《包括1745CG突变的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《包括1745CG突变的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用.pdf（26页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103436544 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436544 A *CN103436544A* (21)申请号 201310401059.7 (22)申请日 2013.09.05 C12N 15/53(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 蔡剑平 地址 100730 北京市东城区东单大华路 1 号 科教楼 9 层中心实验室 (72)发明人 蔡剑平 胡国新 戴大鹏 耿培武 蔡杰 (74)专利代理机构 北京邦信阳专利商标代理有 限公。
2、司 11012 代理人 陈悦军 (54) 发明名称 包括 1745CG 突变的 CYP2D6 基因片段、 所编 码的蛋白质片段及其应用 (57) 摘要 本发明属于生物学领域， 涉及 CYP2D6 等位基 因第 1745 位的单碱基突变， 所述位点由 C 突变为 G。具体地， 本发明涉及包含该突变位点的核酸片 段及其相应编码的蛋白质片段、 鉴定所述突变位 点的试剂、 检测方法和该位点的应用， 特别是鉴定 该位点在指导用药中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 14 页 序列表 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页。
3、 说明书14页 序列表7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103436544 A CN 103436544 A *CN103436544A* 1/2 页 2 1.核酸片段， 所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第1745位的突变位点， 且是SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列中的至少 10 个连续核苷酸， 其中第 1745 位的核苷酸是 G ； 或者 所述核酸片段包含对应于 SEQ ID NO.2 的第 492 位的突变位点， 且是 SEQ ID NO.2 所示的 核苷酸序列中的至少 10 个连续核苷酸， 其中第 492 位的核苷酸是 G ； 或者为上述核酸片段 的反向互补。
4、序列。 2. 根据权利要求 1 所述的核酸片段， 其特征在于， 所述核酸片段的长度是 10-100、 101-200、 201-500 或 501-1000 个核苷酸 ； 优选地， 所述核酸片段的长度是 10-20、 21-30、 31-40、 41-50、 51-60、 61-100 或 101-300 个核苷酸 ； 进一步优选地， 所述核酸片段是 SEQ ID NO.1、 2 或 14-18 所示的序列。 3. 等位基因特异性寡核苷酸， 所述寡核苷酸与含有对应于 SEQ ID NO.1 的第 1745 位 或对应于SEQ ID NO.2的第492位的突变位点的等位基因片段或其反向互补序列全。
5、部或部 分杂交， 其中 SEQ ID NO.1 的第 1745 位或 SEQ ID NO.2 的第 492 位的突变位点的核苷酸是 G ； 所述等位基因片段是 SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列中的至少 10 个连 续核苷酸或其反向互补序列。 4. 根据权利要求 3 所述的等位基因特异性寡核苷酸， 其特征在于， 所述寡核苷酸是探 针或引物 ； 优选地， 当所述寡核苷酸是探针时， 所述寡核苷酸的长度是 5-100 个核苷酸 ； 当 所述寡核苷酸是引物时， 所述寡核苷酸的长度是 15-40 个核苷酸 ； 优选地， 当所述寡核苷酸 是探针时， 所述突变位点位于探针序。
