GLP1类似物的反相HPLC纯化.pdf

摘要
申请专利号：	CN201180029074.2	申请日：	2011.06.17
公开号：	CN103080128A	公开日：	2013.05.01
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/605申请日:20110617\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/605	主分类号：	C07K14/605
申请人：	益普生制药股份有限公司
发明人：	C·卡尔; M·罗特; C·萨拉丁; D·斯特鲁布; F·维克斯
地址：	法国布洛涅-比扬古
优先权：	2010.06.21 EP 10166602.2
专利代理机构：	北京市中咨律师事务所 11247	代理人：	柴云峰;黄革生
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内容摘要

本发明包括应用反相高效液相层析（RP-HPLC）来纯化GLP-1肽类似物的方法。

权利要求书

权利要求书应用反向高效液相层析(RP‑HPLC)纯化GLP‑1肽类似物的方法，所述方法包括用水性缓冲液和有机溶剂的混合物进行洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且使用pH在8.0至11.0之间的碱性缓冲液进行第二步层析。
权利要求1的方法，其特征在于乙腈还与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。
权利要求2的方法，其特征在于使用99/1(v/v)至80/20(v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚的混合物。
权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述碱性缓冲液选自乙酸铵或碳酸氢铵。
权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于以10mMol至25mMol的浓度使用所述碱性缓冲液。
权利要求1的方法，其特征在于第一个层析步骤的水性有机溶剂为乙腈并且使用pH在1.0至4.0之间的酸性缓冲液进行第一步层析。
权利要求6的方法，其特征在于所述酸性缓冲液为磷酸铵。
权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于使用硅胶吸着剂作为固定相进行所述RP‑HPLC。
权利要求1至8中任一项的方法，其中所述GLP‑1肽类似物选自由GLP‑1(7‑37)、GLP‑1(7‑36)NH2、(Gly8)GLP‑l(7‑37)、(Gly8)GLP‑1(7‑36)、(Ser34)GLP‑l(7‑37)、(Val8)GLP‑l(7‑37)、(Val8,Glu22)GLP‑1(7‑37)、(Aib8,35)hGLP‑1(7‑36)NH2.、(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑十六酰基)))‑Lys26Arg34‑GLP‑1(7‑37)、D‑Ala Lys‑(2‑(2‑(2‑马来酰亚胺基丙酰氨基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP‑1(7‑37)、exendin‑3、exendin‑4、exendin‑4酸、exendin‑4(1‑30)、exendin‑4(1‑30)酰胺、exendin‑4(1‑28)、exendin‑4(1‑28)酰胺、14Leu,25Phe exendin‑4酰胺和14Leu,25Phe exendin‑4(1‑28)酰胺和AVE‑0010。
权利要求1至9中任一项的方法，其中所述GLP‑1肽类似物为(Aib8,35)hGLP‑1(7‑36)NH2。
用权利要求1至10的方法可以获得的GLP‑1肽类似物。

