质 是市售绿茶提取物的主要组成部分。
绿茶儿茶素物质展示出数种健康益处， 它们通常与其抗氧化剂活性相关， 包括活 性氧族和氮族的清除、 游离金属螯合、 转录因子的抑制和氧化性酶如脂氧化酶和环氧化酶 的抑制。
多酚的保健作用取决于所消耗的量和它们的生物利用度。但是， 它们的生物利用 度不好， 这显示与这些化合物在生理条件下特定的不稳定性相关。
一种增加绿茶儿茶素物质在不利条件下的稳定性的可能策略是用抗氧化剂保护 它们， 由此防止因接触氧而导致的化学改变。例如， Rode 等人 (2002) 已经证明 ： 掺入水溶 性抗氧化剂 ( 维生素 C) 稳定了乳剂中的绿茶儿茶素物质， 但是当他们使用亲脂性抗氧化剂 如丁羟甲苯或棓酸丙酯时未观察到任何作用。实际上， 发现所有 4 种儿茶素种类且特别是 EgC 和 EgCg 在抗坏血酸的存在下稳定， 并且这种保护作用是剂量依赖性的。尽管长期以来 已经获知抗坏血酸的这种保护作用， 但是其对生物利用度的作用从未得到证实。 实际上， 在 G.Williamson 等人的 Int.J.Vitam.Nutri Res.77(3)2007， 224-235 中， 近来已经证实 ： 添 加抗氧化剂 ( 维生素和类胡萝卜素 ) 对多酚如儿茶素物质的生物利用度没有影响。
因此， 本发明的目的是通过提供含有具有改善的稳定性和增加的生物利用度的儿 茶素物质的配制物来解决上述问题。 本发明的目的还是提供具有增加的生物利用度的绿茶 配制物， 其可用于在食品或宠物食品、 营养或食品增补剂、 美容用或药用制剂中的应用。
发明概述
因此， 本发明的第一个目的是提供低聚原花青色素 (OPC) 与抗坏血酸或维生素 C 类似物的混合物在制备用于增加儿茶素物质、 特别是绿茶儿茶素物质的生物利用度的产品 中的用途。
有利地， 该组合物的儿茶素物质内容物具有改善的稳定性和生物利用度。 而且， 该 组合物具有增强的营养价值， 其形式是更好的生物利用度和稳定性。 它可以直接地、 浓缩或
干燥为粉末用于数种在每日消耗食品中的应用或其它营养用途。
本发明的另一个目的是提供含有本发明的配制物的食品、 宠物食品、 美容用制剂、 营养增补剂或药用制剂。
在另一个方面， 本发明提供了采用 OPC 和抗坏血酸的组合来增加绿茶儿茶素物质 的稳定性和生物利用度的方法。
本发明的另一个目的是提供如上所述的配制物在制备意欲用于改善皮肤健康、 特 别是用于皮肤的光保护或用于保护皮肤组织对抗老化的口服美容用或药用组合物中的用 途。
本发明的另一个目的是提供如上所述的配制物在制备意欲用于体重管理、 心血管 疾病、 2 型糖尿病、 认知功能或炎症的口服、 局部用或药用组合物中的用途。
目前， 本发明可以使消费者获得基于绿茶儿茶素物质的改善的组合物， 其具有增 加的生物利用度和生物效力。
附图
在下文中参照附图中所示的一些实施方案进一步描述了本发明， 其中 ：
图 1 显示了在增加浓度的维生素 C 和 OPC(Indena) 的存在下 5 小时温育绿茶期间 EGCg 的稳定。
图 2 显示了在 0.2mM 维生素 C 和增加浓度的 OPC 的存在下 5 小时温育绿茶期间 EGCg 的稳定。
图 3 一对绿茶儿茶素物质施用的临床研究设计。
图4： 对于各治疗 A、 B、 C 和 D 的血浆药物动力学的血样采集。 发明详述
在如下描述中， 术语 “绿茶儿茶素物质” 理解为意指儿茶素 (C)、 表儿茶素 (EC)、 棓 儿茶素 (GC)、 棓儿茶素棓酸酯 (GCG)、 表棓儿茶素 (EGC)、 表儿茶素棓酸酯 (ECg)、 表棓儿茶 素棓酸酯 (EGCg)。
根据第一个方面， 涉及含有儿茶素物质的配制物的用途， 所述配制物包含低聚原 花青色素 (OPC) 和抗坏血酸的混合物以增加绿茶儿茶素物质的生物利用度。