6、列的中心或大约中心处 ； 当所述寡核苷酸是引物时， 所 述突变位点位于引物的 3 末端。 5. 根据权利要求 4 所述的等位基因特异性寡核苷酸， 其特征在于， 所述寡核苷酸是如 SEQ ID NO.19-23 所示的序列。 6. 一种用于检测和 / 或分析单碱基突变的试剂盒， 包括根据权利要求 1 或 2 所述的核 酸片段或根据权利要求 3-5 任一项所述的等位基因特异性寡核苷酸， 或包含能够作为引物 扩增所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段 ； 所述单碱基对应于 SEQ ID NO.1 的第 1745 位或 SEQ ID NO.2 的第 492 位 ； 优选地， 所述试剂盒包含 SEQ 。
7、ID NO.4 和 / 或 SEQ ID NO.5 和 / 或 SEQ ID NO.10 所示的序列片段。 7.根据权利要求1或2所述的核酸片段或根据权利要求3-5任一项所述的等位基因特 异性寡核苷酸在检测 CYP2D6 基因突变中的应用， 其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针 或引物 ； 或者在制备检测 CYP2D6 基因突变的药物中的应用 ； 或者用作检测 CYP2D6 基因突 变的检验标志物的应用。 8. 一种用药指导， 包括检测待测样品中 CYP2D6 基因的对应于 SEQ ID NO.1 的第 1745 位或 SEQ ID NO.2 的第 492 位的碱基， 当所述位点的碱基是 G 时。
8、， 调整经 CYP2D6 代谢的药 物的给药量。 9. 一种分析核酸的方法， 所述方法包括分析待测样品中的包含对应于 SEQ ID NO.1 的 序列的核酸中对应于第 1745 位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于 SEQ ID NO.2 的 序列的核酸中对应于第 492 位的核苷酸 ； 优选地， 所述方法是测序法、 限制性片段长度多态 性分析或探针杂交法。 10.CYP2D6 蛋白或其片段或变异体， 所述蛋白序列为 SEQ ID NO.3 所示的序列 ； 所述片 段或变异体包含对应于 SEQ ID NO.3 的第 164 位的亮氨酸， 且为 SEQ ID NO.3 所示的氨基 权 利 要 。
9、求 书 CN 103436544 A 2 2/2 页 3 酸序列的至少 10 个连续氨基酸。 权 利 要 求 书 CN 103436544 A 3 1/14 页 4 包括 1745C G 突变的 CYP2D6 基因片段、 所编码的蛋白质 片段及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物学领域， 涉及 CYP2D6 等位基因第 1745 位的单碱基突变。更具体 地， 本发明涉及包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段、 鉴定所述突变位 点的试剂、 检测方法和鉴定该位点在指导用药中的应用。 背景技术 0002 细胞色素 P4502D6（CYP2D6）是 CYP 酶家族重要的成员之一。其基因。
10、位于第 22 号染色体上， 包括 9 个外显子， 基因全长 9432bp（GenBank 注册号 M33388， 外显子区位于第 1620-5909 位） 。人体内该细胞色素的量只占肝脏酶总量的 2% 4%， 却参与临床上 20% 30% 药物的代谢， 这样药物包括抗抑郁药、 抗心律失常药、 抗精神病药、 镇痛药、 止咳药、 止吐 药、 抗糖尿病药及 受体阻滞药等， 研究其代谢多态性具有十分重要的临床应用价值 （参 见参考文献 1） 。 0003 CYP2D6 基因具有高度多态性。目前为止， NCBI SNP 数据库中已经收录了超过 300 个突变位点。由 CYP450 国际命名委员命名的等位。
11、基因也已有 150 多个， 另外还有多种新 发现的突变型尚未被命名 （http:/www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm） 。每个等位基因 都不同程度涉及点突变、 缺失、 插入、 重排等， 从而影响 CYP2D6 的活性， 进而影响对药物的 代谢活性， 产生不同程度的药物效应。除去野生型 CYP2D6*1 外， 目前研究较多且临床意 义较大的突变型主要包括以下 7 种 ： CYP2D6*2、 *3、 *4、 *5、 *10、 *17、 *41， 其中人种分布最 广、 研究最多、 中国人群研究资料相对最丰富的突变型是 CYP2D6*2（2850CT ； 4180GC） 和。
