《冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103333234 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103333234 A *CN103333234A* (21)申请号 201310313597.0 (22)申请日 2013.07.24 C07K 14/415(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 甘肃农业大学 地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村 1 号 (72)发明人 孙万仓 杨刚 史鹏辉 王丽萍 刘自刚 曾秀存 方彦 武军艳 杨宁宁 孔德晶 鲁美宏 赵艳宁 董红业 王月 (74)专利代理机构 兰州振华专利代理有。
2、限责任 公司 62102 代理人 张真 (54) 发明名称 冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法 (57) 摘要 本发明涉及抗冻蛋白提取方法， 尤其涉及冬 油菜根质外体抗冻蛋白提取方法， 利用该方法成 功的从冷诱导的冬油菜根提取出了质外体抗冻蛋 白。 一种冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法， 其 特征是包括有以下步骤 ：（1） 采样 ；（2） 提取缓冲 液配制 ；（3） 切条 ：（4） 浸洗 ；（5） 抽真空 ；（6） 离 心。通过本发明成功的快速从冷诱导的冬油菜根 部提取出了质外体抗冻蛋白， 为进一步研究冬油 菜抗寒机理提供技术支撑。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附。
3、图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103333234 A CN 103333234 A *CN103333234A* 1/1 页 2 1. 一种冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法， 其特征是包括有以下步骤 ： （1） 采样 ： 在 10 至 12 月或至第二年 1 月份， 在田间挖出油菜根， 在 3-5 分钟内放入冰 盒， 带回实验室， 保存于 3-5冰箱 ； （2） 提取缓冲液 1000ml 按下列重量体积配制 ： 0.05M/L Tris-Hcl 6.057g 调 ph 到 8.0 ； 0.。
4、01M/L EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二钠） 3.72g ； 0.02M/LVC（维生素 c） 3.52g ； 用 ddH2O 定容至 1000ml， 配好的缓冲液在 3-5环境中保存 ； （3） 切条 ： 清除油菜根部携带的土壤、 去除根部干死部分， 流水冲洗 10-12min， 杂物洗 净为止， 用 ddH2O 冲洗 2 遍， 用滤纸吸干表面水分后， 将根清洗后剖开切成 1-2cm 长条 ； （4） 浸洗 ： 用上述缓冲液浸洗切成条的根 ； （5） 抽真空 ： 将切成条的油菜根放入带塞的容器中， 加入 80-100ml 上述缓冲液， 抽真 空， 稳定到 0.07-0.08Mp。
5、a 后， 继续抽真空 7-10min ； （6） 离心 ： 倒掉缓冲液， 用滤纸吸去根表面溶液后， 将其放入注射器内， 将注射器放入 50ml 离心管， 在转速为 6100-6200rpm， 3-5， 离心 14-16min， 收集离心管底部液体， 即为非 质体提取物。 2. 如权利要求 1 所述的冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法， 其特征是还包括有以下 步骤 ： （7） 巯基乙醇溶液配制配方 0.5mol/L Tris-HCL(PH=6.8) 12.5 甘油 10 - 巯基乙醇 5 ddH2O 72.5 （8） 提纯 ： A. 把步骤 （6） 提取物加入 5 倍体积的冷丙酮， -20预冷， 。