实际上， 在于生理条件下筛选数种分子时， 已经令人意外地发现 ： 将 OPC 和抗坏血 酸 (Vit C) 或 Vit C 类似物 ( 例如 furaneol 等 ) 添加到含有儿茶素物质的配制物中将显 著改善所述儿茶素物质的生物利用度。
在一项优选的实施方案中， 儿茶素物质来自绿茶。可以供选地使用儿茶素物质的 其它来源， 例如野生植物果实， 特别是浆果 ( 越橘、 黑莓、 蓝莓 (blueberry)、 接骨木果、 花楸 果、 沙景或稠梨、 榲桲等 )、 可可、 豆类或果实。
绿茶 ( 或其它植物来源 ) 可以以新鲜、 浓缩或干燥材料、 例如风干或冷冻干燥材料 的形式使用。组合物中儿茶素物质的量将取决于所述配制物的应用。在一项优选的实施方 案中， 儿茶素物质含量、 特别是绿茶提取物形式的儿茶素物质含量可以占 1 至 50％， 最优选 5 至 30％。
优选地， OPC 来自葡萄来源。在一项优选的实施方案中， 它们例如可以获自松树皮 或葡萄籽。可可和野生浆果提取物以及 OPC 的所有已知来源也可以供选地用作 OPC 来源。
低聚原花青色素和抗坏血酸以足以至少改善儿茶素物质的生物利用度和 / 或减
轻或阻止可通过施用儿茶素物质来治疗或预防的障碍的症状的量加入到儿茶素物质中。 足 以达到该目的的量被定义为 “治疗有效剂量” 。 有效用于该目的的量将取决于本领域技术人 员已知的众多因素， 例如疾病的严重性和 / 或患者的体重和一般状况。在预防应用中， 本发 明的组合物以足以至少部分地减少疾病发生风险的量施用于易患特定障碍或另外处于特 定障碍风险的患者， 所述特定障碍可通过施用橙皮素来治疗或预防。 该量被定义为 “预防有 效剂量” 。同样， 精确量取决于众多患者具体因素， 例如患者的健康和体重状态。
在一项优选的实施方案中， 组合物含有 1 至 80 ％的葡萄籽提取物、 优选 10 至 40％， 这取决于其 OPC 含量， 后者在葡萄籽提取物中可以从 60 至 99％ OPC 不等。抗坏血酸 或 Vit C 类似物可以以 0.1 至 15％、 最优选 1 至 6％ ( 就绿茶提取物而言 ) 的量存在。
根据另一方面， 本发明涉及在食品、 食品增补剂、 宠物食品、 美容用制品或药用制 剂中的包含上述配制物的口服组合物。
在一项优选的实施方案中， 用于人消耗的食品组合物增补有上述组合物。该组合 物可以是完全营养配方产品、 乳制品、 冷冻或货架稳定的饮料、 粉状饮料、 矿物质水或纯净 水、 液体饮料、 汤、 膳食增补剂、 替代餐、 营养棒、 甜食、 奶制品或发酵奶制品、 酸乳、 基于奶的 粉末、 肠内营养产品、 婴儿配方产品、 婴儿营养产品、 谷物产品或基于发酵谷物的产品、 冰淇 淋、 巧克力、 咖啡、 烹调产品如蛋黄酱、 番茄糊或色拉调料或者宠物食品。 就摄入而言， 口服组合物、 特别是食品增补剂的很多实施方案都是可能的。它们 通过用于生产包糖衣片、 丸剂、 糊剂、 口胶剂、 明胶胶囊剂、 凝胶剂、 乳剂、 片剂、 胶囊剂或可 饮用溶液或乳剂的常规方法来配制， 然后可以直接用水或通过任意其它已知的方式服用它 们。
而且， 可以将如上所述的配制物掺入任意其它形式的食品增补剂或强化食品如食 物棒或压缩或非压缩粉末中。制备它们的方法是公知常识。
食品组合物或食品增补剂还可以包含甜味剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 添加剂、 矫味剂 或着色剂。 组合物还可以含有合成或天然的生物活性成分， 例如氨基酸、 脂肪酸、 维生素、 矿 物质、 类胡萝卜素、 多酚等， 它们可以通过干法或湿法混合加入到所述组合物中， 然后进行 巴氏灭菌和 / 或干燥。