12、 CYP2D6*10（100CT ； 4180GC） （参见参考文献 1、 2、 3） 。 0004 根据目前的临床研究显示， CYP2D6 基因的这种多态性是造成 CYP2D6 酶活性在个 体之间差异显著的主要原因， 携带不同 CYP2D6 基因型的个体间可引起药物疗效的极大差 异， 甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此， 研究 CYP2D6 基因多态性对药物疗 效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据 （参见参考文献 3、 4） 。 发明内容 0005 本发明的目的是提供 CYP2D6 基因的新的单碱基突变位点， 包含该突变位点的核 酸片段、 其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在。
13、用药指导中的应用。 0006 本发明的第一个方面是提供核酸片段， 所述核酸片段包含对应于 SEQ ID NO.1 的 第 1745 位的突变位点， 且是 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列中的至少 10 个连续核苷酸， 其 中第 1745 位的核苷酸是 G ； 或者所述核酸片段包含对应于 SEQ ID NO.2 的第 492 位的突变 位点， 且是 SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列中的至少 10 个连续核苷酸， 其中第 492 位的核 苷酸是 G ； 或者所述核酸片段为上述核酸片段的反向互补序列。 0007 本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第1745位。
14、或对应于SEQ ID NO.2 的第 492 位的突变位点的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交的等位 说 明 书 CN 103436544 A 4 2/14 页 5 基因特异性寡核苷酸， 其中 SEQ ID NO.1 的第 1745 位或 SEQ ID NO.2 的第 492 位的突变位 点的核苷酸是 G ； 所述等位基因片段是 SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列中 的至少 10 个连续核苷酸或其反向互补序列。 0008 本发明的第三个方面是提供用于检测和 / 或分析本发明的单碱基突变的试剂盒， 所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，。
15、 或包含能够作为引物扩增 所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段 ； 所述单碱基对应于 SEQ ID NO.1 的第 1745 位或 SEQ ID NO.2 的第 492 位。 0009 本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸在检测 CYP2D6 基因突 变中的应用， 其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物 ； 或者本发明的核酸片段或寡 核苷酸用于制备检测 CYP2D6 基因突变的药物的应用 ； 或者本发明的核酸片段或寡核苷酸 用作检测 CYP2D6 基因突变的检验标志物的应用。 0010 本发明的第五个方面是提供一种用药指导， 包括检测待测样品中 CYP2D6 基因的 对应于。
16、 SEQ ID NO.1 的第 1745 位或 SEQ ID NO.2 的第 492 位的单碱基突变 ； 根据检测到的 突变， 调整由 CYP2D6 代谢的药物的给药量。 0011 本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法， 所述方法包括分析待测样品中的包 含对应于 SEQ ID NO.1 的序列的核酸中对应于第 1745 位的核苷酸或分析待测样品中的包 含对应于 SEQ ID NO.2 的序列的核酸中对应于第 492 位的核苷酸。 0012 本发明的第七个方面是提供 CYP2D6 蛋白或其片段或变异体， 所述蛋白序列为 SEQ ID NO.3 所示的序列 ； 所述片段或变异体包含对应于 SEQ。
17、 ID NO.3 的第 164 位的亮氨酸， 并 且为 SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列的至少 10 个连续氨基酸。 0013 本发明提供了包含新的单碱基突变的 CYP2D6 基因和编码序列。该基因在对应于 SEQ ID NO.2 的第 492 位核苷酸由 C 突变为 G （492CG） ， 从而引起其编码的氨基酸由苯丙氨 酸突变为亮氨酸， 即对应于 SEQ ID NO.3 的第 164 位的亮氨酸。该突变的 CYP2D6 蛋白 （命 名为 F164L） 对药物的代谢活性与野生型相比降低。该单碱基突变对携带此突变位点的个 体的用药具有指导意义。 附图说明 0014 图1是实施例1中的对。
