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1、(10)申请公布号 CN 103436598 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436598 A *CN103436598A* (21)申请号 201310157410.2 (22)申请日 2013.04.29 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 胡松楠 地址 519015 广东省珠海市九洲大道东 1144 号 申请人 邝筱珊 冯家望 (72)发明人 胡松楠 邝筱珊 冯家望 唐食明 王小玉 游淑珠 成晓维 (74)专利代理机构 广东秉德律师事务所 44291 代理人 杨焕军 田学东 (54) 发明名称 转基因大豆。
2、品系 MON89788 的 LAMP 检测引物 组、 试剂盒及检测方法 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 转 基 因 大 豆 品 系 MON89788 的 LAMP 检 测 引 物 组、 试 剂 盒 及 检 测 方 法， 其 中， LAMP 检 测 引 物 组 包 括 下 列 引 物 ： 外 引 物 F3 ： TGCGCATCTATCGTGGAT ；外 引 物 B3 ： TGCATGTGCAGGTTCAGT ； 内引物 FIP ： TGATGCTAGTTA TCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTTCC ； 内引物 BIP ： CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAG。
3、TCTCAGTTCCCAGT。 LAMP 检测引物组对转基因大豆品系 MON89788 具 有良好的特异性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103436598 A CN 103436598 A *CN103436598A* 1/2 页 2 1. 转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物组， 其特征在于， 包括下列引物 ： 外引物 F3 ： TGCGCATCTATCGTGGAT ； 外引。
4、物 B3 ： TGCATGTGCAGGTTCAGT ； 内引物 FIP ： TGATGCTAGTTATCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTTCC ； 内引物 BIP ： CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAGTCTCAGTTCCCAGT。 2. 转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测试剂盒， 其特征在于， 包括以下成分 ： ； 其中， 外引物 F3 ： TGCGCATCTATCGTGGAT ； 外引物 B3 ： TGCATGTGCAGGTTCAGT ； 内引物 FIP ： TGATGCTAGTTATCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTT。
5、CC ； 内引物 BIP ： CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAGTCTCAGTTCCCAGT。 3.根据权利要求2所述的转基因大豆品系MON89788的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 还包括显色剂。 4.根据权利要求3所述的转基因大豆品系MON89788的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述显色剂为荧光染料 SYBR Green I。 5. 根据权利要求 2 所述的转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测试剂盒， 其特征 在于， 还包括对照物 ： 阳性对照为纯度为 100、 DNA 浓度为 100ng/ul 的转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA。
6、 溶液， 阴性对照为 ddH2O。 6. 转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (101) 对待检样品提取待检模板 DNA ； (102) 进行环介导等温基因扩增反应 ： (102) 进行环介导等温基因扩增反应 ： 权 利 要 求 书 CN 103436598 A 2 2/2 页 3 配置 LAMP 反应体系， 每 25L 体积的 LAMP 反应体系具体为 ： ， 将 LAMP 反应体系置于 LAMP 浊度仪中进行 63恒温反应 60min， 然后在 80下保温 5min ； 其中， 外引物 F3 ： TGCGCATCTATCGTGGAT 。
