巢式一步法RTPCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103074349 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074349 A *CN103074349A* (21)申请号 201210438816.3 (22)申请日 2012.11.07 C12N 15/13(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公 司 地址 310052 浙江省杭州市滨江区春波路 1288 号东冠高新科技园 2 号楼三楼 (72)发明人 张成 药晨江 景书谦 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 林宝堂 (54) 发明名称 巢式一。

2、步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗 体重链和轻链可变区基因全序列的方法 (57) 摘要 本发明涉及基因工程领域， 目的在于提供一 种巢式一步法 RT-PCR 从单个 B 细胞扩增鼠源抗 体重链和轻链可变区基因全序列的方法。本发明 根据 NCBI 和 VBASE 的小鼠免疫球蛋白重链和轻 链的 V 基因序列设计兼并引物， 可以特异性地扩 增得到囊括所有 V 基因种类的 DNA 序列。然后通 过特定的接头 DNA 片段 (Linker 接头 ) 将重链和 轻链的可变区基因序列连接在一起， 再通过巢式 PCR 进行扩增， 并带入酶切位点， 可以克隆到特定 的双向表达载体， 进行真核表达。本发明优。

3、点为 ： 覆盖面广， 灵敏度高， 效率高， 通量大， 步骤简单， 简化劳动， 降低成本， 应用范围广， 结果可靠。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 10 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表10页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103074349 A CN 103074349 A *CN103074349A* 1/1 页 2 1. 一种巢式一步法 RT-PCR 从单个 B 细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列 的方法， 其特征在于 ： 所述的方法步骤如下 ： （1） 寡聚。

4、脱氧核糖核酸引物和接头设计 根据 NCBI 和 VBASE 上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的 V 基因序列设计兼并引 物， 根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类， 重链可变区上游引物命名为 VH1-VH13， 下游引物 命名为 CH1 ； 轻链可变区上游引物命名为 VK1-VK19， 下游引物命名为 CK1 ； 上述上游引物起 始于小鼠重链和轻链可变区 5 末端， 下游引物终止于小鼠重链和轻链的恒定区 ； 重链可变 区上游引物和轻链可变区上游引物的 5 端分别带入 linker 接头， 重链可变区上游引物带 入的 linker 接头和轻链可变区上游引物带入的 linker 接头互补 ； 重链可。

5、变区上游引物和轻链可变区上游引物的 5 端分别带入的 linker 接头序列如 下 ： 重链 linker ： 5 -TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA-3 轻链 linker ： 5 -GGCGCGCAAGCTACGGCCGATGT-3 ； （2） 一步法 RT-PCR 以单个 B cell 为模板通过逆转录酶将重链、 轻链可变区基因的 mRNA 逆转录为 cDNA， 然后以 cDNA 为模板， 重链可变区上游引物 VH1-VH13， 下游引物 CH1 和轻链可变区上游引物 VK1-VK19， 下游引物 CK1 为引物， 扩增出重链、 轻链可变区基因 ； 扩增出重链和轻链可变区。

6、 基因的上游引物带入互补的 Linker 接头， 通过 PCR 产物的退火互搭， 重链和轻链的可变区 基因连接在一起， 形成 VH-linker-VL的 DNA 片段 ； （3） 巢式 PCR 以VH-linker-VL的DNA片段为模板， 采用巢式PCR进行扩增， 扩增得到可以连接到双向 表达载体中的 VH-linker-VL的 PCR 产物。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述linker接头内包含Eag和BssH 的酶切位点。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中巢式 PCR 使用的引物两端 带入了 Sfi1 的酶切位点。 权 。

7、利 要 求 书 CN 103074349 A 2 1/5 页 3 巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链 可变区基因全序列的方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 特别涉及一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠 源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法。 背景技术 0002 单克隆抗体药物具有特异性强、 副作用小等临床优势， 抗体药物直接与靶标结合， 靶向特异性强， 同时， 抗体识别目标的灵敏度很高， 用药量少 ； 再加上抗体药物本身属于蛋 白质， 其在体内代谢与其他内在抗体和蛋白质过程相同， 不会额外对肝肾造成负担， 因而一 般副作用很小， 具有广阔的应用前。

