一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103450328 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103450328 A *CN103450328A* (21)申请号 201310425776.3 (22)申请日 2013.09.17 201210352284.1 2012.09.20 CN C07K 1/22(2006.01) (71)申请人 海狸纳米科技 （苏州） 有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区星 湖路 218 号生物纳米园 A8 楼 101 室 (72)发明人 任辉 张曙光 韩蓝青 乌韦斯莱泰 安德烈亚斯布韦特莱瑟 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 。

2、限公司 44245 代理人 郭炜绵 (54) 发明名称 一种利用蛋白 A 的高密度包被磁珠纯化抗体 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用蛋白 A 的高密度包被 磁珠纯化抗体的方法， 该方法包括以下步骤 ： 将 磁珠和含有抗体的表达产物加入到反应容器中， 在反应容器外部或内部施加磁场， 然后转移出上 清液 ； 将洗涤缓冲液加入反应容器中， 撤去磁场 ； 重复洗涤磁珠 2 4 次 ； 然后加入洗脱缓冲液， 撤 去磁场， 室温下孵育 5 15min ； 施加磁场使磁珠 贴壁， 转移出溶液， 调节溶液的 pH 值至中性， 得到 纯化后的抗体。本发明使用磁珠亲和分离技术进 行抗体纯化， 比传统的。

3、抗体亲和层析技术具有更 快的抗体捕获速度 ； 此外， 纯化操作无需复杂的 层析系统， 样品无需进行澄清处理， 可以直接对粘 度较大的样品进行纯化操作 ； 再者， 使用了独特 的蛋白 A 包被磁珠， 抗体结合效率大幅提高， 蛋白 A 配基的脱落率达到极低水平。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103450328 A CN 103450328 A *CN103450328A* 1/1 页 2 1. 一种利用蛋白。

4、 A 的高密度包被磁珠纯化抗体的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 将蛋白 A 的高密度包被磁珠、 含有抗体的表达产物加入到反应容器中， 搅匀， 室温 下孵育 5 15min ； （2） 在反应容器外部或内部施加磁场 ； （3） 从反应容器中转移出上清液 ； （4） 将洗涤缓冲液加入反应容器中， 撤去磁场 ； 重复步骤 （2） （3） 一次 ； （5） 重复步骤 （4） 洗涤磁珠 2 4 次 ； （6） 将洗脱缓冲液加入反应容器中， 撤去磁场， 室温下孵育 5 15min ； （7） 施加磁场使磁珠贴壁， 转移反应容器中的溶液， 调节溶液的 pH 值至中性， 得到纯化 后的抗体 ； 步。

5、骤 （4） 所述的洗涤缓冲液含有 0.01 0.5M 的磷酸缓冲液、 1 500mM 的 NaCl， 余量 为水， pH 值 6 9 ； 步骤 （6） 所述的洗脱缓冲液含有 0.01 4M 的氨基酸， pH 值 1.9 5。 2.根据权利要求1所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法， 其特征在于 ： 步骤 （6） 所述的洗脱缓冲液所含的氨基酸为甘氨酸、 赖氨酸或精氨酸中的一种以上。 3.根据权利要求1所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 所述的含有抗体的表达产物是血清、 细胞表达液或腹水。 4.根据权利要求1所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化。

6、抗体的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 和 （7） 所述的施加磁场， 其磁通量为 1000 10000 高斯， 作用时间为 1-5min。 权 利 要 求 书 CN 103450328 A 2 1/6 页 3 一种利用蛋白 A 的高密度包被磁珠纯化抗体的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种抗体纯化的方法， 具体涉及一种利用蛋白 A 的高密度包被磁珠纯 化抗体的方法。 背景技术 0002 单克隆抗体是 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的， 其重链和 轻链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。 1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合 单克隆抗体药物 Rituxan An。