7、； 外引物 B3 ： TGCATGTGCAGGTTCAGT ； 内引物 FIP ： TGATGCTAGTTATCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTTCC ； 内引物 BIP ： CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAGTCTCAGTTCCCAGT。 权 利 要 求 书 CN 103436598 A 3 1/7 页 4 转基因大豆品系MON89788的LAMP检测引物组、 试剂盒及检 测方法 【技术领域】 0001 本发明属于食品安全领域， 涉及环介导等温扩增技术， 具体涉及转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物组、 试剂盒及检测方法。 【背景技术】 。
8、0002 转基因作物是指利用重组 DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、 改变 其遗传组成后产生的植物及其后代， 也称为遗传修饰生物体 (Genetically modified organisms， GMOs)。自 1983 年首例转基因植物问世以来， 全球转基因作物的种植面积和销 售收入均以倍数增长。但从严肃的科学意义上说， 转基因农产品的生物安全性目前尚无确 定的结论。虽然我国规定自 2002 年 3 月 20 日起， 所有转基因农作物及其副产品都应加以 标志， 但是在进口转基因大豆数量超出国产大豆的形势下， 仍然很少见到加注转基因字样 的农产品。因此开发简便的转基因大豆检测技术并。
9、对相关产品进行检测势在必行。 0003 目前普遍应用基于 DNA 的检测技术对转基因作物进行检测。该类技术主要包括 传统定性 PCR 和定量 PCR。这些检测技术都需要特殊的 DNA 扩增仪 (PCR 仪 ) 才能够完成。 而环介导的等温基因扩增技术 (Loop-Media tedLsothcrmal AmpliFication， LAMP) 侬赖 于能够识别靶序列上 6 个特异区域的引物和一种具有链置换特性的 DNA 聚合酶， 利用链置 换 DNA 聚合酶在恒温条件保温几十分钟， 完成核酸扩增反应 ； 可以在 1 小时之内， 将靶基因 DNA 片段扩增 109-1010 倍， 并且只要用肉眼。
10、观察白色混浊沉淀， 就能鉴定是否扩增， 不需要 电泳检测过程。 0004 查阅转基因大豆品系 MON89788 相关文献， 了解转基因大豆品系 MON89788 关于外 源基因和大豆基因组插入处接头序列信息， 部分序列信息具体为 ： 0005 CGACACTTTTGCCTGTTCGTCTTCTAGCCTTCGCCCATGACTAGCAGCTAGGTTCACCTTCTCTTCATA TTGGTCAATGATTATCAACATATTTTCTTTTGTTTTGCTCAACTGTTCTC TCAAACTTCTCTTCGATCTCTGACAA CTCTTTAACTTATCCTCTAACATCAGGTTT。
11、TCCATACTTGATTTGTCCCTCTTGGCTTTTCTAAGTTTGAGCTCGTT ACTGCTGCCCCACAAAGCCCCTCGAAACTTGTTCCTGCTCCACTCTTCCTTTTGGGCTTTTTTGTTTCCCGCTCTAG CGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCCCATC AAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGTCCAAAGC CTCAACAAGGTCAGGGTA。
12、CAGAGTCTCCAAACCATTAGCCAAAAGCTACAGGAGATCAATGAAGAATCTTCAATCAA AGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACATCCACCGAAGACTTAAAGTTAG TGGGCATCTTTGAAAGTAATCTTGTCAACATCGAGCAGCTGGCTTGTGGGGACCAGACAAAAAAGGAATGGTGCAGA ATTGTTAGGCGCACCTACCAAAAGCATCTTTGCCTTTATTGCAAAGATAAAGCAGATTCCTCTAGTACAAGTGGGGA ACAAAA。
13、TAACGTGGAAAAGAGCTGTCCTGACAGCCCACTCACTAATGCGTATGACGAAC ； 0006 经序列分析， 确定了 ATCAAGCTCCAAACACTGA 为大豆基因组和外源插入序列的接头 部分 ( 简称， 89788 品系接头序列 )。 说 明 书 CN 103436598 A 4 2/7 页 5 【发明内容】 0007 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种转基因大豆品系MON89788的LAMP检 测引物组， 其对转基因大豆品系 MON89788 具有良好的特异性。 0008 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种转基因大豆品系MON89788的LAMP检 测。