根据一项实施方案， 可以从美容方面使用本发明的组合物。 “美容用途” 指非治疗 用途， 其可以改善人或宠物的皮肤、 外层和 / 或毛发的美学方面或舒适性。
当从美容方面使用时， 本发明的食品组合物或增补剂可以采取上述食品组合物或 增补剂的任意形式。优选它是膳食增补剂的形式， 后者可以是液体或干燥形式， 例如溶液、 喷雾剂、 片剂、 胶囊剂、 明胶胶囊剂、 锭剂、 粉末、 凝胶剂、 乳剂等。更优选地， 它是胶囊剂形 式。用于美容目的的增补剂可以另外包含对皮肤具有活性的化合物。
被个体所消耗以获得有益作用的配制物或食品组合物或食品增补剂的量还将取 决于其尺寸、 其类型及其年龄。
在另一项实施方案中， 可以施用药用组合物用于预防和 / 或治疗处理。在治疗应 用中， 给已经患有如下文所述的疾病的患者施用足以治愈或至少部分地阻止该疾病及其并 发症症状的量的组合物。足以达到该目的的量被定义为 “治疗有效剂量” 。有效用于该目的 的量将取决于疾病的严重性和患者的体重和一般状况。在预防应用中， 本发明的组合物被 施用于易患特定疾病或另外处于特定疾病风险的患者。该量被定义为 “预防有效剂量” 。在
该应用中， 精确量同样取决于患者的健康和体重状态。
本发明的组合物优选用可药用载体进行施用， 所述载体的性质随施用模式如肠 内、 口服和局部 ( 包括眼 ) 途径而不同。可以采用各种赋形剂、 例如药用级的甘露醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸镁、 糖精钠、 纤维素、 碳酸镁制备预期的制剂。 该组合物可以是片剂、 胶囊剂、 丸 剂、 溶液、 混悬剂、 糖浆剂、 干燥口服增补剂、 湿口服增补剂。
可以理解， 本领域技术人员基于其自身的知识、 考虑到施用途径而将选择适当的 组分和盖仑形式以使活性化合物靶向于所关注的组织如皮肤、 结肠、 胃、 眼、 肾脏或肝脏。
本发明还涉及上述配制物的局部美容用途。它可以配制成例如洗剂、 香波、 霜剂、 防晒剂、 日晒后霜剂、 抗老化霜剂和 / 或软膏。这种可以局部使用的组合物另外包含可以在 美容品中使用的脂肪或油， 例如 CTFA 著作 Cosmetic Ingredients Handbook( 华盛顿 ) 中 提及的那些。还能够加入其它美容学活性成分。该组合物另外包含构造剂 (structuring agent) 和乳化剂。 还可以向组合物中加入其它赋形剂、 着色剂、 香料或遮光剂。 将理解的是， 本发明的美容产品将含有技术人员已知的不同成分的混合物， 从而确保所述物质快速渗透 入皮肤和防止其在贮存期间降解。
将理解的是， 本发明的概念同样可以用作协助目前所用药物治疗的辅助疗法。由 于本发明的化合物可以容易地与食物材料一起施用， 所以可以应用含有高量所述物质的特 定临床食物。 清楚的是， 在阅读本说明书连同所附的权利要求书时， 技术人员将想到本文所 述的特定实施方案的各种不同供选方式。
本发明的产品可用于增加儿茶素物质的功效。例如， 已知儿茶素物质可改善皮肤 健康， 在预防或治疗心血管疾病、 2 型糖尿病、 认知功能或炎症中具有积极作用。 它们还可用 于体重管理减轻。 因此， 本发明的口服组合物可用于改善皮肤健康， 特别是用于皮肤的光保 护或用于保护皮肤组织对抗老化。例如， 还用于减缓皮肤老化。它还可用于预防或治疗敏 感性、 干性或反应性皮肤或者用于改善皮肤密度或紧致性。
本发明的组合物对人或宠物皮肤的作用可以通过采用常规方法来测定， 所述常规 方法包括最小红斑剂量 (MED)、 比色法、 经表皮水份丢失、 DNA 修复、 白细胞介素和蛋白聚糖 产生的度量或者胶原酶活性、 屏障功能或细胞更新。
通过下文所述的非限制性实施例进一步解释了本发明。 实施例 实施例 1 ： 绿茶儿茶素物质的稳定性研究