说明书

说明书GLP‑1类似物的反相HPLC纯化
发明领域
本发明涉及人胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)类似物的纯化，特别涉及用于纯化具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的GLP‑1类似物的方法：His‑Aib‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Aib‑Arg‑NH2,
其中，这些氨基酸中的26个氨基酸是天然L构型，而4个氨基酸是非手性构型。Aib表示通过反相高效液相层析(RP‑HPLC)纯化的人胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)的α‑氨基异丁酸类似物。
该肽也称为(Aib8,35)GLP‑l(7‑36)NH2，并在PCT公布WO 2000/34331中描述了其药物用途及其通过固相肽合成(SPPS)的制备。
发明背景
可遵循这样的混合方法合成GLP‑1类似物，所述混合方法包括固相肽合成(SPPS)和溶液中的片段偶联。例如，PCT公布WO 2007/147816描述了通过制备三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2。
各合成步骤一般是高选择性的，然而，在多步化学合成结束时，产物通常不纯，不足以用作药物。因此，粗产品可以经过反向高效液相层析(RP‑HPLC)来进一步纯化肽并获得96至99%(面积)范围内的纯度。经RP‑HPLC阶段后，通常获得一般具有1到15%(w/w)肽浓度的溶液形式的产物。
为了获得适合于药物制剂的干燥终产物，溶液可以进行沉淀、冻干或喷雾干燥技术。
已在本领域广泛描述了用于人胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)的RP‑HPLC纯化。
例如根据PCT公布WO 2007/147816，GLP‑1类似物进行了两步RP‑HPLC方法；
在pH 2下进行第一步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和少量TFA组成的混合物A和由四氢呋喃(15%)、乙腈(70%)、水(15%)和少量TFA组成的混合物B作为流动相，并且
在pH 8.8下进行第二步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物A，和由含四氢呋喃(15%)、乙腈(60%)、水(25%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物B作为流动相。
由于四氢呋喃倾向于形成过氧化物，因此在大规模上洗脱液对于RP‑HPLC是至关重要的。
EP‑B1 1664 109公开了利用pH缓冲的醇，特别是乙醇作为洗脱剂来纯化胰高血糖素样肽的RP‑HPLC方法，由此pH值范围可以设定在pH 4和pH 10之间，但不能与pH设定点差别超过+/‑1.0pH单位。
为了获得所需纯度，因此本方法需要严格的pH控制。
然而，发现以乙醇作为洗脱剂时，无法获得想要的纯度，特别是无法有效去除杂质des‑Ser17,Ser18‑[Aib8,35]hGLP‑l(7‑36)NH2。
因此，本发明的目标在于开发RP‑HPLC方法，其在技术规模上易于应用，并且在溶剂方面安全并能够提供具有极好纯度的GLP‑1溶液。
发明详述
发现利用如下文概述的本发明的方法能够实现该目标。
应用反向高效液相层析(RP‑HPLC)纯化GLP‑1肽类似物的方法包括以水性缓冲液和有机溶剂的混合物用于洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且用pH值在8.0至11.0之间的碱性缓冲液进行第二步层析。
水性缓冲液为含防止pH变化的缓冲剂的水溶液。根据所用的缓冲剂，该缓冲液可以是酸性的或碱性的。
术语“GLP‑1肽类似物”包含天然人胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)类似物GLP‑1(7‑37)和GLP‑1(7‑36)NH2和GLP‑1肽的合成类似物（GLP‑1类似物）。
优选的GLP‑1类似物为具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列的人GLP‑1类似物：
His‑Aib‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Aib‑Arg‑NH2,
即(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2，和如PCT公布WO 2000/34331中描述的其它类似物。特别感兴趣的是(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2。短的形式指通过缺失1至6位氨基酸残基、在C末端酰胺化并由α‑氨基异丁酸(Aib)取代第8位(Ala)和第35位(Gly)中天然存在的氨基酸残基而在形式上来源于天然人GLP‑1(1‑37)的类似物。
GLP‑1肽的合适的类似物还可以选自GLP‑1(7‑37)、GLP‑1(7‑36)NH2、(Gly8)GLP‑1(7‑37)、(Gly8)GLP‑1(7‑36)、(Ser34)GLP‑l(7‑37)、(Val8)GLP‑l(7‑37)、(Val8,Glu22)GLP‑1(7‑37)、(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑十六酰基)))‑Lys26Arg34‑GLP‑l(7‑37)(Liraglutide)和D‑Ala8Lys37‑(2‑(2‑(2‑马来酰亚胺基丙酰氨基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP‑1(7‑37)(CJC‑1131)。
GLP‑1肽的又一类似物可以是选自以下的exendin类似物：exendin‑3、具有根据SEQ ID No.2：
His‑Gly‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Leu‑Ser‑Lys‑Gln‑Met‑Glu‑Glu‑Glu‑Ala‑Val‑Arg‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu‑Trp‑Leu‑Lys‑Asn‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser‑Ser‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser‑NH2的氨基酸序列的exendin‑4(依泽那太)