7、ti-CD20 抗体上市， 至 2007 年， FDA 已批准了 20 多种治疗性单 克隆抗体药物， 约一半用于治疗癌症， 多个已成为年销售额超十亿美元的 “炸弹药物” 。 全球 单克隆抗体药物的市场增长十分迅猛， 约有 200 多种单抗处于临床实验阶段， 占整个临床 生物技术药品总数的三分之一多， 其中四分之一在临床三期或等候批准。单抗药物已成为 全球生物制药领域发展的主旋律。 0003 单抗药物的迅猛发展对抗体纯化工业提出了新的挑战。目前， 主流的抗体纯化生 产主要包括以下步骤 ： 1、 发酵液澄清 ； 2、 抗体捕获 ； 3、 抗体精细纯化 ； 4、 抗体浓缩洗滤 ； 5、 抗体过滤除菌。

8、 / 制剂。在抗体捕获阶段， 主要应用蛋白 A 亲和层析技术从发酵上清液中提 取抗体。蛋白 A 是一种从金黄葡萄球菌细胞膜上提取的蛋白， 具有 5 个 IgG 结合结构域， 能 特异性地与抗体 Fc 端结合。现阶段最常用的蛋白 A 亲和层析介质是通过将蛋白 A 用化学 偶联的方法固定在琼脂糖凝胶表面制成亲和填料， 然后装填成层析柱。将含有抗体的发酵 上清液用泵加压注入层析柱中， 抗体被层析填料上固定的蛋白 A 捕获， 被捕获的抗体可以 通过洗脱溶液的冲洗从蛋白 A 亲和填料上解离， 达到纯化及浓缩的目的。 0004 然而， 以上抗体纯化过程存在以下缺点 ： 0005 1、 发酵溶液需进行澄清操。

9、作。 单抗通常采用哺乳动物细胞无血清悬浮培养的方法 进行制备， 发酵液中存在大量细胞， 容易对层析系统造成堵塞。 因此在层析操作之前需经过 离心或过滤操作， 去除发酵液中的细胞。工业上大规模的澄清操作通常需要流式离心机或 是超滤系统， 耗时长、 价格高昂而且日常维护复杂。 0006 2、 层析操作耗时长， 仪器昂贵。 由于填料可承受的压力及流速有限， 因此单位时间 内可处理的样品量受限于层析柱的大小及填料性质。大型的层析设备及蛋白 A 亲和纯化填 料非常昂贵， 且基本依赖进口， 是抗体纯化工业的瓶颈。 0007 3、 层析系统不能处理高粘度样品。由于受限于填料可承受的压力， 因此高粘度的 样品。

10、 （如血清或高蛋白浓度样品） 均需要经过稀释及过滤才能应用于层析操作， 造成样品体 积的放大及目标产物的稀释。 0008 4、 蛋白 A 亲和层析填料在反复冲洗的过程中容易发生蛋白 A 配体的脱落。蛋白 A 在琼脂糖基质上是通过共价偶联实现固定。比较先进的填料为实现蛋白 A 配基朝向的一致 性而达到提高配基利用率的目的， 均采用单点定向固定法， 即蛋白 A 与琼脂糖之间只通过 一个共价键进行连接， 但这种单点固定的方法使蛋白 A 容易在反复的层析柱冲洗过程中发 生脱落。而蛋白 A 是高致敏原， 容易在人体内引起免疫反应， 美国食品及药品监督管理局 说 明 书 CN 103450328 A 3 。

11、2/6 页 4 （FDA） 对单抗药物中蛋白 A 配基的残留量有严格的限定。蛋白 A 脱落现象也影响了亲和填 料的有效载量及使用寿命。 0009 近年来， 随着磁性分离技术的发展， 蛋白 A 包被的超顺磁性磁珠越来越多地应用 于免疫检测及小规模的免疫亲和纯化领域。蛋白 A 包被磁珠纯化技术无需复杂的层析设 备， 对样品的澄清度没有限制， 只需要简单的磁性吸附步骤即可很方便快捷地从单抗表达 产物中分离单抗， 有效解决了传统层析技术的不足之处。但由于目前市面上出现的蛋白 A 包被磁珠的抗体结合效率相对于传统的琼脂糖填料仍有很大的差距， 因此仍未能大规模地 应用于抗体纯化工业。 发明内容 0010 。