18、应于本发明的SEQ ID NO.1序列的杂合子携带者测序图谱， 其中箭头所指为 CYP2D6 基因第 1745 位核苷酸 ； 0015 图 2 是实施例 2 构建的双基因表达载体 pIRES-Gluc-2D6 的结构示意图谱 ； 0016 图3是实施例2中所示的CYP2D6.1 （野生型） 、 CYP2D6.2 （缺陷型突变体） 、 CYP2D6.10 （缺陷型突变体） 和本发明的 F164L 蛋白针对右美沙芬的代谢能力检测结果， 其中 * 表示 p 值 G 突变。 0066 本发明中， 所述样品可以是任何包含核酸的样品， 如血液 ； 优选所述样品来自于 人。所述核酸可以是 DNA 或编码 R。
19、NA， 优选为基因组 DNA。本发明的分析核酸的方法可以以 DNA 或 RNA 为目标物。本领域技术人员可知， 当以 DNA 为检测目标物时， 分析待测样品中的 包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1745位的核苷酸， 所使用的探针或引物 根据 SEQ ID NO.1 的序列设计 ； 当以 RNA 为检测目标物时， 分析待测样品中的包含对应于 SEQ ID NO.2 的序列的核酸中对应于第 492 位的核苷酸， 所使用的探针或引物根据 SEQ ID NO.2 的序列设计。 0067 本发明的第七个方面是提供 CYP2D6 蛋白或其片段或变异体， 所述蛋白序列为 SEQ ID 。
20、NO.3 所示的序列 ； 所述片段或变异体包含对应于 SEQ ID NO.3 的第 164 位的亮氨酸， 且 为 SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列的至少 10 个连续氨基酸， 如 10-20、 21-50 或 51-100 个 氨基酸。 0068 下面将通过具体的实施例进一步说明本发明， 但以下具体的实施例仅出于示例性 的目的。 0069 实施例 1 ： 人 CYP2D6 基因新的突变位点的鉴定 0070 本实施例中， 采集汉族正常健康人群血液样本， 提取血液中的基因组 DNA， 设计测 序引物对 CYP2D6 基因的 9 个外显子进行序列扩增、 测序， 分析其 CYP2D6 基因是否。
21、存在突变 位点。 0071 1） 提取 DNA ： 0072 从被测者采取5ml静脉EDTA抗凝血液样本 ； 然后按照普通盐析法和/或采用专门 的 DNA 提取试剂盒 （购自美国 Omega 公司的 DNA 提取试剂盒） 提取待测血样的基因组 DNA。 说 明 书 CN 103436544 A 9 7/14 页 10 0073 2） PCR 扩增 ： 0074 设计扩增引物， 对获得的基因组 DNA 样品中 CYP2D6 基因的 9 个外显子序列进行扩 增。所述扩增引物对序列见表 1。 0075 采用 30L PCR 反应体系， 包括 ： 1GC PCR 缓冲液、 1.5mM MgCl2、 1。
22、00ng 的基因组 DNA、 上下游引物均为 0.2M、 dNTP 为 0.2mM、 TaKaRa 公司的 LATaqDNA 聚合酶 1.5U。使用 美国 ABI 公司的 GeneAmp PCR System9700 扩增仪扩增。PCR 扩增循环参数如下 ： 94预变 性 2 分钟， 94变性 30 秒， 60退火 30 秒， 68延伸 3 分钟， 35 个循环后再延伸 3 分钟。引 物序列信息见表 1。 0076 表 1 ： 扩增引物对序列信息 0077 0078 3） 纯化扩增产物 ： 0079 将获得的扩增产物按照 MultiScreen HTSTM试剂盒 （美国 Millipore 公。
23、司） 的使用 说明， 进行目的条带的 DNA 回收纯化。 0080 4） 测序 ： 0081 以回收后的产物为模板， 使用测序引物按照BigDye Terminator v3.1测序试剂盒 （美国 ABI 公司） 使用说明进行测序 PCR 反应， 反应结束后纯化扩增产物， 使用美国 ABI 公司 的Prism3730XL型基因测序仪进行分离以判读扩增产物的序列。 测序引物序列信息见表2。 0082 表 2 ： 测序引物序列信息表 0083 区域测序引物 (5 -3 ) 外显子 1AGGAAGCAGGGGCAAGAAC(SEQ ID NO.8) 外显子 2CGCCCTCTCTGCCCAGC(SE。
