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1、(10)申请公布号 CN 103146826 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146826 A *CN103146826A* (21)申请号 201310072035.1 (22)申请日 2013.03.07 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 宋现让 地址 250000 山东省济南市槐荫区济兖路 440 号 (72)发明人 宋现让 (54) 发明名称 一种定量测定血液循环 DNA 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种定量测定血液循环 DNA 的 方法， 取 1ml 同一个肿瘤患者外周静脉血， 置于 EDTA 抗凝管中， 10 -20静置 4 小。
2、时， 2000g 离 心 5 分钟， 取上层血浆 100ul-200ul， 加入相同 体积的缓冲液， 充分混匀， 95静置 5-10 分钟， 16000g离心10分钟， 取上清液为模板直接用于定 量PCR扩增 ； 本发明所产生的有益效果为 ： 1、 通过 特殊的技术工艺处理， 可以直接用血浆或血清进 行定量 PCR 反应， 不影响 PCR 反应， 扩增效率与提 纯 DNA 相比一致， 减少了 DNA 提取步骤和实验误 差。 2、 采用新型的荧光染料SuperGreen， 对PCR扩 增过程中的抑制作用更轻微， 可使用较高浓度， 荧 光信号值高、 反应灵敏度高可精确检测出低至纳 克水平的血浆游离。
3、 DNA。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103146826 A CN 103146826 A *CN103146826A* 1/1 页 2 1. 一种定量测定血液循环 DNA 的方法， 其特征在于， 其步骤如下 ： (1) 取 1ml 同一个肿瘤患者外周静脉血， 置于 EDTA 抗凝管中， 10 -20静置 4 小时， 2000g 离心 5 分钟， 取上层血浆 100ul-200ul， 加入相同体积的缓冲液， 充分混匀， 95。
4、静置 5-10 分钟， 16000g 离心 10 分钟， 取上清液为模板直接用于定量 PCR 扩增 ； (2) 取 10ul 上述处理后的血浆 DNA， 加入 90ul 的 0.5 缓冲液稀释 10 倍， 再取 10ul 稀释后的血浆DNA， 加入90ul的0.5缓冲液再稀释10倍， 依次稀释下去， 制备出不同稀释 倍数的血浆 ； (3) 分别取 2ul 不同稀释倍数的血浆直接进行定量 PCR 扩增， 取 PCR 体系共 20ul， 包括 快速复活热启动 DNA 聚合酶 1ul、 SuperGreen 染料 1ul、 2x 混合物 10ul、 终浓度为 300nM 的 引物 4ul 以及 H2。
5、O4ul ； 95 5 分钟 ； 95 5 秒， 60 20 秒， 72 20 秒， 重复 45 个循环 ； (4) 得出 Cp 值为 23.510.03， 26.870.03， 30.450.12。 2. 根据权利要求 1 所述的定量测定血液循环 DNA 的方法， 其特征在于， 所述 2x 混合物 包括 2x 反应缓冲液、 终浓度为 3mM 的氯化镁、 三磷酸脱氧核苷。 3.根据权利要求1所述的定量测定血液循环DNA的方法， 其特征在于， 所述三磷酸脱氧 核苷包括终浓度均为 0.4mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP 和 dTTP。 4.根据权利要求1所述的定量测定血液循环DNA的方法。
6、， 其特征在于， 所述不同稀释倍 数的血浆的稀释倍数为 1 1、 1 10 或者 1 100。 5.根据权利要求1所述的定量测定血液循环DNA的方法， 其特征在于， 进行定量PCR扩 增使用 ROCHE LightCycler480 定量 PCR 仪。 权 利 要 求 书 CN 103146826 A 2 1/3 页 3 一种定量测定血液循环 DNA 的方法 技术领域 0001 本发明涉及血液循环 DNA 测定技术领域， 具体是一种定量测定血液循环 DNA 的方 法。 背景技术 0002 血液循环 DNA(Circulating DNA， ctDNA)， 又称游离 DNA 或无细胞 DNA(C。