12、为了克服上述的现有抗体纯化方法的缺点， 本发明的目的在于提供一种利用蛋白 A 的高密度包被磁珠纯化抗体的方法。 0011 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0012 一种利用蛋白 A 的高密度包被磁珠纯化抗体的方法， 包括以下步骤 ： 0013 （1） 将蛋白 A 的高密度包被磁珠、 含有抗体的表达产物加入到反应容器中， 搅匀， 室温下孵育 5 15min， 磁珠在溶液中呈均匀分布状态 ； 在该过程中磁珠与抗体结合 ； 0014 （2） 在反应容器外部或内部施加磁场， 使磁珠沿磁场方向运动并贴在容器壁上 （见 图 1） 或磁体上 （见图 2） ； 0015 （3） 从反应容器中转移出上清液。

13、 ； 在该过程中， 抗体随磁珠贴在容器壁上或磁体 上， 其余成分被转移出反应容器 ； 0016 （4） 将洗涤缓冲液加入反应容器中， 撤去磁场， 使磁珠重新均匀分散于洗涤缓冲液 中 ； 重复步骤 （2） （3） ， 完成一次磁珠洗涤 ； 0017 （5） 重复步骤 （4） 洗涤磁珠 2 4 次， 彻底洗去磁珠上的非特异吸附物质 ； 0018 （6） 将洗脱缓冲液加入反应容器中， 撤去磁场， 使磁珠重新均匀分散于洗涤缓冲液 中， 室温下孵育 5 15min ； 该操作是将磁珠上的抗体洗脱下来 ； 0019 （7） 施加磁场使磁珠贴壁， 转移反应容器中的溶液， 调节溶液的 pH 值至中性， 得到 。

14、纯化后的抗体。 0020 步骤 （1）中的蛋白 A 的高密度包被磁珠已经申请专利， 即是中国专利申请 201210107107.7（申请号） 实施例 1 得到的交联有固定化 SL-PA 融合蛋白的磁珠。 0021 步骤 （1） 所述的含有抗体的表达产物可以是血清、 细胞表达液或腹水。 0022 步骤 （2）和 （7）所述的施加磁场， 其磁通量为 1000 10000 高斯， 作用时间为 1-5min。 0023 步骤 （4） 所述的洗涤缓冲液含有 0.01 0.5M 的磷酸缓冲液、 1 500mM 的 NaCl， 余量为水， pH 值 6 9。 0024 步骤 （6） 所述的洗脱缓冲液含有 0。

15、.01 4M 的氨基酸， pH 值 1.9 5 ； 所述的氨基 酸为甘氨酸、 赖氨酸或精氨酸中的一种以上。 0025 步骤 （7） 所述的调节 pH 值是用 1M 的三羟甲基氨基甲烷 （Tris） 溶液调节。 0026 使用后的磁珠重复步骤 （4） ， 洗涤至 pH 值为中性后可重复用于抗体纯化。 0027 本发明的机理是 ： 说 明 书 CN 103450328 A 4 3/6 页 5 0028 磁性材料的磁性随温度的变化而变化， 在低温时材料的磁性很难被改变 ； 而当温 度升高时， 材料将变成 “顺磁体” ， 其磁性很容易随周围的磁场改变而改变。 如果温度进一步 提高， 或者磁性颗粒的粒度。

16、很小时， 即便在常温下， 磁体的极性也呈现出随意性， 难以保持 稳定的磁性能， 这种现象就是超顺磁效应。 超顺磁性磁珠能在外部磁场的作用下迅速聚集， 当磁场撤离后即可重新分散而不带有剩磁。 本发明即利用磁珠的这一特性使其作为一种新 型的分离纯化基质用于生物活性物质的分离纯化技术上。 0029 本发明基于利用 SLP 将功能蛋白定向固定的方法， 获得具有固定化蛋白 A 配基的 超顺磁性磁珠 （见专利 201210107107.7 实施例 1） 。利用该磁珠对抗体的高效特异性结合， 从血清或抗体表达产物中捕获抗体， 然后利用磁性分离器将磁珠 - 抗体复合物从混合液中 分离， 经过对磁珠复合物的多次。