24、Q ID NO.9) 外显子 3&4TTGGAGTGGGTGGTGGA(SEQ ID NO.10) 外显子 5&6AGGARGTYAGGCTTACAGGA(SEQ ID NO.11) 外显子 7GCACAGGCTTGACCAGGAT(SEQ ID NO.12) 外显子 8&9TGTTTGGTGGCAGGGGTCC(SEQ ID NO.13) 说 明 书 CN 103436544 A 10 8/14 页 11 0084 5） 数据分析 ： 0085 将测得的序列与野生型 CYP2D6*1 序列 （GenBank 注册号 M33388） 进行比对。 0086 通过比对分析， 发现 2129 例受试。
25、者中有 1 人的 CYP2D6 基因组 DNA 携带一种全新 的突变类型， 对应的 CYP2D6 等位基因的第 1745 位的核苷酸由 C 变为 G （如图 1 所示， 其中 S 表示 C 和 G 杂合） 。该突变位于 CYP2D6 基因的第 3 外显子内， 突变点位于 cDNA 第 492 位， 据 此推断该 CYP2D6 基因编码的蛋白质中， 第 164 位氨基酸由苯丙氨酸 （F） 突变为亮氨酸 （L） 。 0087 本实施例示例性地给出了鉴定新突变位点的方法。 本领域技术人员根据上述内容 可以清楚地得知特异性地检测待测样品中包含对应于 SEQ ID NO.1 的第 1745 位核苷酸的 。
26、方法 ： 分离样品中的核酸， 在本实施例中对应的实验条件下进行扩增反应， 引物使用引物对 SEQ ID NO.4和5 ； 用测序引物SEQ ID NO.10对扩增的产物进行测序 ； 将测序结果与野生型 结果比对， 分析对应于 SEQ ID NO.1 的第 1745 位位点的核苷酸。 0088 实施例 2 ： 体外酶代谢活性分析 0089 根据现有的研究结果， 野生型 （*1 型） 对各种药物的代谢活性均比较高， 而 *2 型的 代谢活性比野生型的代谢活性有明显下降， *10型的代谢活性比*2型更低 （参见文献6、 7） 。 因此， 在本领域中已有这样一种共识 ： 同一个基因型所表达的酶对特异性。
27、底物的代谢活性 可以代表对其它底物药的代谢活性。从而， 根据某一基因型所表达的酶对特异性底物代谢 活性数据可以类推该基因型所表达的酶对其它底物药的代谢活性 （如， 可以将该基因型所 表达的酶的代谢活性与野生型所表达的酶的代谢活性进行比较） 。 0090 在本实施例中， 根据上述的突变位点， 以野生型 CYP2D6（*1） 基因为模板， 定点突 变了 CYP2D6 基因编码区的第 492 位的核苷酸 （由 C 变为 G） ， 构建表达突变型 CYP2D6 蛋白 （命名为 F164L） 的表达载体， 转染 293FT 细胞后， 添加 CYP2D6 特异性探针底物右美沙 芬， 经孵育后， 通过分析底。
28、物和代谢产物量来检测该突变型 CYP2D6 蛋白的体外代谢活性， 以判断与野生型 CYP2D6.1 相比， 其酶促代谢活性是否发生改变。该实验设计类似于我们在 CYP2C9 新突变体体外药代活性分析时的操作步骤， 其科学性已被国际药物基因组学领域最 权威的杂志 Pharmacogenomics J 认可 （见参考文献 5） 。 0091 1） CYP2D6 变异体的体外表达 0092 以包含野生型 CYP2D6（*1） 全长 cDNA 的质粒载体 （购买自 Thermo Scientific 公 司） 为模板， 利用定点诱变技术分别获得 CYP2D6*2、 CYP2D6*10 和本发明的 F1。
29、64L 突变体的 cDNA。 定点诱变技术是本领域公知技术， 本领域技术人员根据确定的模板和目标， 可以毫无 疑义地知道如何完成该步骤。将经检测序列正确的各目的基因及内参基因 Gluc （一种分泌 型荧光素酶， 其翻译产物可分泌到培养基中， 并通过特定试剂盒检测到荧光信号 ； 其骨架载 体是 pIRES pGluc-Basic， 购自 NEB 公司， 货号 N8082S） 分别连接至双基因表达载体 pIRES （购自 Clontech 公司， 货号 631605） 的 A、 B 多克隆位点中， 使一种目的基因和内参基因位于 同一 CMV 启动子控制下， 最终获得双基因表达载体 pIRES-Gl。
30、uc-2D6 （结构示意图谱见图 2） 。 构建分别包括 CYP2D6（*1） cDNA、 CYP2D6*2cDNA、 CYP2D6*10cDNA 和本发明的 F164L 突变体 的 cDNA 的四种 CYP2D6 双基因表达载体。 0093 将 5105个 293FT 细胞 （人肾上皮细胞来源， 购自 Invitrogen 公司）均匀铺 于 6 孔板 ； 过夜培养后， 利用脂质体 lip2000（Invitrogen 公司）转染 2g 质粒载体 pIRES-Gluc-2D6， 以表达各种目的蛋白 CYP2D6 及内参蛋白 Gluc。转染 24h 后进行 western 说 明 书 CN 10。