14、试剂盒， 其便于对转基因大豆品系 MON89788 进行 LAMP 检测。 0009 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种转基因大豆品系MON89788的LAMP检 测方法， 其具有灵敏较高、 特异性良好、 检测快速可靠、 操作简单的特点。 0010 上述第一个技术问题通过以下技术方案实现 ： 0011 一种转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物组， 其特征在于， 包括下列引物 ： 0012 外引物 F3 ： TGCGCATCTATCGTGGAT ； 0013 外引物 B3 ： TGCATGTGCAGGTTCAGT ； 0014 内引物 FIP ： 0015 TGATGCT。
15、AGTTATCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTTCC ； 0016 内引物 BIP ： 0017 CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAGTCTCAGTTCCCAGT。 0018 通过实验证明， 本发明提供的 LAMP 检测引物组对大杏仁、 大米、 荞麦、 小麦、 蚕豆、 苦荞麦、 扁豆、 土豆、 燕麦、 绿豆、 豌豆、 白云豆、 红豆、 玉米、 四季豆、 豇豆、 大豆、 转基因大豆 A5547-127、 转基因大豆 DP305423、 转基因大豆 DP356043 均无非特异扩增。因此， 本发明提 供的 LAMP 检测引物组对转基因大豆品系 MON89788 具有。
16、良好的特异性， 该 LAMP 检测引物组 针对的靶基因片段是背景技术中所述的 89788 品系接头序列。 0019 上述第二个技术问题通过以下技术方案实现 ： 0020 转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测试剂盒， 其特征在于， 包括以下成分 ： 0021 0022 ； 其中， 引物液中的各引物对应为所述转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物 组中的各引物。 0023 还包括显色剂 ； 所述显色剂为荧光染料 SYBR Green I。 说 明 书 CN 103436598 A 5 3/7 页 6 0024 还包括对照物 ： 阳性对照为纯度为100、 DNA浓度。
17、为100ng/ul的转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液， 阴性对照为 ddH2O。 0025 本发明提供的 LAMP 检测试剂盒集合了上述 LAMP 检测引物及 LAMP 检测的相关用 料， 便于使用者对转基因大豆品系 MON89788 进行 LAMP 检测。 0026 上述第三个技术问题通过以下技术方案实现 ： 0027 转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 0028 (101) 对待检样品提取待检模板 DNA ； 0029 (102) 进行环介导等温基因扩增反应 ： 0030 配置 LAMP 反应体系， 每 25L 。
18、体积的 LAMP 反应体系具体为 ： 0031 0032 ， 将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63恒温反应60min， 然后在80下保 温 5min ； 其中， 引物液中的各引物对应为所述转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物 组中的各引物。 0033 通过实验证明， 本发明提供的 LAMP 检测方法结合上述引物的良好特异性及 LAMP 方法的优点， 具有以下特点 ： 灵敏度较高、 快速可靠、 稳定性良好、 操作简单、 鉴定简单。 【附图说明】 0034 图 1 为实施例一中进行 LAMP 反应的结果示意图 ； 0035 图 2 为实施例二中进行灵敏度实验的结果示意。
19、图 ； 0036 图 3- 图 5 为实施例三中进行特异性实验的结果示意图 ； 0037 图 6- 图 8 为实施例四进行 5精密度实验的结果示意图 ； 0038 图 9- 图 11 为实施例四进行 1精密度实验的结果示意图。 【具体实施方式】 0039 实施例一 说 明 书 CN 103436598 A 6 4/7 页 7 0040 本实施例一提供的转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物组， 其包括下列引 物 ： 0041 外引物 F3 ： TGCGCATCTATCGTGGAT ； 0042 外引物 B3 ： TGCATGTGCAGGTTCAGT ； 0043 内引物 FI。
20、P ： 0044 TGATGCTAGTTATCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTTCC ； 0045 内引物 BIP ： 0046 CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAGTCTCAGTTCCCAGT。 0047 该引物组针对的靶基因是背景技术中所述的 89788 品系接头序列。 0048 本实施例一提供的转基因大豆品系 MON89788 的试剂盒， 其包括以下成分 ： 0049 0050 ； 其中， 引物液中的各引物对应为所述转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物 组中的各引物。 0051 本实施例一提供的对待检样品进行检测的方法， 具体包括以下步。