6、在 -20沉淀 10-20h 后， 在 转速为 10000rpm， 4， 30min 离心， 倾去丙酮， 沉淀在 -20挥发丙酮， 获得冻干蛋白样品 ； B. 用巯基乙醇混合液溶解步骤 （8） A 的冻干蛋白样品， 充分溶解， 再在转速为 10000rpm， 4， 15min 离心， 取上清液， 在 -20保存备用。 权 利 要 求 书 CN 103333234 A 2 1/6 页 3 冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法 技术领域 0001 本发明涉及抗冻蛋白提取方法， 尤其涉及冬油菜根质外体抗冻蛋白提取方法， 利 用该方法成功的从冷诱导的冬油菜根提取出了质外体抗冻蛋白。 背景技术 0002 低。
7、温是影响我国北方植物正常生长发育的主要环境因子之一。植物遇到低温胁 迫时， 体内会发生一系列生理生化变化来适应低温胁迫， 同时还会合成和分泌多种蛋白 质 - 低温诱导蛋白。抗冻蛋白 （AFPs） 是低温诱导蛋白中的一类， 可在植物的根、 茎、 叶等不 同器官中产生， 也可以存在于组织培养条件下的愈伤组织， 悬浮培养细胞及悬浮培养液中。 它们在细胞的定位很复杂， 可存在于胞间隙、 细胞壁、 细胞核、 细胞膜、 细胞质等多种细胞器 中， 目前发现在耐冻植物中分离的抗冻蛋白在非质体中含量较高并且具有冰晶形态效应、 热滞效应 （Thermal Hysteresis,TH） 、 重结晶抑制效应 （Rec。
8、rystallization Inhibition） 。 AFPs 的三个特性表明， 在低温下它与冰晶的形成直接相关， 因此对植物的保护具有直接性， 是植物抗寒的主要物质基础。 0003 1964 年抗冻蛋白 (AFPs) 在黄粉甲幼虫中第一次被发现后， 经过半个世纪的研 究， 今天人们已经在鱼类、 昆虫、 植物、 细菌和真菌等多种生物中均发现抗冻蛋白 (AFPs) 的存在。迄今为止， 鱼类、 昆虫的 AFPs 研究已经非常深入和系统， 而植物中 AFPs 的发 现比较晚。1992 年， Griffith 等第一次从经低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦 (Secalecereale) 叶片质。
9、外体中得到并部分纯化了 AFPs， 开启了植物抗冻蛋白的研究。之 后人们在沙冬青 （Ammopiptanthus monglicus） 、 高山植物唐古特红景天、 胡萝卜 （Daucus carota） 、 珠芽蓼 (Polygonumviviparum) 和冬小麦等许多植物中也发现了 AFPs。 0004 冬油菜是北方非常重要的农作物， 特别是北方冬油菜要经过寒冷漫长的冬季， 才 能返青、 抽薹、 开花和结籽。根是冬油菜冬季唯一的越冬器官。因此研究根部抗冻蛋白是北 方冬油菜抗寒性鉴定的有效途径之一。油菜抗冻蛋白研究尚无成熟方法。本发明提供冬油 菜根部质外体抗冻蛋白提取方法。利用该方法能够快速。
10、有效的从油菜根部提取质外体蛋 白， 为研究冬油菜抗寒机理提供技术支撑。 发明内容 0005 本发明的目的在于避免现有技术的不足， 提供一种冬油菜根质外体抗冻蛋白的提 取方法。通过本发明成功的从冷诱导的冬油菜根部提取出了质外体抗冻蛋白， 为进一步研 究冬油菜抗寒机理提供技术支撑。 0006 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为 ： 一种冬油菜根质外体抗冻蛋白的提 取方法， 其主要特点是包括有以下步骤 ： 0007 （1） 采样 ： 在 10 至 12 月或至第二年 1 月份， 在田间挖出油菜根， 在 3-5 分钟内放 入冰盒， 带回实验室， 保存于 3-5冰箱 ； 0008 （2） 提取缓冲。
11、液 1000ml 按下列重量体积配制 ： 说 明 书 CN 103333234 A 3 2/6 页 4 0009 0.05M/L Tris-Hcl6.057g 调 ph 到 8.0 ； 0010 0.01M/L EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二钠） 3.72g ； 0011 0.02M/L VC（维生素 c） 3.52g ； 0012 用 ddH2O 定容至 1000ml， 配好的缓冲液在 3-5环境中保存 ； 0013 （3） 切条 ： 清除油菜根部携带的土壤、 去除根部干死部分， 流水冲洗 10-12min， 杂 物洗净为止， 用 ddH2O 冲洗 2 遍， 用滤纸吸干表面水分后。