31、3436544 A 11 9/14 页 12 杂交检测， 确定上述四种目的蛋白已正确表达。 0094 细胞培养和脂质体转染是本领域公知技术， 参照 Invitrogen 公司提供的说明方 法便可进行。 0095 2） 活细胞体外孵育探针药物 0096 继续培养24小时后， 将6孔板内单孔细胞消化并重悬至300l培养基中 （使用EP 管进行） 。使用 CYP2D6 经典探针药右美沙芬 （购买自美国 Sigma 公司） 来检测该酶的活性， 该药的终浓度为 20M。在 37下， 在 5%CO2培养箱中， 300rpm 震荡孵育 3h。从 CO2培养 箱中取出培养物， 加入 20L 的 0.1MNaO。
32、H 并震荡涡旋 1min（原因是右美沙芬是弱碱， 溶液 用NaOH碱化后将以分子形态存在， 在下一步萃取过程中容易进入有机相从而被萃取出来） 。 加入 800L 冰乙酸乙酯， 震荡涡旋 2min 后置于 -40冰箱 30min， 直至下层冰冻。取出样 品， 在 4下， 以 12000g 离心 10min。将上层乙酸乙酯转移至新的 EP 管中， 在 37氮吹仪上 将乙酸乙酯吹干。加入 200L 各自初始流动相溶液复溶， 震荡涡旋 1min 后以 12000g 离心 5min。上清使用初始流动相溶液按 1:10 稀释后转移至进样瓶中。 0097 3） LC-MS/MS 检测 0098 萃取纯化后样。
33、品在 1260-6410 型仪器 （美国安捷伦公司） 上进行 LC-MS/MS 检测， HPLC 采用 ZORBAX SB-C18 柱 (150mm4.6mm， 直径 5m)。 0099 右美沙芬检测条件 ： 0100 色谱条件 0101 柱温 ： 30 0102 色谱柱 ： ZORBAX SB-C18(Agilent， 5m， 4.6150mm) 0103 进样体积 ： 2L 0104 流速 ： 0.6mL/min 0105 运行时间 ： 8min 0106 表 3 ： 右美沙芬流动相比例 0107 时间 (min)10mM 乙酸铵 （%， v/v）甲醇 （%， v/v） 0.014060 。
34、0.5595 4595 4.014060 84060 0108 质谱条件 ： 0109 电喷雾 （ESI） 离子源 （正离子） ， 多反应检测扫描 （MRM） 模式 ； 0110 离子源的温度 （TEM） ： 300 ； 0111 帘气速度 ： 11L/min ； 说 明 书 CN 103436544 A 12 10/14 页 13 0112 毛细管电压 ： 4000V ； 0113 右美沙芬 Q1/Q3 ： 272.2/213.1 ； 272.2/147.1 ； 0114 碰撞能 =30 ； 0115 母离子碎裂电压 =140 ； 0116 去甲基右美沙芬 Q1/Q3 ： 258.2-157。
35、.1 ； 258.2-133.1 ； 0117 碰撞能 =35 ； 0118 母离子碎裂电压 =135。 0119 4） LC-MS/MS 检测数据分析 0120 配制不同梯度浓度的右美沙芬及相应代谢产物去甲基右美沙芬 ( 右美沙芬 ： 2500、 1250、 500、 250、 100、 20ng/mL ； 去甲基右美沙芬 ： 1500、 750、 300、 150、 50、 25ng/mL)， 利 用 LC-MS 检测后生成标准曲线， 并用以检测各型 CYP2D6 蛋白对右美沙芬的代谢情况， 然后 用 产物 /（产物 + 底物） 来表示该探针药的代谢率， 经内参 Gluc 数值校正后， 用。
36、突变型 的代谢率与野生型的代谢率的比值来表示突变型蛋白的酶活性。 每种蛋白针对右美沙芬的 实验分别重复 3 次， 取平均值后统计结果分别见表 4 和图 3 ； 各种蛋白对右美沙芬的典型质 谱检测结果见图 4。CYP2D6 变异体的代谢能力越强， 底物 （右美沙芬） 峰的峰面积就会越小， 而产物 （去甲基右美沙芬） 峰的峰面积就会越大， 从图中可以看出， 新变异体F164L的代谢能 力明显较野生型降低， 小于典型突变体 CYP2D6.2， 但同时又大于典型突变体 CYP2D6.10。 0121 表 4 ： 293FT 细胞孵育探针药物右美沙芬的酶活性结果 0122 0123 * 指与野生型 CY。