8、景， 目前主要用于肿瘤、 自身免疫等疾病的治疗。 0003 抗体分子的基因结构较复杂， 抗体的轻链 L 由 C、 V 和 J 3 个基因簇编码， 抗体的重 链 H 由 C、 V、 D 和 J 4 个基因簇编码。V 是抗体基因编码可变区， 人的总 VH基因数量约为 100 个， D 基因片段为 10-20 个， JH 基因片段有 9 个 ； 小鼠 VH 的基因片段的数目约为 250-1000 种， D 基因片段有 12 个， JH基因片段有 4 个 ； 抗体轻链分为 和 2 个亚型， 正常人血清免 疫球蛋白 链 ： 链约为 2 ： 1， V 基因的数量约为 100 个 ； 而小鼠 95% 的抗体。

9、轻链是 型， 小鼠 V 基因片段约有 250 个， 这些基因片段通过多种多样的重排， 合成出的肽段再进 一步进行 L 和 H 链组合， 从而生成众多的抗体种类。 0004 目前， 人们已经开发出多种抗体药物筛选的方法， 如杂交瘤融合技术， 噬菌体展示 技术和酵母展示技术等。与传统的杂交瘤融合技术相比， 抗体的体外表达技术具有效率 高， 操作简单， 实验周期短等优点 （Clackson T, Nature, (1991) 352:624-628; Boder E, Nature Biotechnol, (1997) 15:553-557） ， 其逐渐成为功能强大的抗体药物开发工具。 从 单个 B。

10、 细胞中扩增得到抗体基因的 VH和 VL的全序列是其中的关键步骤。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种巢式一步 RT-PCR 从单个 B 细胞中扩增抗体基因重链 可变区 VH和轻链可变区 VL的方法。本发明根据 NCBI 和 VBASE 的小鼠免疫球蛋白重链和轻 链的V基因序列设计兼并引物， 可以特异性地扩增得到囊括所有V基因种类的DNA序列。 然 后通过特定的接头 DNA 片段 (Linker 接头 ) 将重链和轻链的可变区基因序列连接在一起， 再通过巢式 PCR 进行扩增， 并带入酶切位点， 可以克隆到特定的双向表达载体， 进行真核表 达。 0006 本发明解决其技术问题所采用的。

11、技术方案是 ： 一种巢式一步法 RT-PCR 从单个 B 细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的 方法， 所述的方法步骤如下 ： （1） 寡聚脱氧核糖核酸引物和接头设计 根据 NCBI 和 VBASE 上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的 V 基因序列设计兼并引 物， 根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类， 重链可变区上游引物命名为 VH1-VH13（长度为 说 明 书 CN 103074349 A 3 2/5 页 4 41-46bp） ， 下游引物命名为 CH1 ； 轻链可变区上游引物命名为 VK1-VK19（长度为 41-46bp） ， 下游引物命名为 CK1 ； 上述上游引物起始于小鼠。

12、重链和轻链可变区 5 末端， 下游引物终止 于小鼠重链和轻链的恒定区 ； 重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的 5 端分别带 入 linker 接头， 重链可变区上游引物带入的 linker 接头和轻链可变区上游引物带入的 linker 接头互补 ； 重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的 5 端分别带入的 linker 接头序列如 下 ： 重链 linker ： 5 -TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA-3 轻链 linker ： 5 -GGCGCGCAAGCTACGGCCGATGT-3 ； 加粗斜体标注部分为加入的 Eag 和 BssH 的酶切位点， 下划线所示为重链 。