exendin‑4酸、exendin‑4(1‑30)、exendin‑4(1‑30)酰胺、exendin‑4(1‑28)、exendin‑4(1‑28)酰胺、14Leu,25Phe exendin‑4酰胺和14Leu,25Pheexendin‑4(1‑28)酰胺以及AVE‑0010，其为具有根据SEQ ID No.3的氨基酸序列的exendin类似物：
His‑Gly‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Leu‑Ser‑Lys‑Gln‑Met‑Glu‑Glu‑Glu‑Ala‑Val‑Arg‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu‑Trp‑Leu‑Lys‑Asn‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser‑Ser‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Lys‑Lys‑Lys‑Lys‑Lys‑Lys‑NH2。
附图
图1a：(Aib8,35)GLP‑l(7‑36)NH2的第二步层析的RP‑HPLC层析图；20mM乙酸铵，pH=9.2；Kromasil C18 100‑16；乙醇(100%)。
图1b：(Aib8,35)GLP‑l(7‑36)NH2的第二步层析的RP‑HPLC层析图；20mM乙酸铵，pH=9.5；Kromasil C18 100‑16；乙腈(100%)。
与图1a）相比，用乙腈作为洗脱剂有效地去除了杂质des‑Ser17，Ser18‑[Aib8,35]hGLP‑l(7‑36)NH2。
图2a：(Aib8,35)GLP‑l(7‑36)NH2的第二步层析的RP‑HPLC层析图；20mM乙酸铵，pH=9.5；Kromasil C18 100‑16；乙腈(100%)。
图2b：(Aib8,35)GLP‑l(7‑36)NH2的第二步层析的RP‑HPLC层析图；20mM乙酸铵，pH=9.5；Kromasil C18 100‑16；乙腈/甲基叔丁基醚(95:5 v:v)。使用甲基叔丁基醚作为有机改性剂可增加纯度和产率。
本发明的具体实施方案如下概述。
如上概述，用乙腈作为有机溶剂并使用pH在8.0至11.0之间，更特别pH在9.0至10.0之间并且甚至更特别pH为9.5+/‑0.2的碱性缓冲液进行第二个层析步骤。
在本发明的具体实施方案中，将乙腈与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。
合适地应用99/1(v/v)至80/20(v/v)，特别为97.5/2.5(v/v)至90/10(v/v)，甚至更特别为95/5(v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚混合物。
碱性缓冲液可选自本领域技术人员公知的商品化缓冲液。发现乙酸铵或碳酸氢铵尤其合适。
缓冲液浓度可在10至25mM范围内变化，由此优选20mM的缓冲液浓度。
用乙腈作为有机溶剂和pH在1.0至4.0之间，更特别pH在2.0至3.0之间并且甚至更特别pH在2.3至2.5之间，最特别pH为2.5的酸性缓冲液进行第一个层析步骤。
酸性缓冲液可选自本领域技术人员公知的商品化缓冲液。发现磷酸铵尤其合适。缓冲液浓度可在100至400mM范围内变化，由此优选300mM的缓冲液浓度。
使用硅胶吸着剂作为固定相方便地进行RP‑HPLC。
合适的硅胶类型可选自但不限于以下硅胶吸着剂：KromasilTMC18100–16、KromasilTMC18 100–10、KromasilTMC8 100–16、KromasilTMC4 100–16、KromasilTM Phenyl 100–10、KromasilTM C18Eternity 100–5、KromasilTM C4 Eternity 100–5、ChromatorexTM C18SMB 100‑15 HE、ChromatorexTM C8 SMB 100‑15 HE、ChromatorexTMC4 SMB 100‑15 HE、DaisopakTM SP 120‑15 ODS‑AP、DaisopakTM SP120‑10‑C4‑Bio、DaisopakTM SP 200‑10‑C4‑Bio、ZeosphereTM C18100‑15、ZeosphereTM C8 100‑15、ZeosphereTM C4 100‑15、SepTech ST150‑10 C18、Luna C18 100‑10、Gemini C18 110‑10、YMC Triart C18120‑5和YMC Triart C8 200‑10。
发现上文列出的KromasilTM硅胶类型尤其合适。
或者，可使用基于聚合物的固定相进行RP‑HPLC。合适的聚合物相可选自但不限于PLRP‑S 100‑10或AmberchromTM Profile XT20。
用流动相梯度进行第一个和第二个层析步骤的RP‑HPLC，所述流动相梯度通常开始于较低浓度的有机溶剂并经洗脱时间后结束于较高浓度的有机溶剂。洗脱参数如事件时间、流动相梯度和上样方面可由本领域技术人员更改，以优化纯化过程。
如PCT公布WO 2007/147816所描述，任选地将含纯化的(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的级分浓缩并随后冻干。或者，可通过本领域技术人员公知的沉淀或喷雾干燥技术从RP‑HPLC级分中分离纯化的(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2。
以下实施例将更详细地说明本发明的方法而不限制其范围。
实施例
实施例A：
肽的制备
可以根据WO 2007/147816和WO 2009/074483中描述的方法，通过产生三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备粗肽(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2。
纯化包括在pH 2.5的第一步层析纯化，及随后在pH 9.5的第二步层析纯化。
实施例B1：
RP‑HPLC技术参数：