材料和方法
从 Choladi 工厂 (Cherambadi， 印度 ) 获得市售绿茶提取物 ( 速溶绿茶 TCTG)。它 们通过于 90℃由绿叶进行水提取、 然后喷雾干燥而制得。使用两个批次。表 I 报道了它们 的儿茶素物质组成。
表 I.Choladi 绿茶提取物的儿茶素含量
接 收 不 同 品 质 的 葡 萄 籽 OPC( 低 聚 原 花 青 色 素 )， 对 于 Gravinol 产 品 系 列 从 Indena( 意 大 利 米 兰 )、 Kikomann( 日 本 野 田 市 ) 接 收， 对 于 Vitaflavan50 从 DRT(Dax， 法 国 ) 接 收。 松 树 皮 OPC(Oligopin) 是 来 自 DRT(Dax， 法 国 ) 的 赠 品。Furaneol(4- 羟 基 -2， 5- 二 甲 基 -3(2H)- 呋 喃 酮 )、 homofuraneol、 furaneol- 甲 基 醚 和 norfuraneol 购 自 Givaudan(Dübendorf， 瑞 士 )。 维 生 素 C、 麦 芽 酚、 半胱氨酸和偏亚硫酸氢盐来自 Sigma-Aldrich(Buchs， 瑞士 )。 硬脂酰乳酰乳酸钠 (SSL) 和二乙酰酒石酸甘油单酯 (Datem) 来自 Danisco(Copenhagen， 丹麦 )。磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠二水合物来自 Merck(Darmstadt， 德国 )。 用于 HPLC 校准的儿茶素物质标准品获自 Extrasynthèse(Genay ； 法国 )。
按照如下方法制备样品。 简言之， 将各样品用乙酸 (30％终浓度 ) 处理 30 分钟， 然 后加入到含有 10％乙腈、 0.5mg/mL EDTA 和 0.5mg/mL 抗坏血酸的水溶液中。然后将混合物 以 14’ 000x g 离心 30 分钟， 通过 HPLC 分析上清液。按照这种方案能够完全回收所有的儿 茶素物质。
通过反相 HPLC、 采用基于 ISO FDIS 14502-2 方法的分析方法测定了绿茶儿茶 素物质。所用的 HPLC 系统是装配有紫外 - 可见光二极管阵列和荧光检测器的 1100 系列 Hewlett-Packard(Geneva， 瑞士 ) 型。除了儿茶素和表儿茶素通过荧光检测 ( 激发 ： 280nm ； 发射 ： 310nm) 外， 通过 280.4nm 处的 UV 吸收检测儿茶素物质。在 Zorbax RX-C18 柱 (4.6mm 内径 ×250mm 长， Agilent technologies) 上分离样品 (10μl)。采用表 II 中报道的梯度 于室温进行了分离。流速为 1.0mL/min。
表 II. 用于儿茶素物质的 HPLC 分离的溶剂梯度。 溶剂 A ： 含 0.05％三氟乙酸 (TFA) 的水 ； 溶剂 B ： 含 0.05％ TFA 的 MeOH 与乙腈 (60 ∶ 40) 的混合物。
基于相应的校正曲线计算了绿茶儿茶素物质 (C、 EC、 EgC、 EgCg、 ECg) 的样品浓度， 报道为初始值 (t0 时的样品 ) 的％。由于绿茶样品内原有的咖啡因在所选择的分析条件下
稳定， 所以将其用作内标用于所有计算。 因此， 新鲜绿茶提取物中发现的咖啡因浓度被用于 数据标准化。
将绿茶和抗氧化剂或相应的配制物分散于 pH 7.4 的缓冲液 (Na-Pi， 100mM) 中， 在 标准化条件 ( 在开放容器中， 于 37℃连续搅拌 ) 下分析一直到 24 小时。在规定的时间间隔 收集各等分试样， 如上所述制备用于 HPLC 进样的样品。
结果
用维生素 C 稳定绿茶提取物