21、骤 ： 0052 (101) 对待检样品提取待检模板 DNA ； 0053 提取方法可采用 CTAB 法或商品化提取 DNA 试剂盒上提供的方法 ； 0054 (102) 进行环介导等温基因扩增反应 ： 0055 配置总体积为 25L 的 LAMP 反应体系， 具体为 ： 0056 说 明 书 CN 103436598 A 7 5/7 页 8 0057 ， 其中， 引物液中的各引物对应为所述转基因大豆品系MON89788的LAMP检测引物 组中的各引物 ； 将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63恒温反应60min， 然后在80 下保温 5min ； 0058 (103) 结果判断， 可。
22、以通过以下两种方式中一种进行 ： 0059 第一种方式 ： 通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果， 若出现沉淀为 阳性， 若没出现沉淀为阴性 ； 0060 第二种方式是 ： 在上述反应管中分别加入 1-2L 显色剂 ( 通常用量为 2L)， 混 匀， 若呈绿色为阳性， 呈橙色则为阴性。 0061 选择上述引物进行 LAMP 检测， 具有出峰时间早、 信号强的特点， 如图 1 所示， 以转 基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液代替待检模板 DNA， 另 外进行上述步骤 (102) ； 以 ddH2O 作为阴性对照， 具体是以 ddH2O 代替待检模板 DNA， 另外进行上。
23、述步骤 (102) ； 两者的 LAMP 反应结果见图 1， 在图 1 中， CH1、 CH2 分别对应转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液、 ddH2O。 0062 在本文中， 转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液的参数为 ： 纯度为 100， DNA 浓度为 100ng/ul。 0063 在本文中， DNA 浓度及纯度的测定为 ： 0064 取 5L DNA 溶液加 ddH2O 梯度稀释至 1mL， 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度 计测 260nm 和 280nm 处的光密度值 ； DNA 的浓度按照以下公式计算获得 ： 0065 C AN50/100。
24、0 ； 0066 式中， CDNA 浓度 (g/L)， A260nm 处的吸光值， N核酸稀释倍数， 1OD260nm 50g/mL 双链 DNA ； 当 OD260/OD280比值在 1.7 1.9 之间时， 适宜于 LAMP 检测。 0067 实施例二 0068 在本实例中， 主要对实施例一提供的检测方法进行灵敏度实验， 具体是 ： 0069 将转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液用非转基因大豆的 DNA 溶液分别稀 释成五个不同纯度的混合溶液， 五个混合溶液中， 转基因大豆品系 MON89788 的 DNA 的纯度 说 明 书 CN 103436598 A 8 6/7 。
25、页 9 分别为5、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01； 每个纯度的混合溶液分别取2L， 均取代待检模 板 DNA 另外操作实施例一中所述的步骤 (102) ； 以 ddH2O 作为阴性对照， 以转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液作为阳性对照， 分别取代待检模板 DNA 另外操作实施例一中所述 的步骤 (102)。 0070 实验结果见图 2 所示， 在图 2 中， CH21 线 -CH27 线分别对应于纯度为 0.01的混 合溶液、 纯度为 0.05的混合溶液、 纯度为 0.1的混合溶液、 纯度为 0.5的混合溶液、 纯 度为 5的混合溶液、 ddH2O、 转基因大。
26、豆品系 MON89788 的标 准 DNA 溶液。 0071 实施例一的检测方法的检测限可达在纯度为 0.5的含有转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液检测出转基因大豆品系 MON89788 ； 因此， 本方法具有较高的灵敏 度。 0072 实施例三 0073 在本实例中， 主要对实施例一提供的引物进行特异性实验， 具体是 ： 0074 用大杏仁、 大米、 荞麦、 小麦、 蚕豆、 苦荞麦、 扁豆、 土豆、 燕麦、 绿豆、 豌豆、 白云豆、 红豆、 玉米、 四季豆、 豇豆、 大豆、 转基因大豆 A5547-127、 转基因大豆 DP305423、 转基因大豆 DP356043的D。