37、P2D6.1 的相对值 0124 *p 值 0.05 0125 检测结果显示， 相对于野生型CYP2D6.1型， 已知典型缺陷型突变体CYP2D6.2对右 美沙芬的代谢活性下降约为 13%， 另外一种典型缺陷型突变体 CYP2D6.10 的代谢活性明显 下降 （降低幅度约 88%） ， 这一结果与已有文献基本一致， 表明我们的体外检测体系获得的数 据具有非常高的可信度 （参见参考文献 7、 8） 。 0126 利用该体外检测体系可以看出 ： F164L 突变体对探针药物右美沙芬的代谢活性为 野生型的 76.29%。统计学分析表明， 与野生型相比， F164L 突变体的代谢活性下降， 具有显 著。
38、性差异， 提示该突变可引起所表达的酶的代谢活性明显降低。因此， 在实践中， 需要考虑 对携带该基因型的个体在用药剂量上进行适当调节， 如减少药物的使用量和避免药物不良 反应的发生。 这种通过基因导向的药物调整对于个体差异较大的药物 （如丙咪嗪、 阿米替林 说 明 书 CN 103436544 A 13 11/14 页 14 等） 更为重要。 0127 参考文献 0128 1.Zhou SF.Polymorphism of Human Cytochrome P4502D6and Its Clinical Significance:Part I.Clinical Pharmacokinetics.。
39、2009,48(11):689-723. 0129 2.Qin S,Shen L,Zhang A,et al.Systematic polymorphism analysis of the CYP2D6gene in four different geographical Han populations in mainland China. Genomics.2008,92(3):152-158. 0130 3.ZHOU SF.Polymorphism of Human Cytochrome P4502D6and Its Clinical Significance Part II.Clinic。
40、al pharmacokinetics.2009,48(12):761-804. 0131 4. 徐艳娇 , 龚森 , 纪洪艳 , 等 .CYP2D6 基因多态性及其临床意义 . 医药导 报 .2012,31(10):1337-1340. 0132 5.Dai DP,Xu RA,Hu LM,Wang SH,Geng PW,Yang JF,et al.CYP2C9polymorphism analysis in Han Chinese populations:building the largest allele frequency database.Pharmacogenomics J.201。
41、3,DOI:10.1038/tpj.2013.2. 0133 6.Wennerholm A,Johansson I,Hidestrand M,Bertilsson L,Gustafsson LL,Ingelman-Sundberg M.Characterization of the CYP2D6*29allele commonly present in a black Tanzanian population causing reduced catalytic activity.Pha rmacogenetics2001,11:417-427. 0134 7.Sakuyama K,Sasaki。
42、 T,Ujiie S,Obata K,Mizugaki M,Ishikawa M et al.Functional characterization of17CYP2D6allelic variants(CYP2D6.2,10,14A-B,18 ,27,36,39,47-51,53-55,and57).Drug Metab Dispos.2008,36:2460-2467. 0135 序列 ： 0136 SEQ ID NO.1 ： 等位基因序列 0137 ATGGGGCTAGAAGCACTGGTGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATG 。
43、CACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGT GGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTC CCCTACCAGAAGCAAACATGGATGGTGGGTGAAACCACAGGCTGGACCAGAAGCCAGGCTGAGAAGGGGAAGCAGGT TTGGGGGACGTCCTGGAGAAGGGCATTTATACATGGCATGAAGGACTGGATTTTCCAAAGGCCAAG。