17、洗涤， 去除磁珠表面的非特异吸附物质， 最后用洗脱缓冲液 使抗体与磁珠解离并释放到洗脱缓冲液中， 达到纯化抗体的目的。 0030 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0031 1、 本发明使用磁珠亲和分离技术进行抗体纯化， 比传统的抗体亲和层析技术具有 更快的抗体捕获速度 （15 分钟） ； 此外， 纯化操作无需复杂的层析系统， 样品无需进行澄清 处理， 可以直接对粘度较大的样品进行纯化操作。 0032 2、 与现有的磁珠亲和分离技术相比， 本发明由于使用了独特的 SLP 固定化技术制 备的蛋白 A 包被磁珠， 抗体结合效率大幅提高， 蛋白 A 配基的脱落率达到极低水平， 使磁珠 分。

18、离技术在单克隆抗体大批量纯化中的应用成为可能。 0033 3、 本发明的纯化方法节省了发酵液澄清步骤。 本发明采用磁珠与样品直接混合孵 育的方式从样品中捕获抗体， 对样品的澄清度及粘度没有特殊要求， 可以省去传统抗体层 析纯化工艺中样品澄清过滤的步骤， 节省了相应的生产时间及设备需求。 0034 4、 本发明的纯化方法解决了传统抗体纯化层析工艺耗时长， 仪器昂贵的问题。本 发明的纯化方法无需昂贵的进口层析设备， 只需要简单的磁场 （由永磁体或电磁体提供均 可） 即可进行磁珠的分离及收集。由于磁珠具有纳米级的直径， 因此能提供极大的捕获面 积， 在 15 分钟内即可达到与抗体的饱和吸附。 003。

19、5 5、 本发明的纯化方法解决了现有抗体亲和磁珠载量低的问题。本发明采用以 SLP 功能蛋白固定化技术制备的具有纳米级直径的蛋白 A 包被磁珠为原料， 具有数倍于一般蛋 白 A 磁珠产品的抗体结合效率， 每毫克磁珠抗体结合量高达 250g， 使磁珠纯化技术的大 规模使用更经济更高效。 附图说明 0036 图 1 是利用反应容器外部的磁场进行磁珠固液分离的示意图。 0037 图 2 是利用反应容器内部的磁场进行磁珠固液分离的示意图。 0038 图 3 是实施例 1 的纯化方法中各步骤产物的 SDS-PAGE 检测结果图 ； 其中， human IgG- 人源 IgG 标准品对照， S- 纯化前的。

20、人血清， F- 纯化后的人血清， W1、 W2- 磁珠与人血清 反应后的两次洗涤上清， E1- 洗脱产物。 0039 图 4 是实施例 1 磁珠纯化产物的 western blot 验证结果图， 左图为 SDS-PAGE 电 泳图， 右图为对应的 Western blot 荧光显色图 ； 其中， M- 蛋白质标准分子量， 1- 人血清样 品， 2 5- 磁珠从人血清中纯化的洗脱产物， 6- 人源 IgG 标准品。 说 明 书 CN 103450328 A 5 4/6 页 6 0040 图 5 是实施例 2 中两种纯化方法得到的人 IgG1 的 SDS-PAGE 检测结果图 ； 其中， M- 蛋。

21、白标准分子量， 1 2-SL-PA 磁珠纯化产物， 3- 亲和层析纯化产物。 具体实施方式 0041 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0042 实施例 1 0043 利用 SL-PA 磁珠从人血清中提取人源 IgG， 包括以下步骤 ： 0044 SL-PA 磁珠制备方法见中国专利申请 一种利用 SLP 将功能蛋白定向固定的方法 （专利申请号 ： 201210107107.7） 实施例 1。 0045 （1） 取 SL-PA 磁珠 100mg， 加入 5ml 离心管中， 再加入 5ml 洗涤缓冲液 （pH 值 7.5， 含有 50mM 磷酸缓冲液。