13、linker 与轻链 linker 的互补区。 0007 （2） 一步法 RT-PCR 以单个 B cell 为模板通过逆转录酶将重链、 轻链可变区基因的 mRNA 逆转录为 cDNA， 然后以 cDNA 为模板， 重链可变区上游引物 VH1-VH13， 下游引物 CH1 和轻链可变区上游引物 VK1-VK19， 下游引物 CK1 为引物， 扩增出重链、 轻链可变区基因 ； 扩增出重链和轻链可变区 基因的上游引物带入互补的 Linker 接头， 通过 PCR 产物的退火互搭， 重链和轻链的可变区 基因连接在一起， 形成 VH-linker-VL的 DNA 片段。 0008 （3） 巢式 PCR。

14、 以VH-linker-VL的DNA片段为模板， 采用巢式PCR进行扩增， 扩增得到可以连接到双向 表达载体中的 VH-linker-VL的 PCR 产物。 0009 重链可变区上游引物及下游引物的序列如下 ： 轻链可变区上游引物及下游引物的序列如下 ： 说 明 书 CN 103074349 A 4 3/5 页 5 上述序列中 ： M=A/C， R=A/G， W=A/T ， S=G/C， Y=C/T， K=G/T， V=A/G/C， H=A/C/T， D=A/G/ T， B=G/C/T， N=A/G/C/T。 “/” 代表和的关系。M、 R、 W、 S、 Y、 K、 V、 H、 D、 B、 N。

15、 都是行业内标 准的兼并碱基的代码。以 M 为例， M 中 A、 C 各占 50%， R、 W、 S、 Y、 K 同理， 以 V 为例， V 中 A、 G、 C 各占三分之一， H、 D、 B 同理， N 中则 A、 G、 C、 T 各占四分之一。 0010 作为优选， 所述 linker 接头内包含 Eag 和 BssH 的酶切位点。通过 linker 上 带入的 Eag 和 BssH 的酶切位点， 可以将真核细胞的启动子 P1 和 P2 带入到重链和轻链 基因的起始端， 进行抗体的真核表达。 0011 作为优选， 步骤 （3） 中巢式 PCR 使用的引物两端带入了 Sfi1 的酶切位点。通。

16、过此 酶切位点， 扩增得到的 PCR 产物可以连接到双向表达载体。 0012 巢式 PCR 使用的引物包括重链可变区引物及轻链可变区引物， 重链可变区引物 CH2 序列为 ： CH2a ： aggccgggtgggccGGATAGACMGATGGGGCTG（SEQ ID NO.17） CH2b ： aggccgggtgggccGGATAGACWGATGGGGGTG（SEQ ID NO.18） 。 0013 轻链可变区引物 CK2 序列为 ： CK2 ： acggccacataggccCCACTTGACATTGATGTC（SEQ ID NO.40） 。 0014 本发明的引物中 ： VH1、 C。

17、H1、 CH2、 CK1 均为兼并引物。以 CH2 为例， CH2 包括 CH2a ： aggccgggtgggccGGATAGACMGATGGGGCTG、 CH2b ： aggccgggtgggccGGATAGACWGATGGGGGTG 两部分， CH2a、 CH2b 可以各占 50% 组成 CH2。VH1（VH1a+VH1b 各 50% 组成） 、 CH1（CH1a+CH1b 各 50% 组成） 、 CK1(CK1a+CK1b 各 50% 组成 ) 的构成也同理可知。 0015 本发明的有益效果是 ： 1、 覆盖面广。扩增小鼠重链和轻链可变区 DNA 序列的引物根据 NCBI 和 VBAS。

18、E 上已报 说 明 书 CN 103074349 A 5 4/5 页 6 道的 V 基因序列设计， 覆盖面包括了全部已知的 VH 基因片段的 15 个家族和 VL 基因片段的 15 个家族。 0016 2、 灵敏度高。本方法经过第一步的 RT-PCR 和第二步的巢式 PCR 的 2 轮反应， 可以 扩增出少至单个 B 细胞中的抗体基因片段。 0017 3、 效率高， 通量大。 与传统的杂交瘤细胞的抗体筛选方法相比， 本方法大幅提高了 抗体筛选的效率和通量。 0018 4、 步骤简单， 简化劳动， 降低成本。通过本方法直接获得 VH和 VL的基因进行体外 表达， 从而进行抗体药物的筛选。避免了杂。