第一个层析步骤：
在水/乙腈/乙酸(90/9/1 v/v/v)中溶解粗(Aib8'35)GLP‑1(7‑36)NH2并装载到HPLC柱中（装载高达20g/L，床深约为25cm）并开始纯化程序。收集级分并且可用水或稀释的氢氧化铵溶液稀释。
表1
第一个层析步骤的参数和纯化程序：

可改变A和C的比例以获得主峰（肽(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2）的最小保留。可改变事件时间、梯度和装载方面以优化纯化过程。通过第二步层析的条件进一步纯化混合级分。
第二个层析步骤：
将来自(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的第一步层析的混合的稀释级分装载到HPLC柱上，并开始表2中的纯化程序（见4.6mm柱的实例）。
表2
第二个层析步骤的参数和纯化程序：

主要级分中(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的计算纯度为97.0%。计算产率为87%（见图1b、2a）。
实施例B2：
除了在第二个层析步骤中使用碳酸氢铵缓冲液(20mM(pH 9.5+/‑0.2)之外，重复实施例B1的步骤。
主要级分中(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的计算纯度为97.2%。计算产率为93%。
实施例B3：
除了在第二个层析步骤中用乙腈/甲基叔丁基醚95:5的混合物代替乙腈之外，重复实施例B1的步骤。
主要级分中(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的计算纯度为97.4%。计算产率为98%（见图2b）。
实施例B4：
按以下参数重复实施例B1的步骤。

主要级分中(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的计算纯度为97.1%。计算产率为99%。
实施例B5（比较）：
除了在第二个层析步骤中用乙醇代替乙腈之外，重复实施例B1的步骤。
主要级分中(Aib8,35)GLP‑1(7‑36)NH2的计算纯度为96.7%。计算产率为86%。主要级分含杂质des‑Ser17,Ser18‑[Aib8,35]hGLP‑l(7‑36)NH2（见图1a）。

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1、(10)申请公布号 CN 103080128 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103080128 A *CN103080128A* (21)申请号 201180029074.2 (22)申请日 2011.06.17 10166602.2 2010.06.21 EP C07K 14/605(2006.01) (71)申请人益普生制药股份有限公司地址法国布洛涅 - 比扬古 (72)发明人 C卡尔 M罗特 C萨拉丁 D斯特鲁布 F维克斯 (74)专利代理机构北京市中咨律师事务所 11247 代理人柴云峰黄革生 (54) 发明名称 GLP-1 类似物的反相 HPLC 纯。

2、化 (57) 摘要本发明包括应用反相高效液相层析（RP-HPLC）来纯化 GLP-1 肽类似物的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.12.13 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/060074 2011.06.17 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/161007 EN 2011.12.29 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 7 页序列表 2 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页附图2页 (10)申请。

3、公布号 CN 103080128 A CN 103080128 A *CN103080128A* 1/1 页 2 1. 应用反向高效液相层析 (RP-HPLC) 纯化 GLP-1 肽类似物的方法，所述方法包括用水性缓冲液和有机溶剂的混合物进行洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且使用 pH 在 8.0 至 11.0 之间的碱性缓冲液进行第二步层析。 2. 权利要求 1 的方法，其特征在于乙腈还与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。 3.权利要求2的方法，其特征在于使用99/1(v/v)至80/20(v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚的混合物。 4.。