12、， 将根清洗后剖开切成 1-2cm 长条 ； 0014 （4） 浸洗 ： 用上述缓冲液浸洗切成条的根 ； 0015 （5） 抽真空 ： 将切成条的油菜根放入带塞的容器 （锥形瓶最好） 中， 加入 80-100ml 上述缓冲液， 抽真空， 稳定到 0.07-0.08Mpa 后， 继续抽真空 7-10min， 时间不易过长 ； 0016 （6） 离心 ： 倒掉缓冲液， 用滤纸吸去根表面溶液后， 将其放入注射器内， 将注射器放 入 50ml 离心管， 在转速为 6100-6200rpm， 3-5， 离心 15min， 收集离心管底部液体， 即为非 质体提取物。 0017 所述的冬油菜根质外体抗冻蛋白。
13、的提取方法， 还包括有以下步骤 ： 0018 （7） 巯基乙醇溶液配制配方 0019 0.5mol/L Tris-HCL(PH=6.8)12.5 0020 甘油 10 0021 - 巯基乙醇 5 0022 ddH2O72.5 0023 （8） 提纯 ： 0024 A. 把步骤 （6） 提取物加入 5 倍体积的冷丙酮， -20预冷， 在 -20沉淀 10-20h 后， 在转速为 10000rpm， 4， 30min 离心， 倾去丙酮， 沉淀在 -20挥发丙酮， 获得冻干蛋白 样品 ； 0025 B. 用巯基乙醇混合液溶解步骤 （8） A 的冻干蛋白样品， 充分溶解， 再在转速为 10000rpm。
14、， 4， 15min 离心， 取上清液， 在 -20保存备用。 0026 本发明的有益效果 ： 本方法针对有些学者提出不能在油菜根部或很难在油菜根部 提取蛋白的观点， 经过不断的尝试和摸索， 通过本发明成功的快速从冷诱导的冬油菜根部 提取出了质外体抗冻蛋白， 为进一步研究冬油菜抗寒机理提供技术支撑。 附图说明 0027 图 1. 陇油 6 号叶片和根部质外体蛋白浓度检测 ； 0028 图 2. 不同时期陇油 6 号叶片和根部质外体蛋白电泳图谱 ； 0029 图 3. 质谱鉴定差异点取样编号 ； 0030 图4.10X物镜下观察未冷驯化的陇油6号根部质外体粗提液在-7恒温40min后 的冰晶生长。
15、情况 ； 0031 图5.10X物镜下观察冷驯化的陇油6号根部质外体粗提液在-7恒温40min后的 冰晶生长情况， 表现出明显的重结晶抑制效应。 具体实施方式 0032 以下对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发明， 并非用于限 说 明 书 CN 103333234 A 4 3/6 页 5 定本发明的范围。 0033 实施例 1 ： 第一次取样， 冬油菜陇油 6 号根部质外体蛋白的提取 ： 0034 (1） 采样 ： 在 10 月 5 号， 在田间挖出陇油 6 号根， 在 3-5 分钟内放入冰盒， 带回实 验室， 保存于 4冰箱 ； 0035 （2） 提取缓冲液 1000ml 。
16、按下列重量体积配制 ： 0036 0.05M/L Tris-Hcl6.057g 调 ph 到 8.0 ； 0037 0.01M/L EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二钠） 3.72g ； 0038 0.02M/LVC（维生素 c） 3.52g ； 0039 用 ddH2O 定容至 1000ml， 配好的缓冲液在 4环境中保存 ； 0040 （3） 切条 ： 清除油菜根部携带的土壤、 去除根部干死部分， 流水冲洗 10-12min， 杂 物洗净为止， 用 ddH2O 冲洗 2 遍， 用滤纸吸干表面水分后， 将根清洗后剖开切成 1-2cm 长条 ； 0041 （4） 浸洗 ： 用上述缓冲液。
17、浸洗切成条的根， 最好冲洗两遍以上 ； 0042 （5） 抽真空 ： 将切成条的油菜根放入带塞的容器中， 锥形瓶最好， 加入 80-100ml 上 述缓冲液， 抽真空， 稳定到 0.07-0.08Mpa 后， 继续抽真空 7-10min， 时间不易过长 ； 0043 （6） 离心 ： 倒掉缓冲液， 用滤纸吸去根表面溶液后， 将其放入注射器内， 将注射器放 入50ml离心管， 在转速为6140rpm， 4， 离心15min， 收集离心管底部液体， 即为非质体提取 物。 0044 （7） 巯基乙醇溶液配制配方 0045 0.5mol/L Tris-HCL(PH=6.8)12.5 0046 甘油 1。