19、交瘤融合技术的繁琐操作和培养细胞所需要的 时间， 节省了大量的财力和时间。 0019 5、 应用范围广。本方法可以应用于任何鼠源抗体进行筛选。 0020 6、 结果可靠。使用巢式 PCR， 用内侧引物进行特异性的扩增， 提高了 PCR 的准确性 和可靠性。对 PCR 产物进行测序， 扩增 V 区的准备率达到 100%。 0021 附图说明 图 1 是本发明的流程图 ： CH ： 重链恒定区 ； CL ： 轻链恒定区 VH ： 重链可变区 VL ： 轻链可变区 ； P1-P2 ： 真核细胞启动子 (a) 以单个 B 细胞 mRNA 为模板， 通过特异性引物扩增得到抗体重链和轻链可变区基 因， 5。

20、 引物起始端带入 linker， 重链和轻链引物的 linker 互补。 0022 (b) 重链和轻链可变区的PCR产物可以通过linker的退火互搭连接在一起， 生成 VH-linker-VL的 DNA 片段。再通过第二轮的巢式引物进行特异性的扩增， 第二轮的巢式引 物两端带入了 Sfi1 的酶切位点， 通过此酶切位点， 扩增得到的 PCR 产物可以连接到双向表 达载体。 0023 (c) Linker 上带入 Eag 和 BssH 的酶切位点， 可以将真核细胞的启动子 P1 和 P2 带入到重链和轻链基因的起始端， 进行抗体的真核表达。 0024 图 2 以单个 B 淋巴细胞作为模板经本发。

21、明扩增出重链 - 轻链可变区序列的结果。 0025 图 3 是 PCR 扩增目的片段的验证结果。 具体实施方式 0026 下面通过具体实施例， 并结合附图， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 0027 本发明中， 若非特指， 所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法， 如无特别说明， 均为本领域的常规方法。 0028 实施例 ： （1） B 淋巴细胞的分离 1.1 应用免疫磁珠分离 CD19+ B 淋巴细胞 无菌取小鼠脾脏， 研磨分散成单个细胞， 40m 过滤器除去大块组织， 用 5% FBS-PBS 重悬细胞， 2000rpm 离心 3min， 去除上清。

22、。用 1lysis buffer（0.15M NH4Cl） 10ml 重悬 细胞， 室温静置 15min 后 2000rpm 离心 3min， 去除上清， 用 5% FBS-PBS 重悬细胞， 2000rpm 离心 3min， 去除上清。用 5% FBS-PBS 调节细胞浓度为 2107 个 /ml， 加入 150l CD19+ microbeads， 4孵育 15min 后， 加入 10ml 5% FBS-PBS 终止反应， 2000rpm 离心 3min， 去除 说 明 书 CN 103074349 A 6 5/5 页 7 上清之后用10ml 5% FBS-PBS 洗涤一次。 用1ml 5。

23、% FBS-PBS重悬细胞， 将试管放置于磁架 上， 用 1.5ml buffer 洗脱 3 次。最后撤离磁场， 用 1.4ml buffer 洗脱并收集 CD19+ B 淋巴 细胞。 0029 1.2 将 B cell 分到 Reaction buffer 中 将分离出的 B cells 用生理盐水洗涤 2 遍， 之后悬浮于生理盐水中， 调整至浓度为 1104 cells/ml， 取 1l 加到 10l Reaction buffer 中， 即每个 PCR 管中 B cell 数目 为 10 个。细胞分到 10l Reaction buffer 后， 立即冻于 -80 冰箱中， 用于后续 P。