7、ell-free DNA)， 主要来源于细胞的凋亡和死亡。可作为肿瘤、 自身免疫病及胎儿遗传学检测的依据。 目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取 DNA， 然后扩增基因组中某个基因的方式， 计 算 ctDNA 的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、 不同病理状态间 ctDNA 含量及片段完整程 度存在较大差异， 即便不考虑操作者的因素， 所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效 率存在巨大差别。在此基础上的 ctDNA 测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增， 血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰 PCR， 使标本间的扩增效率不一致。 0003 此外， 以 SYBR Green 为染料的定量。
8、 PCR 技术存在荧光染料信号强度低， 灵敏度不 高， 对于低拷贝数的模板不容易检测到。 发明内容 0004 为了克服以上技术缺陷， 本发明提供一种快速准确的定量测定血液循环 DNA 的方 法。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案为， 一种定量测定血液循环 DNA 的方 法， 其步骤如下 ： 0006 1、 取 1ml 同一个肿瘤患者外周静脉血， 置于 EDTA 抗凝管中， 10 -20静置 4 小 时， 2000g离心5分钟， 取上层血浆100ul-200ul， 加入相同体积的缓冲液， 充分混匀， 95静 置 5-10 分钟， 16000g 离心 10 分钟， 取上清液为模板直接。
9、用于定量 PCR 扩增 ； 0007 2、 取10ul上述处理后的血浆DNA， 加入90ul的0.5缓冲液稀释10倍， 再取10ul 稀释后的血浆DNA， 加入90ul的0.5缓冲液再稀释10倍， 依次稀释下去， 制备出不同稀释 倍数的血浆 ； 0008 3、 分别取2ul不同稀释倍数的血浆直接进行定量PCR扩增， 取PCR体系共20ul， 包 括快速复活热启动 DNA 聚合酶 1ul、 SuperGreen 染料 1ul、 2x 混合物 10ul、 终浓度为 300nM 的引物 4ul 以及 H2O4ul ； 95 5 分钟 ； 95 5 秒， 60 20 秒， 72 20 秒， 重复 45。
10、 个循环 ； 0009 4、 得出 Cp 值为 23.510.03， 26.870.03， 30.450.12。 0010 进一步， 所述 2x 混合物包括 2x 反应缓冲液、 终浓度为 3mM 的氯化镁、 三磷酸脱氧 核苷。 0011 进一步， 所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为 0.4mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP 和 dTTP。 0012 进一步， 所述不同稀释倍数的血浆的稀释倍数为 1 1、 1 10 或者 1 100。 0013 进一步， 进行定量 PCR 扩增使用 ROCHE LightCycler480 定量 PCR 仪。 0014 本发明所产生的有益效果为 ： 1、 。
11、通过特殊的技术工艺处理， 可以直接用血浆或血 说 明 书 CN 103146826 A 3 2/3 页 4 清进行定量PCR反应， 不影响PCR反应， 扩增效率与提纯DNA相比一致， 减少了DNA提取步骤 和实验误差。 2、 采用新型的荧光染料SuperGreen， 对PCR扩增过程中的抑制作用更轻微， 可 使用较高浓度， 荧光信号值高、 反应灵敏度高可精确检测出低至纳克水平的血浆游离 DNA。 3、 试剂价钱便宜， 减少了使用 DNA 提取试剂盒的费用等， 操作简便。4、 可用于大规模肿瘤高 危人群筛查、 肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。 附图说明 0015 下面结合附图和具体实施方式进。