已知维生素 C 是强效抗氧化剂并且当加入绿茶中时防止儿茶素物质降解。为了获 得有关实现儿茶素物质的保护所需的最低维生素 C 浓度的概念， 已经将含有增加量的维生 素 C 的绿茶提取物温育了一直到 24 小时。由于这项工作的目的是在生理条件下实现儿茶 素物质的最大保护， 所以温育参数被选择为与可以在肠中发现的条件相当， 即 37℃ pH7.4。
表 III ： 在温育一直到 24 小时的含有增加浓度的维生素 C 的绿茶样品中剂量依 赖性的儿茶素物质保留 (C ＝儿茶素， EC ＝表儿茶素， EgC ＝表棓儿茶素， EgCg ＝表棓儿茶 素 -3- 棓酸酯， ECg ＝表儿茶素 -3- 棓酸酯 )
正如从以前的研究中已知的那样， EgC 和 EgCg 是最不稳定的儿茶素物质， 在未进 行保护的绿茶提取物中， 它们在温育 2 小时后已经大部分被降解 ( 表 III)。采用所选择的 浓度， 仅仅在 0.5mM 浓度下就观察到了维生素 C 的显著作用， 虽然其它实验已经证明 0.2mM 浓度的抗坏血酸至少对 2 小时温育而言已经发挥了一些保护作用 ( 数据未显示 )。采用等 于或高于 1mM 的维生素 C 浓度获得了在 2 小时时的最大保护作用， 而对于稳定 6 小时而言 仅仅在 2.5mM 时就达到平稳状态。其它儿茶素物质在所选择的条件下更稳定， 它们中的一 部分在 6 小时后仍然可以在不含维生素 C 的样品中检测到。
在分析物中添加抗坏血酸还以剂量依赖性的方式显著改善了它们的稳定性。 有趣 的是， 在用维生素 C 稳定的绿茶 ( ＞ 1mM) 中， 儿茶素 (C) 的量在温育期间稳定增加， 在 24 小时后达到初始值的 175％。尚未对 C 的这种时间依赖性进行详细研究， 但众所周知的是， 一些儿茶素物质倾向于表异构化。其它儿茶素种类连续表异构化为 C 以及增加浓度的抗坏 血酸延迟 C 降解可以是 C 随时间增加的一种解释。
发现维生素 C 是儿茶素物质保护的有效抗氧化剂。 假定肠吸收在 2-3 小时后完全， 则浓度＞ 0.2mM 足以达到最大保护。
低聚原花青色素 (OPC)+ 维生素 C 对绿茶儿茶素物质稳定化的作用
富含 OPC 的提取物的特征在于其儿茶素物质的低聚物或多聚物含量， 抗氧化剂活 性归因于这些化合物。 但是， 根据提取所用的原料和方法的不同， 在这些配制物中仍然存在 大量单体。确实， 富含 OPC 的提取物已知至少含有儿茶素和表儿茶素， 这两种儿茶素种类也 存在于绿茶提取物中。 由于这些提取物添加到绿茶中将显著改变混合物中儿茶素物质的概 况， 所以已经对所选择的 OPC 提取物的儿茶素物质单体概况进行了表征。
分析结果证实 ： C 和 EC 是 OPC 制备物中发现的主要儿茶素种类， 其量在总样品的 1％至 20％ (w/w) 之间改变 ( 表 IV)。提取物中不存在 EgC。此外， 在 Indena 葡萄籽 OPC 和 Oligopin 松树皮 OPC 中发现了少量 EgCg。在这两种提取物中以及在 Vitaflavan 样品中观 察到了 ECg。所有这三种样品均特别富含儿茶素物质单体。
表 IV ： 富含 OPC 的市售配制物中儿茶素物质的单体概况 (C ＝儿茶素， EC ＝表儿茶 素， EgC ＝表棓儿茶素， EgCg ＝表棓儿茶素 -3- 棓酸酯， ECg ＝表儿茶素 -3- 棓酸酯 )
然后， 测定不同 OPC/ 维生素 C 混合物对绿茶儿茶素物质稳定性的作用。已经证明 ( 表 V) ： 与单独的维生素 C 的保护作用相比， 与 OPC 提取物的大多数组合在 2 和 5 小时后均 显示出较好的 EgC 和 EgCg 保留。
留下来自 Indena 的 OPC 配制物用于其它优化试验。