27、NA分别取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102) ； 以ddH2O作 为阴性对照， 以转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液作为阳性对照， 分别取代待检模 板 DNA 另外操作实施例一中所述的步骤 (102)。 0075 部分实验结果见图 3 所示， 在图 3 中， CH31 线 -CH38 线分别对应于大杏仁、 大米、 荞麦、 小麦、 蚕豆、 苦荞麦、 扁豆、 土豆。 0076 部分实验结果见图 4 所示， 在图 4 中， CH41 线 -CH48 线分别对应于燕麦、 绿豆、 豌 豆、 白云豆、 红豆、 玉米、 四季豆、 豇豆。 0077 部分实验结果见图 5。
28、 所示， 在图 5 中， CH51 线 -CH56 线分别对应于大豆、 转基 因大豆 A5547-127、 转基因大豆 DP305423、 转基因大豆 DP356043、 ddH2O、 转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液。 0078 由图 3 至图 5 所显示的结果可见， 上述引物仅对转基因大豆品系 MON89788 具有特 异性， 因此， 上述引物的特异性良好， 因此， 在此前提下， 本发明提供的检测方法非常可靠。 0079 实施例四 0080 在本实例中， 主要对实施例一提供的检测方法进行稳定性实验， 具体包括 ： 0081 1、 5精密度实验 0082 将转基因大豆品。
29、系 MON89788 的标准 DNA 溶液用非转基因大豆的 DNA 溶液分别稀 释成纯度为 5的混合溶液， 分别取 20 份量为 2L 的混合溶液， 均取代待检模板 DNA 另外 操作实施例一中所述步骤 (102) ； 以 ddH2O 作为阴性对照， 含有 89788 品系接头序列的质粒 作为阳性对照， 分别取代待检模板 DNA 另外操作实施例一中所述的步骤 (102)。 0083 结果见图 6- 图 8， 图 6 的 8 根曲线、 图 7 中的 8 根曲线及图 8 中的 CH81-CH84 的四 根曲线是对应上述 20 份量为 2L 的混合溶液， 图 8 中 CH85 线、 CH86 线分别。
30、对应 ddH2O、 含 有 89788 品系接头序列的质粒 ； 从图上来看， 18 根曲线的出现位置都很接近， 因此， 可见本 检测方法的稳定性好。 0084 2、 1精密度实验 0085 将转基因大豆品系 MON89788 的标准 DNA 溶液用非转基因大豆的 DNA 溶液分别稀 说 明 书 CN 103436598 A 9 7/7 页 10 释成纯度为 1的混合溶液， 分别取 18 份量为 2L 的混合溶液， 均取代待检模板 DNA 另外 操作实施例一中所述步骤 (102) ； 以 ddH2O 作为阴性对照， 含有 89788 品系接头序列的质粒 作为阳性对照， 分别取代待检模板 DNA 。
31、另外操作实施例一中所述的步骤 (102)。 0086 结果见图9-图11， 图9的8根曲线、 图10中的8根曲线及图11中的CH91-CH94的 四根曲线是对应上述18份量为2L的混合溶液， 图11中CH95线、 CH96线分别对应ddH2O、 含有 89788 品系接头序列的质粒 ； 从图上来看， 20 根曲线的出现位置都很接近， 因此， 可见 本检测方法的稳定性好。 0087 本发明不局限于上述实施例， 基于上述实施例的、 未做出创造性劳动的简单替换， 应当属于本发明揭露的范围。 0088 序列表 0089 0090 转基因大豆品系 MON89788 的 LAMP 检测引物组、 试剂盒及检。
32、测方法 0091 胡松楠 ； 邝筱珊 ； 冯家望 0092 4 0093 PatentIn version3.5 0094 1 0095 18 0096 DNA 0097 人工序列 0098 1 0099 TGCGCATCTATCGTGGAT 18 0100 2 0101 18 0102 DNA 0103 人工序列 0104 2 0105 TGCATGTGCAGGTTCAGT 18 0106 3 0107 42 0108 DNA 0109 人工序列 0110 3 0111 TGATGCTAGTTATCGCGGCCGCGGGTATCGTCATTCAGTTCC 42 0112 4 0113 39 。
33、0114 DNA 0115 人工序列 0116 4 0117 CAGGTCCTGCACGTGTGGATTGGAGTCTCAGTTCCCAGT 39 。 说 明 书 CN 103436598 A 10 1/1 页 11 0001 序 列 表 CN 103436598 A 11 1/6 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103436598 A 12 2/6 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103436598 A 13 3/6 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103436598 A 14 4/6 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103436598 A 15 5/6 页 16 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103436598 A 16 6/6 页 17 图 11 说 明 书 附 图 CN 103436598 A 17 。