4、权利要求 1 至 3 中任一项的方法，其特征在于所述碱性缓冲液选自乙酸铵或碳酸氢铵。 5. 权利要求 1 至 4 中任一项的方法，其特征在于以 10mMol 至 25mMol 的浓度使用所述碱性缓冲液。 6.权利要求1的方法，其特征在于第一个层析步骤的水性有机溶剂为乙腈并且使用pH 在 1.0 至 4.0 之间的酸性缓冲液进行第一步层析。 7. 权利要求 6 的方法，其特征在于所述酸性缓冲液为磷酸铵。 8. 权利要求 1 至 7 中任一项的方法，其特征在于使用硅胶吸着剂作为固定相进行所述 RP-HPLC。 9. 权利要求 1 至 8 中任一项的方法，其中所。

5、述 GLP-1 肽类似物选自由 GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2、(Gly8)GLP-l(7-37)、(Gly8)GLP-1(7-36)、(Ser34) GLP-l(7-37)、 (Val8)GLP-l(7-37)、 (Val8,Glu22)GLP-1(7-37)、 (Aib8,35)hGLP-1(7-36)NH2.、 (N-(-Glu(N- 十六酰基 )-Lys26Arg34-GLP-1(7-37)、 D-Ala Lys-(2-(2-(2- 马来酰亚胺基丙酰氨基 ( 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙酰胺 )GLP-1(7-37)。

6、、 exendin-3、 exendin-4、 exendin-4 酸、 exendin-4(1-30)、 exendin-4(1-30) 酰胺、 exendin-4(1-28)、 exendin-4(1-28) 酰胺、 14Leu,25Phe exendin-4 酰胺和14Leu,25Phe exendin-4(1-28) 酰胺和 AVE-0010。 10. 权利要求 1 至 9 中任一项的方法，其中所述 GLP-1 肽类似物为 (Aib8,35) hGLP-1(7-36)NH2。 11. 用权利要求 1 至 10 的方法可以获得的 GLP-1 肽类似物。。

7、权利要求书 CN 103080128 A 2 1/7 页 3 GLP-1 类似物的反相 HPLC 纯化发明领域 0001 本发明涉及人胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 类似物的纯化，特别涉及用于纯化具有 SEQ ID No.1 的氨基酸序列的 GLP-1 类似物的方法： His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-A sp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg-NH2, 0002 其中，这些氨基酸中的 26 个氨基酸是天然。

8、L 构型，而 4 个氨基酸是非手性构型。 Aib 表示通过反相高效液相层析 (RP-HPLC) 纯化的人胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 的 - 氨基异丁酸类似物。 0003 该肽也称为(Aib8,35)GLP-l(7-36)NH2，并在PCT公布WO 2000/34331中描述了其药物用途及其通过固相肽合成 (SPPS) 的制备。 0004 发明背景 0005 可遵循这样的混合方法合成 GLP-1 类似物，所述混合方法包括固相肽合成 (SPPS) 和溶液中的片段偶联。例如， PCT 公布 WO 2007/147816 描述了通过制备三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备 (Aib。

9、8,35)GLP-1(7-36)NH2。 0006 各合成步骤一般是高选择性的，然而，在多步化学合成结束时，产物通常不纯，不足以用作药物。因此，粗产品可以经过反向高效液相层析 (RP-HPLC) 来进一步纯化肽并获得 96 至 99%( 面积 ) 范围内的纯度。经 RP-HPLC 阶段后，通常获得一般具有 1 到 15%(w/w) 肽浓度的溶液形式的产物。 0007 为了获得适合于药物制剂的干燥终产物，溶液可以进行沉淀、冻干或喷雾干燥技术。 0008 已在本领域广泛描述了用于人胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 的 RP-HPLC 纯化。 0009 例如根据 PCT 公布。