22、和 150mM NaCl ； 下同） ， 振荡重悬， 放置于磁性分离器上 2min， 待固液 分离后吸去上清液。重复此步骤一次 ； 0046 （2） 将洗涤后的磁珠与 3ml 人血清 （购自广州蕊特生物科技有限公司） （即纯化前 的人血清 S） 混合均匀， 室温孵育 10min， 期间不时震荡以保持磁珠与血清的均匀混合 ； 0047 （3） 将离心管放置于磁性分离器上 2min， 待固液分离后吸去上清液 (F) ； 0048 （4） 加入 5ml 洗涤缓冲液， 振荡重悬， 放置于磁性分离器上 2min， 待固液分离后吸 去上清液 (W1)。重复此步骤 2 次 ( 第二次洗涤上清液为 W2) ；。

23、 0049 （5）加入 3ml 洗脱缓冲液 （含有 0.1M 甘氨酸， pH 值 2.5） ， 混合均匀， 室温孵育 10min， 期间不时震荡以保持磁珠与溶液的均匀混合 ； 0050 （6） 将离心管放置于磁性分离器上 2min， 待固液分离后收集上清液， 此上清液为含 有人 IgG 的纯化产物。上清液中马上加入 100l1M Tris 溶液 （pH8.0） 调节溶液 pH 值至 中性， 即为洗脱产物 E1 ； 0051 （7） 将步骤 （6） 的纯化产物用超纯水进行透析或超滤， 收集透析或超滤产物， 用真 空冷冻干燥机制成冻干粉。纯化产物可用于进一步精细纯化操作。 0052 人源 IgG 。

24、的纯化效果 ： 0053 （1） 磁珠纯化各步骤产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见如图 3。 0054 从图 3 可以看出， SL-PA 磁珠从人血清中的纯化产物电泳条带 （E1） 与人源 IgG 标 准品的电泳条带一致， 纯度与标准品一致。通过测定 280nm 处光吸收值计算洗脱产物中人 IgG 总量为 23.14mg， 即每毫克磁珠结合人 IgG 的量为 231.4g。整个纯化流程耗时少于 40min， 样品血清无需进行稀释及过滤， 纯化操作无需层析系统。 0055 而采用传统的抗体亲和层析法处理相同体积的血清样品， 需要将血清原液稀释 5 10 倍， 经过 0.22m 孔径滤膜过滤， 由。

25、层析系统将样品加压， 使样品流入蛋白 A 亲和纯 化层析柱， 样品中的人 IgG 与蛋白 A 配基结合， 然后再经过冲洗层析柱去除未结合的杂蛋 白， 最后用洗脱缓冲液将结合在层析柱上的抗体洗脱而得到纯化后的抗体， 全过程耗时超 过 3 小时， 需要昂贵的层析系统及过滤装置。 0056 （2） 纯化产物的验证 ： 以小鼠抗人 IgG 单克隆单体 （购自美国 ABcam 公司） 为一抗， 以羊抗小鼠 IgG-HRP（购自武汉博士德公司） 为二抗， 进行蛋白质免疫印迹检测 （Western blot） ， 验证 SL-PA 磁珠纯化产物是否为人 IgG， 结果如图 4。 说 明 书 CN 10345。

26、0328 A 6 5/6 页 7 0057 从图 4 可以看出， 磁珠从人血清中纯化的洗脱产物与人源 IgG 标准品具有相同的 免疫印迹显色结果， 证明此纯化产物为人源 IgG。 0058 （3） 纯化产物中蛋白 A 残留量测定 0059 取SL-PA磁珠从人血清中纯化的人IgG产物， 并以蛋白A亲和纯化层析柱 （HiTrap MabSelect1ml ； 美国 GE lifesciences 公司） 从人血清中纯化的人 IgG 产物为对照组， 用蛋 白 A ELISA 检测试剂盒 （Protein A ELISA Kit， 美国 RepliGen 公司） 检测产物中蛋白 A 残 留量。结果如。

27、下表 ： 0060 纯化方式蛋白 A 含量 （ppm） SL-PA 磁珠纯化法12.4 蛋白 A 亲和层析法16.7 0061 美国 GE 公司的 HiTrap MabSelect 蛋白 A 亲和层析柱是现在公认的具有最低蛋白 A 脱落率的层析介质， 在抗体纯化工业中具有最广泛的应用。经酶联免疫测试， SL-PA 磁珠 的纯化产物具有比HiTrap MabSelect更低的蛋白A残留量， 符合美国食品及药品监督管理 局 （FDA） 关于抗体药物中蛋白 A 残留量的限制值 （20ppm） 。 0062 实施例 2 0063 从 CHO 细胞表达上清液中提取人源 IgG1 单克隆抗体， 包括以下步。