表V： 在通过维生素 C 和来自不同供应商的富含 OPC 的提取物稳定的温育绿茶样 品中的儿茶素物质保护 (C ＝儿茶素， EC ＝表儿茶素， EgC ＝表棓儿茶素， EgCg ＝表棓儿茶 素 -3- 棓酸酯， ECg ＝表儿茶素 -3- 棓酸酯 )
因 OPC 样品中升高浓度的儿茶素物质单体导致的整合困难 OPC+ 维生素 C 对儿茶 素物质稳定性的剂量响应
为了使用于儿茶素物质保护的维生素 C 与 OPC 之比最优化， 将含有三种不同浓度 的维生素 C(0.1mM ； 0.2mM 和 0.3mM) 的绿茶与增加量的 OPC 一起温育一直到 5 小时。由于 EgCg 很不稳定， 所以将它选作评价保护功效的标记化合物。如以前所观察到的那样， 将 OPC 添加到温育样品中比含有单独维生素 C 的对照相比显著增加了 EgCg 的稳定性 ( 图 1)。OPC 的保护作用清楚地是剂量依赖性的， 并且随初始维生素 C 浓度的增加而持续升高。但是这 种增加不是线性的 ： 高 5 倍的剂量的 OPC 未引起高 5 倍的保护。OPC 添加的作用在最低维 生素 C 浓度时更显著， 但是在这种情况中， 总体保护也较低， 仅导致约 50％的 EgCg 保留。
为了尽可能地减小葡萄籽儿茶素物质对总儿茶素物质概况的影响， 进行了在 0.025％至 0.1％范围的 OPC 添加连同 0.2mM 维生素 C 的稳定性实验。温育 5 小时后， 绿茶 中的 EgCg 保护显示是剂量依赖性的， 在 0.1％ OPC 时达到最大值 40％ ( 图 2)。所观察到的 增加不是线性的 ； 特别是在 0.05％的 OPC 浓度下， EgCg 保护已经相当于用 0.1％ OPC 观察 到的 EgCg 保护的 75％。最后， 已经选择了这种合并了 0.2mM 维生素 C 与 0.05％ OPC 的配 制物作为总体儿茶素物质保护与降低 OPC 含量之间良好的折衷方案。它已经在临床试验中 进行了测试以评价 VitC/OPC 改善儿茶素物质生物利用度的效力。
实施例 2 ： 生物利用度研究
材料和方法
11＊CN 102458155 A
说明书10/13 页受试者
在本试验中登记了在 NRC 招募的 12 名年龄为 22-46 岁的男性。志愿者在他们完 成医学调查问卷和由医师检查后被宣布是健康的。在本研究期间不允许使用药物治疗、 维 生素 - 矿物质增补剂。所有受试者均为不吸烟者。从本研究中排除素食者、 绝对素食者和 每周规律消耗 3 杯以上茶 ( 所有类型， 包括药草茶 ) 或每周 200g 巧克力、 包括含巧克力的 产品的男性。受试者被完全告知本研究的目的并签署书面知情同意书。本研究方案得到洛 桑市的 CHUV 伦理委员会的批准。
研究设计
图 3 显示了本研究的示意图。本研究是双盲交叉设计。测试产品为绿茶提取物 TCTG(CWS.08)， 它是在 Choladi(NestléIndia) 生产和由 Givaudan 提供的绿茶叶的水提取 物。这种绿茶提取物被用于本研究中的 4 种不同治疗 ： 它们包括 ：
- 绿茶提取物 (GT) 粉末 (1g/ 人 )
- 含有葡萄籽提取物和维生素 C 的绿茶提取物粉末 (GTCV)(1.535g 产品 / 人， 该产 品含有 1g 绿茶提取物、 0.5g 葡萄籽提取物和 0.035g 维生素 C)。
- 含有两种本文未进一步描述的其它配制物的绿茶提取物粉末。 使用产品代码 A、 B、 C 和 D 标识四种研究产品。将 4 种不同的治疗物包封在明胶 胶囊中， 在早餐后 2 小时用 300ml 低矿物质水口服施用。将 1g 绿茶提取物 / 治疗给予受试 者。提取物的儿茶素物质组成报道于表 6。
表6： 绿茶提取物参比的儿茶素物质分布 ： 52160450BA(％ )