10、 WO 2007/147816， GLP-1 类似物进行了两步 RP-HPLC 方法； 0010 在pH 2下进行第一步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和少量TFA组成的混合物 A 和由四氢呋喃 (15%)、乙腈 (70%)、水 (15%) 和少量 TFA 组成的混合物 B 作为流动相，并且 0011 在pH 8.8下进行第二步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物 A，和由含四氢呋喃 (15%)、乙腈 (60%)、水 (25%) 和乙酸铵缓冲液组成的混合物 B 作为流动相。 0012 由于四氢呋喃倾向于形成过氧化物，因此在。

11、大规模上洗脱液对于 RP-HPLC 是至关重要的。 0013 EP-B1 1664 109 公开了利用 pH 缓冲的醇，特别是乙醇作为洗脱剂来纯化胰高血糖素样肽的 RP-HPLC 方法，由此 pH 值范围可以设定在 pH 4 和 pH 10 之间，但不能与 pH 设定点差别超过 +/-1.0pH 单位。 0014 为了获得所需纯度，因此本方法需要严格的 pH 控制。 0015 然而，发现以乙醇作为洗脱剂时，无法获得想要的纯度，特别是无法有效去除杂质 des-Ser17,Ser18-Aib8,35hGLP-l(7-36)NH2。说明书 CN 103080128 A 3 。

12、2/7 页 4 0016 因此，本发明的目标在于开发 RP-HPLC 方法，其在技术规模上易于应用，并且在溶剂方面安全并能够提供具有极好纯度的 GLP-1 溶液。 0017 发明详述 0018 发现利用如下文概述的本发明的方法能够实现该目标。 0019 应用反向高效液相层析(RP-HPLC)纯化GLP-1肽类似物的方法包括以水性缓冲液和有机溶剂的混合物用于洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且用 pH 值在 8.0 至 11.0 之间的碱性缓冲液进行第二步层析。 0020 水性缓冲液为含防止 pH 变化的缓冲剂的水溶液。根据所用的缓冲剂，。

13、该缓冲液可以是酸性的或碱性的。 0021 术语 “GLP-1 肽类似物”包含天然人胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 类似物 GLP-1(7-37) 和 GLP-1(7-36)NH2和 GLP-1 肽的合成类似物（GLP-1 类似物）。 0022 优选的 GLP-1 类似物为具有根据 SEQ ID No.1 的氨基酸序列的人 GLP-1 类似物： 0023 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A la-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Tr。

14、p-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2, 0024 即 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2，和如 PCT 公布 WO 2000/34331 中描述的其它类似物。特别感兴趣的是 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2。短的形式指通过缺失 1 至 6 位氨基酸残基、在 C 末端酰胺化并由 - 氨基异丁酸 (Aib) 取代第 8 位 (Ala) 和第 35 位 (Gly) 中天然存在的氨基酸残基而在形式上来源于天然人 GLP-1(1-37) 的类似物。 0025 GLP-1 肽的合适的类似物还可以选自 GLP-1(7-37)、 GLP-1(7-36)NH2、。

15、(Gly8) GLP-1(7-37)、 (Gly8)GLP-1(7-36)、 (Ser34)GLP-l(7-37)、 (Val8)GLP-l(7-37)、 (Val8,Glu22) GLP-1(7-37)、 (N-(-Glu(N- 十六酰基 )-Lys26Arg34-GLP-l(7-37)(Liraglutide) 和 D-Ala8Lys37-(2-(2-(2- 马来酰亚胺基丙酰氨基 ( 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙酰胺 ) GLP-1(7-37)(CJC-1131)。 0026 GLP-1 肽的又一类似物可以是选自以下的 exendin 类似物： exendin。

16、-3、具有根据 SEQ ID No.2 ： 0027 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro- Pro-Pro-Ser-NH2的氨基酸序列的 exendin-4( 依泽那太 ) 0028 exendin-4 酸、 exendin-4(1-30)、 exendin-4(1-30) 酰胺、 exendin-4(1-28)、 exendin-4(1-2。

17、8) 酰胺、 14Leu,25Phe exendin-4 酰胺和14Leu,25Pheexendin-4(1-28) 酰胺以及 AVE-0010，其为具有根据 SEQ ID No.3 的氨基酸序列的 exendin 类似物： 0029 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A la-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pr o-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-N。