28、骤 ： 0064 取含有人源 IgG1 基因的重组 CHO 细胞表达系 （购自广州源生医药科技有限公司） ， 经过无血清悬浮培养， 重组 CHO 细胞系表达人源 IgG1 并分泌到培养上清液中， 表达量为 1.15mg/ml。取未经过滤的培养液 20ml， 与 100mg SL-PA 磁珠混合， 纯化步骤同实施例 1 步 骤 1 7。 0065 结果 ： 从重组 CHO 细胞培养上清液中成功提取 21.62mg 人 IgG1， 纯化得率为 96%， 产物纯度为 94%， 纯化操作耗时 37 分钟。 0066 使用抗体亲和层析法对相同体积相同样品进行纯化操作 （层析系统 ： AKTA purif。

29、er10， 美国GE lifescience公司 ； 蛋白A亲和纯化柱 ： HiTrap MabSelect， 1ml， 美国GE lifesciences 公司） 。培养液样品经离心， 取上清液， 再经过 0.22m 膜过滤一次。过滤后 样品经层析系统纯化， 得人IgG119.75mg， 纯化得率为86%， 产物纯度为95%， 纯化操作耗时3 小时。 0067 两种纯化方法得到的人 IgG1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 图谱见图 5。 0068 实施例 3 0069 从 CHO 细胞混合液中提取利妥昔 （Rituximab） 单抗， 包括以下步骤 ： 0070 取利妥昔单抗 （。

30、购自美国罗氏制药） 20mg， 与 20ml CHO 细胞培养液混合， 得到含有 利妥昔单抗的 CHO 细胞混合液。使用 100mg SL-PA 磁珠从此混合液中提取利妥昔单抗， 步 骤同实施例 1 步骤 1 7。结果， 从混合液中成功提取 19.49mg 利妥昔单抗， 纯化得率为 97.45%， 纯度 95%。 0071 实施例 4 0072 从 CHO 细胞混合液中提取阿达木 （Adalimumab） 单抗， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 103450328 A 7 6/6 页 8 0073 取利妥昔单抗 （购自德国Vetter Pharma-Fertigung GmbHCo.KG）。

31、 20mg， 与20ml CHO细胞培养液混合， 得到含有阿达木单抗的CHO细胞混合液。 使用100mg SL-PA磁珠从此 混合液中提取阿达木单抗， 步骤同实施例1步骤17。 结果， 从混合液中成功提取18.59mg 阿达木单抗， 纯化得率为 93%， 纯度 94%。 0074 实施例 5 0075 从 CHO 细胞混合液中提取英夫利西 （Infliximab） 单抗， 包括以下步骤 ： 0076 取英夫利西单抗 （购自美国强生公司） 20mg， 与 20ml CHO 细胞培养液混合， 得到含 有英夫利西单抗的 CHO 细胞混合液。使用 100mg SL-PA 磁珠从此混合液中提取英夫利西单。

32、 抗， 步骤同实施例 1 步骤 1 7。结果， 从混合液中成功提取 19.02mg 英夫利西单抗， 纯化得 率为 95.1%， 纯度 92%。 0077 实施例 6 0078 从 CHO 细胞混合液中提取西妥昔 （Cetuximab） 单抗， 包括以下步骤 ： 0079 取西妥昔单抗 （购自德国默克里昂制药公司） 20mg， 与 20ml CHO 细胞培养液混合， 得到含有西妥昔单抗的 CHO 细胞混合液。使用 100mg SL-PA 磁珠从此混合液中提取西妥昔 单抗， 步骤同实施例 1 步骤 1 7。结果， 从混合液中成功提取 19.65mg 西妥昔单抗， 纯化得 率为 98.25%， 纯度 97%。 0080 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103450328 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103450328 A 9 2/2 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103450328 A 10 。