24、CR 实验。10l Reaction buffer 配方为 ： 5Improm buffer 4l、 dNTP（10mM） 1l、 MgCl2（25mM） 2l、 RNasin（40U/ul） 0.4l、 RNase free H2O 2.6l， 其中 5Improm buffer、 MgCl2（25mM） 、 RNasin（40U/l） 购买于 promega 公司， dNTP（10mM） 、 RNase free H2O 购买于 Takara 公司。 0030 （2） 一步法 RT-PCR 以单个 B cell 为模板进行一步法 RT-PCR。第一步 PCR 为 RT-PCR， 即反转录 。

25、PCR 在同 一 PCR 管中进行， 通过逆转录酶将重、 轻链可变区基因的 mRNA 逆转录为 cDNA， 然后以 cDNA 为模板扩增出重、 轻链可变区基因。 0031 从 -80 冰箱中取出分好的 B cell， 加入引物、 Improm RTase、 EX Taq、 EX Taq Ab 后进行第一步 RT-PCR。 0032 PCR 具体条件如下 ： 第一步 PCR ： 重链 V 区 VH1-VH13 共 13 条上游引物 （其中 VH1 由 VH1a+VH1b 各 50% 组 成） 、 轻链 V 区 VK1-VK19 共 19 条上游引物、 重链 V 区下游引物 CH1（CH1a+CH。

26、1b 各 50% 组 成） 、 轻链 V 区下游引物 CK1 的浓度均为 10nm。RT 引物为 Random hexamer， 浓度为 200nm， 反应体系为 20l， 模板为分到 PCR 管中的单个 B cell。PCR 的反应条件如下 ： 25 5min， 50 60min， 95 15min ； 95 30s， 56 30s， 72 40s （一共 15 个 cycles） ； 72 7min。 0033 （3） 巢式 PCR 巢氏引物 CH2（CH2a+CH2b 各 50% 组成） +CK2， 每条浓度为 0.2m。模板为第一步 PCR 产物 1l， 反应体系为 25。PCR 的反。

27、应条件如下 ： 95 5min ； 95 30s， 56 30s， 72 90s （一共 40 个 cycles） ； 72 7min。扩增产物经 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定， 回收后进 行克隆和序列测定。共挑取 5 个克隆进行测序， 测序结果如图 3 所示， 所得的 PCR 产物均来 自于小鼠抗体重链和轻链可变区基因序列。 0034 单个 B 细胞为模板， 经本发明扩增出的重链 - 轻链可变区序列的电泳图谱见图 2， 其中 NC 为阴性对照。 0035 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上 的限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体。

28、及改型。 说 明 书 CN 103074349 A 7 1/10 页 8 SEQUENCE LISTING 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司 巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列 的方法 201210 40 PatentIn version 3.3 1 46 DNA 人工序列 1 tcggccgtag cttgcgcgcc tccasaggty caactgcagc agcctg 46 2 46 DNA 人工序列 2 tcggccgtag cttgcgcgcc tccasaggty cagctgcaac agtctg 46 3 46 DNA 人工序列 3 t。

29、cggccgtag cttgcgcgcc tccacaggtg cagctgaags agtcag 46 序 列 表 CN 103074349 A 8 2/10 页 9 4 46 DNA 人工序列 4 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaggtg aagctggtgg artctg 46 5 46 DNA 人工序列 5 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaagtg magctggtgg agtctg 46 6 46 DNA 人工序列 6 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaagtg aagcttgagg agtctg 46 7 47 。

30、DNA 人工序列 7 tcggccgtag cttgcgcgcc tccatctgat gtgcagcttc aggagtc 47 8 序 列 表 CN 103074349 A 9 3/10 页 10 46 DNA 人工序列 8 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaggtt cagctgcagc agtctg 46 9 46 DNA 人工序列 9 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaggtg aagcttctcg agtctg 46 10 46 DNA 人工序列 10 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaagtg cagctgttgg。