EGC 12.4
Cat 0.4 EGCG 17.8 EC 2.2 ECG 3.1 总计 35.9在接受一种治疗的前 2 天， 要求受试者不饮酒以及不消耗富含类黄酮的食品和饮 料、 茶产品、 药草茶、 巧克力产品、 咖啡产品、 葡萄汁和 250ml/ 天以上的其它果汁。在实验前 1 天和当天使其饮食标准化。当天受试者空腹到 Metabolic Unit， 在那里他们吃点不含儿 茶素物质的早餐。将导管放入右臂或左臂， 以允许历经 8 小时在如下所述的间隔重复抽血。 在早餐后 2 小时， 受试者随机接受 4 种治疗 A、 B、 C 或 D 之一。在治疗吸收后 0、 30、 60、 90、 120、 180、 240、 360 和 480min 时取血样。通过导管输注 250ml 生理血清 (NaCl 0.9％ )6 小 时以避免导管阻塞。在取血样前， 从导管中除去 2ml 液体以避免 NaCl 污染血样。受试者在 在禁食后当天取血样用于完成药 Metabolic Unit 用午餐。晚餐提供标准化饮食。在早晨， 物动力学研究。
样品处理和分析 在取血样后立即将各血样于 4℃以 3500g 离心 10 分钟用于获得血浆。 将获自该试 管的血浆与 EDTA 和维生素 C 混合。然后将样品于 -80℃冷冻直至进行分析。在外部实验 室 (Brunswick Laboratories， LLC， Norton， MA， USA) 按照如下方案进行分析。简言之， 在 Eppendorf Centrifuge 5417R 中将融化的血浆进行离心 (14000rpm， 5min， 4℃ )。然后将 200μl 血浆与 12μl10％抗坏血酸 -40mM KH2PO4-0.1％ EDTA、 20μl 50mM 磷酸钾 (pH7.4)、 作为内标的 20μl 1.0μg/ml 儿茶素棓酸酯 (CG)、 500 个单位的来自大肠杆菌 (E.coli) 的
X-A 型 β-d- 葡糖醛酸糖苷酶 (Sigma Chemical Co， St.Louis， MO， USA) 和 4 个单位的来自 鲍鱼内脏的 VIII 型硫酸酯酶 (Sigma Chemical Co) 混合。将混合物于 37℃温育 45 分钟。 通过添加 2ml 乙酸乙酯、 然后剧烈振摇 20min 和于 4℃以 2000X g 离心 5min 终止反应。将 上清液转入干净试管， 重复乙酸乙酯提取。将 10μl 0.02％抗坏血酸 ： 0.005％ EDTA 加入 汇集的上清液级分中， 剧烈蜗旋混合。然后将上清液于室温用氮气蒸发 2 小时至干。将样 品在 200μl 甲醇∶水 (1 ∶ 2， vol) 中重构， 充分蜗旋， 超声处理 10min， 离心 (14000rpm， 5min， 4℃ )。将 20μl 上清液注入 HPLC 系统。HPLC- 电化学检测 (ECD) 系统由 ESA Model 582 溶剂递送系统、 ESAModel 542 自动采样器、 具有 CoulArrayWin Software 1.12 的 ESA 5600CoulArrray 电 化 学 检 测 器 (ESA， Bedford， MA， USA)、 Eppendorf CH-30 柱 加 热 器、 C18Phenomenex 保护柱 (4.0mm L×3.0mm) 和 SUPELCOAscentis RP-Amide 柱 (15cmX4.6mm i.d.， 5μm 颗粒 ) 组成。在甲醇和水 (1 ∶ 2， vol) 溶液中制备标准黄烷醇溶液和内标 ( 儿 茶素棓酸酯 )， 于 -70℃贮存。于 35℃以 1ml/min 流速以 70％缓冲液 A(40mM 磷酸二氢铵， 用磷酸调节 pH 至 3.0) 和 30％缓冲液 B(40mM 磷酸二氢铵 50％ /L ∶ 50％乙腈 /L， 用磷酸 调节 pH 至 3.0) 开始洗脱柱子。1 分钟后， 梯度从 70％缓冲液 A 和 30％缓冲液 B 线性改变 至 10％缓冲液 A 和 90％缓冲液 B(1 至 10 分钟 )、 70％ A/30％ B(10-12)。通过 HPLC- 电化 学检测监测洗脱液， 电势设置在 -30、 100、 230、 400mV。主通道在 230mV。 结果 ：