12、行详细说明 0016 图 1 为患者 ctDNA 的 PCR 扩增后的荧光信号分析图 0017 图 2 为血浆 ctDNA 含量与荧光强度的相关性曲线图 具体实施方式 0018 下面结合实例， 对本发明进一步说明。 0019 1. 直接用血浆检测 ctDNA 与提纯的 DNA 为模板的扩增效率几乎一致 ； 证明直接用 血浆进行定量 PCR 反应， 不影响 PCR 反应的效率， 同时减少了 DNA 提取步骤和实验误差。 0020 (1) 取 1ml 同一个肿瘤患者外周静脉血， 置于 EDTA 抗凝管中， 10 -20静置 4 小 时， 2000g离心5分钟， 取上层血浆100ul-200ul， 。
13、加入相同体积的缓冲液， 充分混匀， 95静 置 5-10 分钟， 16000g 离心 10 分钟， 取上清液为模板直接用于定量 PCR 扩增 ； 0021 (2) 取 10ul 上述处理后的血浆 DNA， 加入 90ul 的 0.5 缓冲液稀释 10 倍， 再取 10ul 稀释后的血浆 DNA， 加入 90ul 的 0.5 缓冲液再稀释 10 倍， 依次稀释下去， 制备出不 同稀释倍数的血浆 ； 所述不同稀释倍数的血浆的稀释倍数为 1 1、 1 10 或者 1 100。 0022 (3) 分别取 2ul 不同稀释倍数的血浆直接进行定量 PCR 扩增， 进行定量 PCR 扩增 使用 ROCHE 。
14、LightCycler480 定量 PCR 仪， 取 PCR 体系共 20ul， 包括快速复活热启动 DNA 聚 合酶 1ul、 SuperGreen 染料 1ul、 2x 混合物 10ul、 终浓度为 300nM 的引物 4ul 以及 H2O4ul ； 95 5 分钟 ； 95 5 秒， 60 20 秒， 72 20 秒， 重复 45 个循环 ； 0023 所述 2x 混合物包括 2x 反应缓冲液、 终浓度为 3mM 的氯化镁、 三磷酸脱氧核苷。 0024 所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为 0.4mM 的 dATP、 dCTP、 dGTP 和 dTTP。 0025 (4) 得出 Cp 值为 。
15、23.510.03， 26.870.03， 30.450.12。 0026 如图 1 和图 2 所示为 DNA 含量与荧光强度呈明显线性关系， 计算扩增效率为 1.948， 线性关系 R2 99.97 ； 与提纯的 DNA 为模板的扩增效率几乎一致 ； 证明直接用血 浆进行定量 PCR 反应， 不影响 PCR 反应的效率， 同时减少了 DNA 提取步骤和实验误差。 0027 2、 与传统 DNA 提取后扩增法比较 0028 将 5 个患者血浆 (2ml) 均先分为 A、 B 两份， 然后在 A 份中加入已知量的人基因组 DNA( 来源于 WBC)， 终浓度为 100ng/ml， 然后将血浆再一。
16、分为二 (A1、 A2 和 B1、 B2)， 标为 A1/ B1 的样本 Omega 公司的游离 DNA 提取试剂盒提取血浆 ctDNA， 标为 A2/B2 的样本采用本技 术处理， 然后进行定量 PCR 测定， 血浆 ctDNA 含量均换算为 ng/ml， A1-B1 为经 DNA 提取的 外源 DNA 测定值， A2-B2 为本技术直接测定的外源 DNA 含量。结果 ： 使用试剂盒提取的血浆 DNA 通过 PCR 定量检测后， 外源 DNA 的掺入量为 48.810.2ng/ml ； 本方法测定的外源 DNA 掺入量为 103.23.6ng/ml。传统 DNA 提取后测定法 CV 值为 20.9， 测定值为实际掺入量 说 明 书 CN 103146826 A 4 3/3 页 5 的 48.8。本方法测定 CV 值为 3.5， 测定值基本和掺入量一致。表明本技术不仅操作方 便， 节省费用， 而且可以显著提高检测的精密度和准确度。 说 明 书 CN 103146826 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146826 A 6 。