18、0 0047 - 巯基乙醇 5 0048 ddH2O72.5 0049 （8） 提纯 ： 0050 A. 把步骤 （6） 提取物加入 5 倍体积的冷丙酮， -20预冷， 在 -20沉淀 10-20h 后， 在转速为 10000rpm， 4， 30min 离心， 倾去丙酮， 沉淀在 -20挥发丙酮， 获得冻干蛋白 样品 ； 0051 B. 用 80ul 巯基乙醇混合液溶解步骤 （8） A 的冻干蛋白样品， 充分溶解， 再在转速 为 10000rpm， 4， 15min 离心， 取上清液， 在 -20保存备用。 0052 实施例 2 ： 第二次取样， 陇油 6 号根部质外体蛋白的提取 ： 0053。
19、 (1） 采样 ： 在 11 月 15 日， 在田间挖出陇油 6 号根， 在 3-5 分钟内放入冰盒， 带回实 验室， 保存于 4冰箱 ； 0054 （2） 提取缓冲液 1000ml 按下列重量体积配制 ： 0055 0.05M/L Tris-Hcl6.057g 调 ph 到 8.0 ； 0056 0.01M/L EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二钠） 3.72g ； 0057 0.02M/LVC（维生素 c） 3.52g ； 0058 用 ddH2O 定容至 1000ml， 配好的缓冲液在 4环境中保存 ； 0059 （3） 切条 ： 清除油菜根部携带的土壤、 去除根部干死部分， 流。
20、水冲洗 10-12min， 杂 物洗净为止， 用 ddH2O 冲洗 2 遍， 用滤纸吸干表面水分后， 将根清洗后剖开切成 1-2cm 长条 ； 0060 （4） 浸洗 ： 用上述缓冲液浸洗切成条的根 ； 说 明 书 CN 103333234 A 5 4/6 页 6 0061 （5） 抽真空 ： 将切成条的油菜根放入带塞的容器中， 锥形瓶最好， 加入 80-100ml 上 述缓冲液， 抽真空， 压强稳定到 0.07-0.08Mpa 后， 继续抽真空 7-10min， 时间不易过长 ； 0062 （6） 离心 ： 倒掉缓冲液， 用滤纸吸去根表面溶液后， 将其放入注射器内， 将注射器放 入50ml离。
21、心管， 在转速为6140rpm， 4， 离心15min， 收集离心管底部液体， 即为非质体提取 物。 0063 （7） 巯基乙醇溶液配制配方 0064 0.5mol/L Tris-HCL(PH=6.8)12.5 0065 甘油 10 0066 - 巯基乙醇 5 0067 ddH2O72.5 0068 （8） 提纯 ： 0069 A. 把步骤 （6） 提取物加入 5 倍体积的冷丙酮 （-20预冷） ， 在 -20沉淀 10-20h 后， 在转速为 10000rpm， 4， 30min 离心， 倾去丙酮， 沉淀在 -20挥发丙酮， 获得冻干蛋白 样品 ； 0070 B. 用 80ul 巯基乙醇混合。
22、液溶解步骤 （8） A 的冻干蛋白样品， 充分溶解， 再在转速 为 10000rpm， 4， 15min 离心， 取上清液， 在 -20保存备用。 0071 实施例 3 ： 第三次取样， 陇油 6 号根部和叶片质外体蛋白的提取 ： 0072 (1） 采样 ： 在 12 月 1 日， 在田间挖出油菜根， 在 3-5 分钟内放入冰盒， 带回实验室， 保存于 4冰箱 ； 0073 （2） 提取缓冲液 1000ml 按下列重量体积配制 ： 0074 0.05M/L Tris-Hcl6.057g 调 ph 到 8.0 ； 0075 0.01M/L EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二钠） 3.72。
23、g ； 0076 0.02M/LVC（维生素 c） 3.52g ； 0077 用 ddH2O 定容至 1000ml， 配好的缓冲液在 4环境中保存 ； 0078 （3） 切条 ： 清除油菜根部携带的土壤、 去除根部干死部分， 流水冲洗 10-12min， 杂 物洗净为止， 用 ddH2O 冲洗 2 遍， 用滤纸吸干表面水分后， 将根清洗后剖开切成 1-2cm 长条 ； 0079 （4） 浸洗 ： 用上述缓冲液浸洗切成条的根 ； 0080 （5） 抽真空 ： 将切成条的油菜根放入带塞的容器 （锥形瓶最好） 中， 加入 80-100ml 上述缓冲液， 抽真空， 压强稳定到 0.07-0.08Mpa。