18、H2。 0030 附图 0031 图 1a ： (Aib8,35)GLP-l(7-36)NH2的第二步层析的 RP-HPLC 层析图； 20mM 乙酸铵， pH=9.2 ； Kromasil C18 100-16 ；乙醇 (100%)。 0032 图 1b ： (Aib8,35)GLP-l(7-36)NH2的第二步层析的 RP-HPLC 层析图； 20mM 乙酸铵， pH=9.5 ； Kromasil C18 100-16 ；乙腈 (100%)。说明书 CN 103080128 A 4 3/7 页 5 0033 与图 1a）相比，用乙腈作为洗脱剂有效地去除了杂质 des-Se。

19、r17， Ser18-Aib8,35 hGLP-l(7-36)NH2。 0034 图 2a ： (Aib8,35)GLP-l(7-36)NH2的第二步层析的 RP-HPLC 层析图； 20mM 乙酸铵， pH=9.5 ； Kromasil C18 100-16 ；乙腈 (100%)。 0035 图 2b ： (Aib8,35)GLP-l(7-36)NH2的第二步层析的 RP-HPLC 层析图； 20mM 乙酸铵， pH=9.5 ； Kromasil C18 100-16 ；乙腈 / 甲基叔丁基醚 (95:5 v:v)。使用甲基叔丁基醚作为有机改性剂可增加纯度和产率。 0036 本发明。

20、的具体实施方案如下概述。 0037 如上概述，用乙腈作为有机溶剂并使用 pH 在 8.0 至 11.0 之间，更特别 pH 在 9.0 至 10.0 之间并且甚至更特别 pH 为 9.5+/-0.2 的碱性缓冲液进行第二个层析步骤。 0038 在本发明的具体实施方案中，将乙腈与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。 0039 合适地应用 99/1(v/v) 至 80/20(v/v)，特别为 97.5/2.5(v/v) 至 90/10(v/v)，甚至更特别为 95/5(v/v) 的乙腈 / 甲基叔丁基醚混合物。 0040 碱性缓冲液可选自本领域技术人员公知的商品化缓冲液。发现乙酸铵或碳酸。

21、氢铵尤其合适。 0041 缓冲液浓度可在 10 至 25mM 范围内变化，由此优选 20mM 的缓冲液浓度。 0042 用乙腈作为有机溶剂和 pH 在 1.0 至 4.0 之间，更特别 pH 在 2.0 至 3.0 之间并且甚至更特别 pH 在 2.3 至 2.5 之间，最特别 pH 为 2.5 的酸性缓冲液进行第一个层析步骤。 0043 酸性缓冲液可选自本领域技术人员公知的商品化缓冲液。发现磷酸铵尤其合适。缓冲液浓度可在 100 至 400mM 范围内变化，由此优选 300mM 的缓冲液浓度。 0044 使用硅胶吸着剂作为固定相方便地进行 RP-HPLC。 0045 合适的硅胶。

22、类型可选自但不限于以下硅胶吸着剂： KromasilTMC1810016、 KromasilTMC18 10010、 KromasilTMC8 10016、 KromasilTMC4 10016、 KromasilTM Phenyl 10010、 KromasilTM C18Eternity 1005、 KromasilTM C4 Eternity 1005、 ChromatorexTM C18SMB 100-15 HE、 ChromatorexTM C8 SMB 100-15 HE、 ChromatorexTMC4 SMB 100-15 HE、 DaisopakTM SP 120-15 O。

23、DS-AP、 DaisopakTM SP120-10-C4-Bio、 DaisopakTM SP 200-10-C4-Bio、 ZeosphereTM C18100-15、 ZeosphereTM C8 100-15、 ZeosphereTM C4 100-15、 SepTech ST150-10 C18、 Luna C18 100-10、 Gemini C18 110-10、 YMC Triart C18120-5 和 YMC Triart C8 200-10。 0046 发现上文列出的 KromasilTM硅胶类型尤其合适。 0047 或者，可使用基于聚合物的固定相进行RP-HPLC。。