44、GAAGAGTAGGG CAAGGGCCTGGAGGTGGAGCTGGACTTGGCAGTGGGCATGCAAGCCCATTGGGCAACATATGTTATGGAGTACAAAG TCCCTTCTGCTGACACCAGAAGGAAAGGCCTTGGGAATGGAAGATGAGTTAGTCCTGAGTGCCGTTTAAATCACGAA ATCGAGGATGAAGGGGGTGCAGTGACCCGGTTCAAACCTTTTGCACTGTGGGTCCTCGGGCCTCACTGCCTCACCGG CATGGACCATCATCTGGGAATGGGATGCTAACTGGGGCCTCTCGGCAATTTTGG。
45、TGACTCTTGCAAGGTCATACCTG GGTGACGCATCCAAACTGAGTTCCTCCATCACAGAAGGTGTGACCCCCACCCCCGCCCCACGATCAGGAGGCTGGGT CTCCTCCTTCCACCTGCTCACTCCTGGTAGCCCCGGGGGTCGTCCAAGGTTCAAATAGGACTAGGACCTGTAGTCTG GGGTGATCCTGGCTTGACAAGAGGCCCTGACCCTCCCTCTGCAGTTGCGGCGCCGCTTCGGGGACGTGTTCAGCCTG CAGCTGGCCTGGACGCCGGTGGTCGTGCTCAATGGGCTGGCG。
46、GCCGTGCGCGAGGCGCTGGTGACCCACGGCGAGGA CACCGCCGACCGCCCGCCTGTGCCCATCACCCAGATCCTGGGTTTCGGGCCGCGTTCCCAAGGCAAGCAGCGGTGGG GACAGAGACAGATTTCCGTGGGACCCGGGTGGGTGATGACCGTAGTCCGAGCTGGGCAGAGAGGGCGCGGGGTCGTG GACATGAAACAGGCCAGCGAGTGGGGACAGCGGGCCAAGAAACCACCTGCACTAGGGAGGTGTGAGCATGGGGACGA 说 明 书 CN 103436544 A 14 12/14 。
47、页 15 GGGCGGGGCTTGTGACGAGTGGGCGGGGCCACTGCCGAGACCTGGCAGGAGCCCAATGGGTGAGCGTGGCGCATTTC CCAGCTGGAATCCGGTGTCGAAGTGGGGGCGGGGACCGCACCTGTGCTGTAAGCTCAGTGTGGGTGGCGCGGGGCCC GCGGGGTCTTCCCTGAGTGCAAAGGCGGTCAGGGTGGGCAGAGACGAGGTGGGGCAAAGCCTGCCCCAGCCAAGGGA GCAAGGTGGATGCACAAAGAGTGGGCCCTGTGACCAGCTGGACAGAGCCAGGGACTGCGGG。
48、AGACCAGGGGGAGCAT AGGGTTGGAGTGGGTGGTGGATGGTGGGGCTAATGCCTTCATGGCCACGCGCACGTGCCCGTCCCACCCCCAGGGGT GTTCCTGGCGCGCTATGGGCCCGCGTGGCGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGTGTCCACCTTGCGCAACTTGGGCCTGG GCAAGAAGTCGCTGGAGCAGTGGGTGACCGAGGAGGCCGCCTGCCTTTGTGCCGCCTTGGCCAACCACTCCGGTGGG TGATGGGCAGAAGGGCACAAAGCGGGAACTGGGAAGGCGGGGGACGGGG。
49、AAGGCGACCCCTTACCCGCATCTCCCAC CCCCAGGACGCCCCTTTCGCCCCAACGGTCTCTTGGACAAAGCCGTGAGCAACGTGATCGCCTCCCTCACCTGCGGG CGCCGCTTCGAGTACGACGACCCTCGCTTCCTCAGGCTGCTGGACCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCGGG CTTTCTGCGCGAGGTGCGGAGCGAGAGACCGAGGAGTCTCTGCAGGGCGAGCTCCCGAGAGGTGCCGGGGCTGGACT GGGGCCTCGGAAGAGCAGGATTTGCATAGATGGGTTTGGGAAAGGACATTCCAGGAGACCCCACTGTAAGAAGGGCC TGGAGGAGGAGGGGACATCTCAGACATGGTCGTGGGAGA。