31、 agactg 46 11 46 DNA 人工序列 11 tcggccgtag cttgcgcgcc tccagaggtg cagcttgttg agtctg 46 12 46 DNA 人工序列 序 列 表 CN 103074349 A 10 4/10 页 11 12 tcggccgtag cttgcgcgcc tccacagatc cagttggtgc agtctg 46 13 46 DNA 人工序列 13 tcggccgtag cttgcgcgcc tccatctcag atgcagcttc aggagt 46 14 46 DNA 人工序列 14 tcggccgtag cttgcgcgcc。

32、 tccacaggtt actctgaaag agtctg 46 15 19 DNA 人工序列 15 caggggccag tggatagac 19 16 19 DNA 人工序列 16 cagggaccaa gggatagac 19 序 列 表 CN 103074349 A 11 5/10 页 12 17 33 DNA 人工序列 17 aggccgggtg ggccggatag acmgatgggg ctg 33 18 33 DNA 人工序列 18 aggccgggtg ggccggatag acwgatgggg gtg 33 19 42 DNA 人工序列 19 ggcgcgcaag ctac。

33、ggccga tgttgatgac ccaractcca ct 42 20 44 DNA 人工序列 20 ggcgcgcaag ctacggccga tgtsrgatat tgtgatgacg cagg 44 21 序 列 表 CN 103074349 A 12 6/10 页 13 43 DNA 人工序列 21 ggcgcgcaag ctacggccga tgtattgtgc tgacccaatc tcc 43 22 43 DNA 人工序列 22 ggcgcgcaag ctacggccga tgtawtgtkc tcacccagtc tcc 43 23 41 DNA 人工序列 23 ggcgc。

34、gcaag ctacggccga tgtgtctcca gccaccctgt c 41 24 44 DNA 人工序列 24 ggcgcgcaag ctacggccga tgttgatgac ccagtctcmc aaat 44 25 43 DNA 人工序列 序 列 表 CN 103074349 A 13 7/10 页 14 25 ggcgcgcaag ctacggccga tgtgcctgtg cagacattgt gat 43 26 43 DNA 人工序列 26 ggcgcgcaag ctacggccga tgtcctgtgg ggacattgtg atg 43 27 43 DNA 人工序列。

35、 27 ggcgcgcaag ctacggccga tgtacatccr gatgacycag tct 43 28 43 DNA 人工序列 28 ggcgcgcaag ctacggccga tgtccagatg tgatatccag atg 43 29 44 DNA 人工序列 29 ggcgcgcaag ctacggccga tgtgccagat gtgatgtyca aatg 44 序 列 表 CN 103074349 A 14 8/10 页 15 30 43 DNA 人工序列 30 ggcgcgcaag ctacggccga tgtatccaga tgactcagtc tcc 43 31 。

36、44 DNA 人工序列 31 ggcgcgcaag ctacggccga tgtcctgata tgtgacatcc rvat 44 32 43 DNA 人工序列 32 ggcgcgcaag ctacggccga tgtmagatga cccagtctcc atc 43 33 44 DNA 人工序列 33 ggcgcgcaag ctacggccga tgttgagatg tgacatccag atga 44 34 序 列 表 CN 103074349 A 15 9/10 页 16 44 DNA 人工序列 34 ggcgcgcaag ctacggccga tgtccagtgt gatgtccag。

37、a taac 44 35 43 DNA 人工序列 35 ggcgcgcaag ctacggccga tgtacaactg tgacccagtc tcc 43 36 43 DNA 人工序列 36 ggcgcgcaag ctacggccga tgtacacagg ctccagcttc tct 43 37 43 DNA 人工序列 37 ggcgcgcaag ctacggccga tgtgtgctca gtgtgacatc cag 43 38 21 DNA 人工序列 序 列 表 CN 103074349 A 16 10/10 页 17 38 ttaacactct cccctgttga a 21 39 21 DNA 人工序列 39 ttaacactca ttcctgttga a 21 40 33 DNA 人工序列 40 acggccacat aggccccact tgacattgat gtc 33 序 列 表 CN 103074349 A 17 1/2 页 18 图 1 说 明 书 附 图 CN 103074349 A 18 2/2 页 19 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103074349 A 19 。