24、 后， 继续抽真空 7-10min（时间不易过长） ； 0081 （6） 离心 ： 倒掉缓冲液， 用滤纸吸去根表面溶液后， 将其放入注射器内， 将注射器放 入50ml离心管， 在转速为6140rpm， 4， 离心15min， 收集离心管底部液体， 即为非质体提取 物。 0082 （7） 巯基乙醇溶液配制配方 0083 0.5mol/L Tris-HCL(PH=6.8)12.5 0084 甘油 10 0085 - 巯基乙醇 5 0086 ddH2O72.5 0087 （8） 提纯 ： 0088 A. 把步骤 （6） 提取物加入 5 倍体积的冷丙酮 （-20预冷） ， 在 -20沉淀 10-20h。
25、 说 明 书 CN 103333234 A 6 5/6 页 7 后， 在转速为 10000rpm， 4， 30min 离心， 倾去丙酮， 沉淀在 -20挥发丙酮， 获得冻干蛋白 样品 ； 0089 B. 用 80ul 巯基乙醇混合液溶解步骤 （8） A 的冻干蛋白样品， 充分溶解， 再在转速 为 10000rpm， 4， 15min 离心， 取上清液， 在 -20保存备用。 0090 质外体蛋白浓度检测 ： 0091 用考马斯亮蓝染色法测定上述三次提取的质外体蛋白浓度， 结果如表1和图1。 从 图表中可以看到在根和叶中分别提取出了质外体蛋白， 并且随着气温的降低， 油菜体内质 外体蛋白含量逐渐。
26、增多。 0092 表 1 陇油 6 号叶片和根部质外体蛋白浓度检测 0093 0094 质外体抗冻蛋白的检测 0095 1.SDS-PAGE 电泳 0096 将实施例 1 至 3 次提取的质外体抗冻蛋白， 进行蛋白质电泳， 非质体蛋白的 SDS-PAGE 采用 4% 浓缩胶和 15% 的分离胶。上样量为每孔 10-15g 蛋白， 电泳时， 浓缩胶电 压为 80V， 待溴酚兰指示剂进入分离胶后电压调至 150V， 开启冷凝系统， 电泳约 3 小时后指 示剂接近前沿， 结束电泳取下玻璃板上的凝胶， 用 ddH20 冲洗掉凝胶上的电极缓冲液后， 考 马斯亮蓝 R-250 染色 1.5h， 脱色过夜。。
27、 0097 见图 2， 图中 1. 实施例 1 的叶 -10 月 2. 实施例 2 的叶 -11 月 3. 实施例 3 的叶 -12 月 4. 实施例 1 的根 -10 月 5. 实施例 2 的根 -11 月 6. 实施例 3 的根 -12 月。 0098 其中 ： S 为 -1,3- 葡聚糖酶， 在冬黑麦中已证明为一种抗冻蛋白。 0099 2. 质谱分析 ： 0100 在电泳图选取处理后的差异点取样编号， 见图 3， 切胶取点进行 MALDI-TOF/TOF 质 谱鉴定 （上海博苑生物科技有限公司） 。 0101 差异点质谱结果 0102 表 2 差异点质谱结果 0103 0104 从表 2。
28、 中看到， 1、 2、 3 和 4 个差异蛋白分别为 3- 磷酸甘油醛脱氢酶、 3- 磷酸甘油 醛脱氢、 基本葡聚糖酶酶和-1,3-葡聚糖酶， 其中-1,3-葡聚糖酶已经有人在黑麦中证 明为抗冻蛋白， 其他三个是不是抗冻蛋白还有待进一步验证。以下分别为基本葡聚糖酶酶 说 明 书 CN 103333234 A 7 6/6 页 8 和 -1,3- 葡聚糖酶的质谱结果 ； 0105 0106 0107 3. 冰晶修饰效应检测 ： 见图 4， 图 5， 0108 为检测质外体蛋白是否具有抗冻活性， 采用本实验室改进的相差显微镜观察法观 测根部和叶片质外体蛋白存在下冰晶的生长特性。 0109 图4.10。
29、X物镜下观察未冷驯化的陇油6号根部质外体粗提液在-7恒温40min后 的冰晶生长情况 ； 0110 图5.10X物镜下观察冷驯化的陇油6号根部质外体粗提液在-7恒温40min后的 冰晶生长情况， 表现出明显的重结晶抑制效应。 0111 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103333234 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103333234 A 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103333234 A 10 3/3 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 103333234 A 11 。