表棓儿茶素 -3- 棓酸酯的血浆生物利用度
就表棓儿茶素 -3- 棓酸酯 (EGCG) 而言， 定量限为 0.005μg/mL。来自不同治疗的 表棓儿茶素 -3- 棓酸酯的动力学参数如表 7 所示。
表7： 通过治疗的表棓儿茶素 -3- 棓酸酯的动力学参数 ( 平均值 ±sd)
将葡萄籽提取物和维生素 C 添加到绿茶提取物中使 EGCg 的 AUC 和 Cmax 分别增加 了 27.5 和 20.5％。Tmax 未受该混合物的影响。如果 AUC(22h-inf.) 小于 AUC(0h-inf) 的 30％， 则可以考虑 AUC(0h-inf) 和 T1/2。表 8 给出了 来自不同治疗的表棓儿茶素 -3- 棓酸酯的 AUC(0h-inf) 和 T1/2。
表8： 通过治疗的表棓儿茶素 -3- 棓酸酯的 AUC(0h-inf) 和 T1/2( 平均值 ±sd)
与单独消耗的绿茶提取物 (GT) 相比， 当把绿茶与葡萄籽提取物和维生素 C 混合 时， 表棓儿茶素 -3- 棓酸酯的这些外推动力学曲线的平均 AUC 增加了 26％。T1/2 也增加了 21％。
表儿茶素 -3- 棓酸酯的血浆生物利用度
就表儿茶素 -3- 棓酸酯而言， 定量限为 0.005μg/mL。来自不同治疗的表儿茶 素 -3- 棓酸酯的动力学参数如表 9 所示。
表9： 通过治疗的表儿茶素 -3- 棓酸酯的动力学参数 ( 平均值 ±sd)
在治疗 [GT] 中， t 受试者的数据 “16b” 丢失。
与绿茶提取物一起共同摄入葡萄籽提取物和维生素 C 使 ECg 的 AUC、 Cmax 和 Tmax 分别增加了 42.5、 26 和 47％。
如果 AUC(22h-inf.) 小于 AUC(0h-inf) 的 30％， 则可以考虑 AUC(0h-inf) 和 T1/2。大部分受试 者具有的 AUC(22h-inf.) 大于 AUC(0h-inf) 的 30％。因此可以不进行外推。
表棓儿茶素的血浆生物利用度
就表棓儿茶素而言， 定量限为 0.005μg/mL。
来自不同治疗的表棓儿茶素的动力学参数如表 10 所示。
表 10 ： 通过治疗的表棓儿茶素的动力学参数 ( 平均值 ±sd)
在治疗 [GT] 中， t 受试者的数据 “04b” 、 “10c” 和 “14c” 丢失。 与绿茶提取物一起共同摄入葡萄籽提取物和维生素 C 使 EGC 的 AUC 和 Cmax 分别增加了 3.9 和 18.5％。Tmax 未受混合物的影响。
如果 AUC(22h-inf.) 小于 AUC(0h-inf) 的 30％， 则可以考虑 AUC(0h-inf) 和 T1/2。表 11 给出 了来自不同治疗的表棓儿茶素的这些 AUC(0h-inf) 和 T1/2。
表 11 ： 通过治疗的表棓儿茶素的 AUC(0h-inf) 和 T1/2( 平均值 ±sd)
当外推 AUC 时， 动力学参数未增加。
表儿茶素和儿茶素的血浆生物利用度
由于葡萄籽提取物含有总计 24.3％的儿茶素和表儿茶素， 未能进行表儿茶素和儿 茶素的比较。
结论 ：
绿茶提取物的主要儿茶素物质 (EGCg) 的生物利用度被证明当与维生素 C 和葡萄 籽提取物的混合物共同摄入时得以增加。对 ECg 做出了同样的观察结果。