24、合适的聚合物相可选自但不限于 PLRP-S 100-10 或 AmberchromTM Profile XT20。 0048 用流动相梯度进行第一个和第二个层析步骤的 RP-HPLC，所述流动相梯度通常开始于较低浓度的有机溶剂并经洗脱时间后结束于较高浓度的有机溶剂。洗脱参数如事件时间、流动相梯度和上样方面可由本领域技术人员更改，以优化纯化过程。 0049 如 PCT 公布 WO 2007/147816 所描述，任选地将含纯化的 (Aib8,35)GLP-1(7-36) NH2的级分浓缩并随后冻干。或者，可通过本领域技术人员公知的沉淀或喷雾干燥技术从 RP-HPLC 级分中分离纯。

25、化的 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2。 0050 以下实施例将更详细地说明本发明的方法而不限制其范围。说明书 CN 103080128 A 5 4/7 页 6 实施例 0051 实施例 A ： 0052 肽的制备 0053 可以根据 WO 2007/147816 和 WO 2009/074483 中描述的方法，通过产生三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备粗肽 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2。 0054 纯化包括在 pH 2.5 的第一步层析纯化，及随后在 pH 9.5 的第二步层析纯化。 0055 实施例 B1 ： 0056 RP-HPLC 技术参数。

26、： 0057 0058 第一个层析步骤： 0059 在水 / 乙腈 / 乙酸 (90/9/1 v/v/v) 中溶解粗 (Aib835)GLP-1(7-36)NH2并装载到 HPLC 柱中（装载高达 20g/L，床深约为 25cm）并开始纯化程序。收集级分并且可用水或稀释的氢氧化铵溶液稀释。 0060 表 1 0061 第一个层析步骤的参数和纯化程序： 0062 0063 说明书 CN 103080128 A 6 5/7 页 7 0064 可改变 A 和 C 的比例以获得主峰（肽 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2）的最小保留。可改变事件时间、梯度和装载方面。

27、以优化纯化过程。通过第二步层析的条件进一步纯化混合级分。 0065 第二个层析步骤： 0066 将来自 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2的第一步层析的混合的稀释级分装载到 HPLC 柱上，并开始表 2 中的纯化程序（见 4.6mm 柱的实例）。 0067 表 2 0068 第二个层析步骤的参数和纯化程序： 0069 0070 说明书 CN 103080128 A 7 6/7 页 8 0071 主要级分中 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2的计算纯度为 97.0%。计算产率为 87%（见图 1b、 2a）。 0072 实施例 B2 ： 0073 除。

28、了在第二个层析步骤中使用碳酸氢铵缓冲液 (20mM(pH 9.5+/-0.2) 之外，重复实施例 B1 的步骤。 0074 主要级分中 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2的计算纯度为 97.2%。计算产率为 93%。 0075 实施例 B3 ： 0076 除了在第二个层析步骤中用乙腈/甲基叔丁基醚95:5的混合物代替乙腈之外，重复实施例 B1 的步骤。 0077 主要级分中 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2的计算纯度为 97.4%。计算产率为 98%（见图 2b）。 0078 实施例 B4 ： 0079 按以下参数重复实施例 B1 的步骤。 0080 说。

29、明书 CN 103080128 A 8 7/7 页 9 0081 0082 主要级分中 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2的计算纯度为 97.1%。计算产率为 99%。 0083 实施例 B5（比较）： 0084 除了在第二个层析步骤中用乙醇代替乙腈之外，重复实施例 B1 的步骤。 0085 主要级分中 (Aib8,35)GLP-1(7-36)NH2的计算纯度为 96.7%。计算产率为 86%。主要级分含杂质 des-Ser17,Ser18-Aib8,35hGLP-l(7-36)NH2（见图 1a）。说明书 CN 103080128 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序列表 CN 103080128 A 10 2/2 页 11 序列表 CN 103080128 A 11 1/2 页 12 图 1a 图 1b 说明书附图 CN 103080128 A 12 2/2 页 13 图 2a 图 2b 说明书附图 CN 103080128 A 13 。

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